本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及骨向分化方法。

背景技術(shù)：

牙周疾病不僅是引起成年人失牙的主要原因，還是危害人類口腔乃至全身健康的主要口腔疾病。牙周病是牙周組織的慢性炎癥刺激下的感染性疾病，是牙菌斑中的微生物在相應(yīng)的微環(huán)境下引起的炎癥，它損壞牙周組織，尤其是牙槽骨的破壞和牙周組織的喪失，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)脫落以及牙槽骨的吸收。而牙周治療的目標(biāo)就是要治療牙周炎癥，改善微環(huán)境重新再生出新的結(jié)締組織附著和支持組織，完成牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜的構(gòu)建。常用的牙周再生方法，如引導(dǎo)組織再生術(shù)、根面平整術(shù)等，此類方法簡單易行，但并不能完全實(shí)現(xiàn)功能性和結(jié)構(gòu)性牙周組織再生，具有一定的局限性。牙周組織工程技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展為牙周再生提供了嶄新的思路和方法。

牙齦屬于牙周組織，是附于牙齒周圍的分隔下方牙周組織和外部空間的粘膜屏障。牙齦包括上皮和固有層兩部分，從發(fā)育來源上，上皮來自原始口腔上皮，與口腔粘膜上皮相延續(xù)；固有層則發(fā)育自早期神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移形成的間充質(zhì)，上皮與間充質(zhì)不斷相互作用，最終形成牙齦組織。牙齦組織的一個(gè)典型特點(diǎn)是具有較強(qiáng)的創(chuàng)傷愈合能力，表現(xiàn)為切除、損傷后能夠無疤愈合，恢復(fù)牙齦外形。

牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)是組成牙齦結(jié)締組織的主要間充質(zhì)細(xì)胞，來源于中胚層的纖維母細(xì)胞，不僅具有活躍的自我更新的能力，并且還具有合成和降解膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的功能：I型和Ⅲ型膠原、纖維粘連蛋白等。牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便、牙齦組織中細(xì)胞含量大、增值速度快，作為成體間充質(zhì)干細(xì)胞中的一員，在體外使用合適的誘導(dǎo)劑同樣具有分化為牙骨質(zhì)的能力。牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞這種功能特性極大地吸引了來自基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究者，給基礎(chǔ)科學(xué)的研究者們提供了一種研究發(fā)展生物學(xué)的模式，牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞所具有的修復(fù)、替代和再生能力也為臨床醫(yī)學(xué)提供了一個(gè)發(fā)展新療法的機(jī)會。雖然有研究采用包括脂肪、骨髓在內(nèi)的多種組織來源的成體干細(xì)胞進(jìn)行牙周再生，但取材的有創(chuàng)性和倫理性等問題仍然制約了其發(fā)展。因此，GMSCs有望成為牙周組織再生的種子細(xì)胞。

目前，對于GMSCs成骨分化誘導(dǎo)的研究主要集中于不同細(xì)胞因子對其生物學(xué)行為產(chǎn)生的不同影響，但是往往局限于單一細(xì)胞因子對其作用的研究。由于生物體是一個(gè)復(fù)雜的存在多誘導(dǎo)因素的有機(jī)體，因此在牙周組織復(fù)雜的微環(huán)境中，多種誘導(dǎo)因子在牙周再生的過程中可能會起到相互協(xié)同或拮抗的作用。因此，提供一種具有協(xié)同作用的誘導(dǎo)因子組合物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及骨向分化方法。該成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、骨形成蛋白-2(BMP-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等誘導(dǎo)因子，多種誘導(dǎo)因子聯(lián)合應(yīng)用作用于GMSCs等間充質(zhì)干細(xì)胞，能有效的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化，其成骨分化效果顯著優(yōu)于現(xiàn)有常規(guī)的誘導(dǎo)方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、骨形成蛋白-2、血管內(nèi)皮生長因子和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

目前，現(xiàn)有的常規(guī)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括維生素C、地塞米松和β-甘油磷酸鈉，本發(fā)明提供的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基在常規(guī)誘導(dǎo)因子組合的基礎(chǔ)上，添加骨形成蛋白-2和血管內(nèi)皮生長因子，多種誘導(dǎo)因子聯(lián)合應(yīng)用作用于GMSCs等間充質(zhì)干細(xì)胞，更加高效的誘導(dǎo)GMSCs等間充質(zhì)干細(xì)胞的骨向分化。

作為優(yōu)選，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中各組分的用量為：

維生素C：10～100μg/L；

地塞米松：(1～10)×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸鈉：1～20mol/L；

骨形成蛋白-2：50～150μg/L；

血管內(nèi)皮生長因子：10～30μg/L；

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：補(bǔ)足。

優(yōu)選地，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中各組分的用量為：

維生素C：50μg/L；

地塞米松：1×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸鈉：10mol/L；

骨形成蛋白-2：50～150μg/L；

血管內(nèi)皮生長因子：10～30μg/L；

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：補(bǔ)足。

更優(yōu)選地，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中各組分的用量為：

維生素C：50μg/L；

地塞米松：1×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸鈉：10mol/L；

骨形成蛋白-2：100μg/L；

血管內(nèi)皮生長因子：20μg/L；

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：補(bǔ)足。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含有10％體積分?jǐn)?shù)FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基。

本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化的方法，采用本發(fā)明成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，間充質(zhì)干細(xì)胞為牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞。

作為優(yōu)選，間充質(zhì)干細(xì)胞為第2～5代間充質(zhì)干細(xì)胞。

優(yōu)選地，間充質(zhì)干細(xì)胞為第3代間充質(zhì)干細(xì)胞。

作為優(yōu)選，間充質(zhì)干細(xì)胞的接種密度為(1～10)×10⁴cell/mL。

優(yōu)選地，間充質(zhì)干細(xì)胞的接種密度為1×10⁴cell/mL。

作為優(yōu)選，間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為37℃。

作為優(yōu)選，間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間不低于14天。

優(yōu)選地，間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間不低于21天。

更優(yōu)選地，間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間不低于28天。

本發(fā)明提供了一種成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及骨向分化方法。該成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、骨形成蛋白-2、血管內(nèi)皮生長因子和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢之一：

1)本發(fā)明提供一種由多種誘導(dǎo)因子聯(lián)合應(yīng)用作用于GMSCs等間充質(zhì)干細(xì)胞，具有協(xié)同作用，能有效的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化，其成骨分化效果顯著優(yōu)于現(xiàn)有常規(guī)的誘導(dǎo)方法。

2)GMSCs自體取材方便、易于體外擴(kuò)增，可以用于自體移植，從而避免了免疫排斥反應(yīng)。

附圖說明

圖1示GMSCs形態(tài)圖；其中，1-1示GMSCs放大40倍圖片，1-2示GMSCs放大100倍圖片；

圖2示GMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物流式檢測結(jié)果圖；其中，2-1～2-6分別示CD146、HLA-DR、CD105、CD34、CD90、CD45的陽性表達(dá)率；

圖3示對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞茜素紅染色效果圖；其中，3-1～3-2分別示對照組1中細(xì)胞誘導(dǎo)28天后放大40倍、100倍的圖片；

3-3～3-4分別示對照組2中細(xì)胞誘導(dǎo)28天后放大40倍、100倍的圖片；

3-5～3-6分別示對照組3中細(xì)胞誘導(dǎo)28天后放大40倍、100倍的圖片；

3-7～3-8分別示對照組4中細(xì)胞誘導(dǎo)28天后放大40倍、100倍的圖片；

3-9～3-10分別示實(shí)驗(yàn)組1中細(xì)胞誘導(dǎo)28天放大40倍、100倍的圖片；

3-11～3-12分別示實(shí)驗(yàn)組2中細(xì)胞誘導(dǎo)28天放大40倍、100倍的圖片；

3-13～3-14分別示實(shí)驗(yàn)組3中細(xì)胞誘導(dǎo)28天放大40倍、100倍的圖片；

圖4示對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞礦化面積比較(p<0.01)；

圖5示不同時(shí)間點(diǎn)對照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞堿性磷酸酶活性比較；

圖6示對照組和實(shí)驗(yàn)組的OCN、Col-I、Runx2表達(dá)水平比較。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及骨向分化方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明提供的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及骨向分化方法中所用生物材料、試劑和儀器均可由市場購得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1 GMSCs原代分離培養(yǎng)、傳代及鑒定

1、GMSCs原代分離培養(yǎng)

1)原材料來源：取臨床上正畸導(dǎo)萌術(shù)切下的牙齦或阻生拔牙需要而切除包繞在恒牙周圍的牙齦組織。要求患者沒有牙齦增生、炎癥及使用過導(dǎo)致牙齦增生的藥物。切取的牙齦組織快速浸入含3倍雙抗的4℃預(yù)冷的PBS中。

其中，3倍雙抗?jié)舛葹?00μ/mL青霉素、300μ/mL鏈霉素。

2)漂洗：用含3倍雙抗的PBS沖洗3次，再將牙齦置于間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中浸泡5min；

其中，3倍雙抗?jié)舛葹?00μ/mL青霉素、300μ/mL鏈霉素。

其中，間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中含有100μ/mL青霉素、100μ/mL鏈霉素。

3)第一次消化：將牙齦組織剪成1cm³大小，加入適量Ⅰ型膠原酶-Dispase酶混合消化液，置37℃，200R恒溫?fù)u床中消化45min。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量PBS重懸，100μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾懸液，過濾后的細(xì)胞懸液1000r/min離心5min，棄上清。

其中，Ⅰ型膠原酶-Dispase酶的比例為1:1，膠原酶濃度為膠原酶3g/L，Dispase酶濃度為Dispase酶4g/L；

消化環(huán)境為37℃，200R恒溫?fù)u床中，消化時(shí)間為45min；

所用細(xì)胞濾網(wǎng)孔徑為100μm；

離心速度為1000r/min，離心時(shí)間為5min。

4)第二次消化：把步驟3)中過濾下下來未消化的組織加入等體積的0.125％的胰蛋白酶，置37℃，200R恒溫?fù)u床中繼續(xù)消化15min。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量PBS重懸，70μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾懸液，過濾后的細(xì)胞懸液1000r/min離心5min，棄上清。

其中，胰蛋白酶與牙齦組織的比例為體積比1:1，胰蛋白酶的濃度為0.125％；

其中，所用細(xì)胞濾網(wǎng)孔徑為70μm；

其中，離心速度為1000r/min，離心時(shí)間為5min。

5)接種：步驟3)與步驟4)中收集的細(xì)胞用含10ng/mL EGF(表皮生長因子)的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于六孔板，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。

其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，可市場購買或自制。

其中，完全培養(yǎng)基中EGF(表皮生長因子)的濃度為10ng/mL；

6)純化：待細(xì)胞長滿80-90％，收集細(xì)胞，用磁珠分選法純化細(xì)胞。將收集的細(xì)胞與STRO-1單抗4℃孵育1h，與磁珠30min 4℃孵育，在磁力設(shè)備作用下篩選出STRO-1⁺GMSCs，接種于新的六孔板中，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。

2、GMSCs傳代

待細(xì)胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2-3mL 0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時(shí)，立即加入5-10mL間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入5-10mL含10ng/mL EGF的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按5×10⁴cell/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。細(xì)胞接種約4h后開始貼壁，3-4d進(jìn)入對數(shù)生長期，6-8d進(jìn)入平臺期。細(xì)胞生長速度平穩(wěn)，呈單層貼壁生長。大部分細(xì)胞呈長梭形，形態(tài)不規(guī)則。

3、GMSCs表面標(biāo)志物鑒定

待細(xì)胞長滿80-90％，收集細(xì)胞(約1×10⁶個(gè))，加入3g/L Triton浸泡20min，PBS洗3遍，10％山羊血清室溫封閉2h，分別滴加1:200稀釋的CD146、CD105、CD90、CD34、CD45、HLA-DR抗體各50μL，同時(shí)對照組滴加單純PBS 50μL，4℃處理16h。次日室溫放置30min，PBS漂洗3遍，各組分別滴加1:500稀釋的FITC標(biāo)記二抗IgG，常溫避光孵育1h，PBS漂洗2遍，10％福爾馬林固定細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定抗原的陽性率。試驗(yàn)結(jié)果見表1、圖2。

檢測結(jié)果顯示，克隆細(xì)胞表面抗原CD146、CD105、CD90陽性表達(dá)，而CD34、CD45、HLA-DR陰性表達(dá)，說明本發(fā)明中得到的GMSCs屬來源于中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞。

表1 GMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)率結(jié)果

實(shí)施例2 GMSCs成骨分化

為了驗(yàn)證本發(fā)明成骨分化誘導(dǎo)的效果，同時(shí)設(shè)置4組對照組和3組實(shí)驗(yàn)組，對實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行茜素紅染色、堿性磷酸酶活性測定及成骨基因OCN、Col-I的檢測。

對照組1：為陰性對照組，為常規(guī)培養(yǎng)組，使用的培養(yǎng)液為：含體積分?jǐn)?shù)10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液。

對照組2：為陽性對照組，為常規(guī)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)配方，使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/L β-甘油磷酸鈉，體積分?jǐn)?shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

對照組3：為陽性對照組，使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/L β-甘油磷酸鈉，100μg/L BMP-2，體積分?jǐn)?shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

對照組4：為陽性對照組，使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/L β-甘油磷酸鈉，20μg/L VEGF，體積分?jǐn)?shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)組1中使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/L β-甘油磷酸鈉，50μg/L BMP-2，10μg/L VEGF，體積分?jǐn)?shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)組2中使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/L β-甘油磷酸鈉，100μg/L BMP-2，20μg/L VEGF，體積分?jǐn)?shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)組3中使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/L β-甘油磷酸鈉，150μg/L BMP-2，30μg/L VEGF，體積分?jǐn)?shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

各組培養(yǎng)液的配方如表2：

表2各組培養(yǎng)液的配方

試驗(yàn)方法及結(jié)果：

(一)茜素紅染色

取實(shí)施例1制備的第3代GMSCs，按1×10⁴cell/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到60％～70％融合以上時(shí)，各組分別更換表2所示成骨誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)28d對細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色。茜素紅染色的具體方法為：

棄培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2到3次；加入4％多聚甲醛固定10-15min；吸棄多聚甲醛，PBS清洗3次；加入2％茜素紅，37℃孵育30min。孵育結(jié)束后吸棄殘液，用37℃預(yù)熱的去離子水清洗2到3次，每次20s；晾干后在倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。各組細(xì)胞染色效果如圖3。

使用圖像分析軟件Image-Pro-Plus 5.0(Media Cybernetics,美國)對各組3個(gè)復(fù)孔中的細(xì)胞進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)面積計(jì)算。礦化結(jié)節(jié)面積如表3和圖4所示。

表3礦化面積計(jì)算結(jié)果

注：*，**表示P﹤0.01。

由表3和圖3、圖4可知，對照組1不含誘導(dǎo)因子，不對細(xì)胞進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，因此，沒有著色，礦化面積為零。對照組3、4與對照組2無顯著性差異，說明在常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加單一的BMP-2或VEGF均沒有明顯提高GMSCs成骨分化能力；各實(shí)驗(yàn)組與各對照組之間均有極顯著性差異(*，p﹤0.01)，說明在常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上同時(shí)添加BMP-2和VEGF兩種因子能夠有效提高GMSCs成骨分化能力；實(shí)驗(yàn)組2與實(shí)驗(yàn)組1、3有極顯著性差異(**，p﹤0.01)，說明BMP-2和VEGF兩者聯(lián)合作用下，合理的濃度搭配比過高或過低濃度搭配更能有效的提高GMSCs成骨分化能力；實(shí)驗(yàn)組2中的礦化面積均值為82.63±1.48％，是對照組2礦化面積的1.96倍，說明本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組2所示的成骨分化誘導(dǎo)液進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)的效果最好。

(二)堿性磷酸酶活性(ALP)測定

對各組GMSCs分別于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)0d、14d、21d和28d對細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶活性定量測定。具體測定方法為：

棄原培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加200μL 0.2％TritonX-100，37℃孵育1h，鏡下可見細(xì)胞裂解完全，吸出裂解液至新離心管，離心后取上清，留作備用。

對上述裂解液進(jìn)行蛋白含量測定，于96孔板中進(jìn)行。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書要求設(shè)置測定孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和空白孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔液體20μL，37℃孵育30min后檢測562nmOD值，空白孔調(diào)零。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔OD值繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入各孔OD值，算出各組的蛋白濃度。

對上述裂解液進(jìn)行堿性磷酸酶活性測定，于96孔板中進(jìn)行。按堿性磷酸酶測定試劑盒說明書要求設(shè)置測定孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和空白孔，37℃孵育15min，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加150μL顯色液，輕輕震蕩孔板混勻。檢測520nmOD值，空白孔調(diào)零。根據(jù)以下公式計(jì)算堿性磷酸酶活性：

堿性磷酸酶活性(U/gprot)＝(測定孔吸光度-空白孔吸光度)÷(標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度-空白孔吸光度)×酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷待測樣本蛋白濃度(gprot/mL)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4和圖5所示。

表4不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞堿性磷酸酶活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)14d、21d、28d后，在同一時(shí)間內(nèi)，各誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組(對照組1)堿性磷酸酶的活性均有極顯著性差異(7.44±0.06，p﹤0.01)，實(shí)驗(yàn)組1、3與各對照組有極顯著性差異(^※，p﹤0.01)，實(shí)驗(yàn)組2與實(shí)驗(yàn)組1、3有極顯著性差異(^※※，p﹤0.01)，實(shí)驗(yàn)組2與其他各組均有極顯著性差異(**，p﹤0.01)。堿性磷酸酶活性隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間增加而升高，但未誘導(dǎo)組(對照組1)上升不明顯，實(shí)驗(yàn)組2顯著升高。

(三)成骨基因OCN、Col-I的檢測

各組GMSCs分別于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)28d后，RT-PCR法檢測成骨細(xì)胞標(biāo)志性基因OCN、Col-I、Runx2的表達(dá)。按TRIzol試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。按SYBR Green定量PCR試劑盒說明書對成骨細(xì)胞標(biāo)志性基因OCN、Col-I、Runx2表達(dá)水平進(jìn)行檢測。β-actin作為內(nèi)參基因。2-△△Ct法定量分析。

表5引物序列表

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，細(xì)胞培養(yǎng)28d后，各誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組(對照組1)比較，成骨細(xì)胞標(biāo)志性基因OCN、Col-I表達(dá)水平均有極顯著性差異(*，p﹤0.01)，實(shí)驗(yàn)組1、3與各對照組比較，均有極顯著性差異(※，p﹤0.01)，實(shí)驗(yàn)組2與其他各誘導(dǎo)組均有極顯著性差異(**，p﹤0.01)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。