本發(fā)明涉及醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域,具體涉及一種具有抗腫瘤活性的高烏甲素氮雜肉桂酸雜合體及其合成方法。

背景技術(shù)：

腫瘤已嚴(yán)重威脅到人類的健康,尋找有效安全、毒副作用小的抗腫瘤藥物一直是腫瘤藥物研發(fā)工作者孜孜以求的目標(biāo)。隨著藥物化學(xué)的發(fā)展,尋找高效低毒的天然抗腫瘤化合物或進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造合成其衍生物成為當(dāng)前抗腫瘤藥物研究中的一個(gè)重要趨勢(shì)。

高烏甲素[(1α,14α,16β)-20-乙基-1,14,16-三甲氧烏頭烷-4,8,9-三醇4-[2-(乙酰氨基)]苯甲酸酯]是從毛茛科植物高烏頭(Aconitumsinomotanum Nakai)的根中提取的一種生物堿(中國(guó)科學(xué)院植物研究所,中國(guó)高等植物圖鑒(第一冊(cè))[M].北京：科學(xué)出版社,1992,688)。其結(jié)構(gòu)見(jiàn)下式。藥理實(shí)驗(yàn)證明具有較強(qiáng)的中樞鎮(zhèn)痛作用及解熱、消腫和局部麻醉等作用。毒性實(shí)驗(yàn)表明,本品對(duì)各種組織均無(wú)損害,無(wú)致畸作用。

肉桂酸是一種天然的芳香脂肪酸,廣泛存在于蜂膠、咖啡、水果和酒中。肉桂酸有廣泛的藥理性質(zhì),如抗癌、抗氧化、和抗菌。最近的研究表明,肉桂酸具有潛在抗腫瘤活性,如黑色素瘤、惡性膠質(zhì)瘤、胃細(xì)胞腺癌、前列腺癌和肺癌細(xì)胞,它能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞骨架的破壞。此外,肉桂酸具有α,β-不飽和酮羰基,在新藥的設(shè)計(jì)中發(fā)揮重要作用,特別是抗腫瘤藥物,抗病毒藥物等。

近年來(lái),含氮雜環(huán)化合物及其衍生物尤其較好的活性已在醫(yī)藥、農(nóng)藥、燃料等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,受到越來(lái)越多的關(guān)注。在藥品的開(kāi)發(fā)過(guò)程中,含氮雜環(huán)化合物的應(yīng)用尤為廣泛,從具有劃時(shí)代意義的青霉素到現(xiàn)在的第四代頭孢菌素,抗高血壓藥利血平,具有抗腫瘤活性的嘧啶拮抗物,巴比妥類鎮(zhèn)靜催眠藥物,合成類鎮(zhèn)痛藥物等各方面,含氮雜環(huán)化合物及其衍生物都擔(dān)當(dāng)著重要的角色。并且,對(duì)于抗腫瘤活性的高烏甲素衍生物,藥物化學(xué)家和生物學(xué)家進(jìn)行了大量的研究,合成篩選出各種不同基團(tuán)修飾的有抗腫瘤活性的高烏甲素衍生物,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)有效低毒的抗腫瘤藥物打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

因此,發(fā)明者決定在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上,以高烏甲素、氮雜肉桂酸及其衍生物為原料,設(shè)計(jì)合成一種結(jié)構(gòu)新穎的高烏甲素氮雜肉桂酸酯類化合物,并在細(xì)胞水平上進(jìn)行抗腫瘤活性研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的是提供一種具有抗腫瘤活性的高烏甲素氮雜肉桂酸雜合體及其合成方法，具有原料環(huán)保,生產(chǎn)成本低,操作安全性高,反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)反應(yīng)原料的充分利用,適用于工業(yè)化生產(chǎn)。對(duì)探究該類化合物的生物活性與總結(jié)構(gòu)效關(guān)系具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:

一種具抗腫瘤活性的高烏甲素氮雜肉桂酸雜合體,其特征在于，該化合物結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)如下：

其中，X選自C、N，R1、R2、R3選自氫,低級(jí)烷烴。

一種具抗腫瘤活性的高烏甲素氮雜肉桂酸雜合體的合成方法，以高烏甲素、氮雜肉桂酸及其衍生物為原料,在DMF作為反應(yīng)溶劑的條件下進(jìn)行合成，合成路線如下：

其中,R1、R2、R3與通式(I)中的限定相同；

詳細(xì)步驟如下：

1)向反應(yīng)器中加入高烏甲素和2％的鹽酸，摩爾比為1:5,以乙醇為溶劑,置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。薄層色譜追蹤反應(yīng)進(jìn)度,反應(yīng)完全后,減壓蒸出溶劑；

2)向步驟(1)中，按投料比為1:1～1:2加入氮雜肉桂酸或其衍生物,加DMF混合均勻,加入催化量的DCC,加熱到50℃～90℃,在攪拌條件下回流反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中使用薄層色譜追蹤,及時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行程度；

3)反應(yīng)結(jié)束加入水淬滅反應(yīng)DCM萃??；

4)將上述反應(yīng)體系的混合物經(jīng)減壓濃縮后,過(guò)濾,柱層析分離提純,干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物。

所述的步驟1)中的催化劑為2％的鹽酸。

所述的步驟2)中的投料比，高烏甲素：肉桂酰氯或其衍生物的摩爾比范圍為1:1.2～1:1.5。

所述的步驟2)中的溶劑為DMF。

所述的步驟2)所中的溫度為60℃～80℃。

所述的一種具抗腫瘤活性的高烏甲素氮雜肉桂酸雜合體應(yīng)用于治療人前列腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌。

結(jié)構(gòu)式(I)部分優(yōu)選實(shí)施方案中的化合物結(jié)構(gòu)式如下所示：

本發(fā)明的有益效果是：

采用“一鍋煮”的方法制備高烏甲素氮雜肉桂酸雜合體,減少了實(shí)驗(yàn)步驟,操作簡(jiǎn)單,轉(zhuǎn)化率高。原料環(huán)保,生產(chǎn)成本低,操作安全性高,反應(yīng)條件溫和,可實(shí)現(xiàn)反應(yīng)原料的充分利用,適用于工業(yè)化生產(chǎn)。對(duì)探究該類化合物的生物活性與總結(jié)構(gòu)效關(guān)系具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步敘述，但本發(fā)明不局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

高烏甲素與4-氮雜肉桂酸

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入4-氮雜肉桂酸17.20mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng),DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純,干燥得到白色結(jié)晶粉末(29.64mg),總收率54.69％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末,M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.54(2H,d),7.30-8.30(4H,m),7.47(2H,d),7.35(1H,s),7.19(1H,s),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,1 67.1,149.6,144.5,141.4,140.3,133.2,130.1,125.4,124.2,123.0,119.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.0,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C₃₈H₄₇N3O8[M+H]+,673.3367；found,673.7965.

實(shí)施例2

高烏甲素與3-氮雜肉桂酸

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-氮雜肉桂酸17.20mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng),DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純,干燥得到白色結(jié)晶粉末(30.04mg),總收率55.42％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.84(2H,s),8.33(1H,d),7.30-8.30(4H,m),7.98(1H,d),7.71(1H,s),7.55(1H,t),6.89(1H,s),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,149.5,148.1,140.3,136.6,133.2,132.5,130.1,129.6,124.8,124.2,123.8,119.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.0,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C38H47N3O8[M+H]+,673.3367；found,673.7965.

實(shí)施例3

高烏甲素與2-氮雜肉桂酸

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入2-氮雜肉桂酸17.20mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng),DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純,干燥得到白色結(jié)晶粉末(28.96mg),總收率53.43％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.45(1H,d),7.30-8.30(4H,m),7.76(1H,s),7.50(1H,s),7.43(1H,d),7.41(1H,t),7.29(1H,t),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,154.7,148.8,140.3,138.2,137.0,133.2,130.1,124.5,124.3,124.2,122.7,119.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.0,13.6；HRMS(ESI)calcd.fo rC38H47N3O8[M+H]+,673.3367；found,673.7965.

實(shí)施例4

高烏甲素與3-(3-吡啶基)-3-甲基丙烯酸

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(3-吡啶基)-3-甲基丙烯酸18.64mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng),DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純,干燥得到白色結(jié)晶粉末(27.96mg),總收率47.53％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.47(1H,s),8.33(1H,d),7.30-8.30(4H,m),7.70(1H,d),7.29(1H,t),6.56(1H,s),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.50(2H,s)，2.42(3H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m,),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.8(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:167.1,166.0,154.2,153.0,149.5,140.3,133.9,133.2,130.1,124.2,123.8,121.8,119.2,118.4,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4, 24.0,13.6,13.0；HRMS(ESI)calcd.for C39H49N3O8[M+H]+,687.3497；found,687.8164.

實(shí)施例5

高烏甲素與3-(5-甲基-3-吡啶基)丙烯酸

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢琛LC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(5-甲基-3-吡啶基)丙烯酸18.64mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng),DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純,干燥得到白色結(jié)晶粉末(27.54mg),總收率46.82％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.82(1H,s),7.30-8.30(4H,m),8.29(1H,s),7.73(1H,s),7.71(1H,s),6.89(1H,s),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.31(3H,s),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,166.0,151.2,150.0,140.3,16.6,133.9,132.9,130.1,129.0,124.8,124.2,119.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.0,18.4,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C39H49N3O8[M+H]+,687.3497；found,687.8164.

實(shí)施例6

高烏甲素與3-(6-甲基-3-吡啶基)丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢琛LC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(6-甲基-3-吡啶基)丙烯醛18.64mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng),DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純,干燥得到白色結(jié)晶粉末(23.93mg),總收率40.68％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.48(1H,s),7.30-8.30(4H,m),7.99(1H,d),7.71(1H,s),6.97(1H,d),6.89(1H,s),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.50(5H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,150.0,145.8,143.9,140.3,137.8,133.1,130.1,126.7,124.8,124.2,119.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.0,19.2,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C39H49N3O8[M+H]+,687.3497；found,687.8164.

實(shí)施例7

高烏甲素與3-(4-甲基-3-吡啶基)丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(4-甲基-3-吡啶基)丙烯醛18.64mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng),DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純,干燥得到白色結(jié)晶粉末(22.68mg),總收率38.56％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.32(1H,s),7.30-8.30(4H,m),7.71(1H,s),7.64(1H,d),7.13(1H,d),6.89(1H,s),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.53(3H,s),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,160.8,149.6,140.3,136.6,133.2,132.9,130.1,128.6,124.8,124.2,119.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.0,23.9,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C39H49N3O8[M+H]+,687.3497；found,687.8164.

實(shí)施例8

3-(5-乙基-3-吡啶基)丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(5-乙基-3-吡啶基)丙烯醛20.08mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純,干燥得到白色結(jié)晶粉末(25.13mg)，總收率41.87％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.82(1H,s),8.29(1H,s),7.30-8.30(4H,m),7.73(1H,s),7.71(1H,s),6.89(1H,s),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.73(2H,q)，2.54(2H,d),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s)，1.45(2H,q),1.25(3H,t),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,150.8,149.5,140.3,139.4,136.6,133.4,130.1,129.4,124.8,124.2,119.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,26.3,24.0,14.5,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C40H51N3O8[M+H]+,701.8482；found,701.3676.

實(shí)施例9

高烏甲素與3-(4-吡啶基)-3-甲基丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(4-吡啶基)-3-甲基丙烯醛18.64mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng),DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純,干燥得到白色結(jié)晶粉末(23.14mg),總收率39.34％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.54(2H,d),7.30-8.30(4H,m),7.47(2H,d),7.35(1H,s),7.19(1H,s),6.86(1H,s),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:167.1,166.3,153.9,149.6,144.3,140.3,133.2,130.1,125.4,124.2,123.0,119.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.0,13.6,13.0；HRMS(ESI)calcd.for C39H49N3O8[M+H]+,687.3497；found,687.8164.

實(shí)施例10

高烏甲素與3-(4-吡啶基)-2-甲基丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(4-吡啶基)-2-甲基丙烯醛18.64mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純，干燥得到白色結(jié)晶粉末(25.78mg)，總收率43.83％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.61(2H,d), 7.30-8.30(4H,m),7.40(2H,d),7.35(1H,s),7.24(1H,s),6.86(1H,s),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.53(3H,s),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.52(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:167.1,166.3,153.9,149.6,144.5,140.3,137.9,133.2,130.1,127.5,124.2,123.0,119.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.0,13.613.0；HRMS(ESI)calcd.for C₃₉H₄₉N₃O₈[M+H]⁺,687.3497；found,687.8164.

實(shí)施例11

3-(3-甲基-4-吡啶基)-丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(3-甲基-4-吡啶基)-丙烯醛18.64mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純，干燥得到白色結(jié)晶粉末(22.51mg)，總收率38.27％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.54(2H,d),7.30-8.30(4H,m),7.47(2H,d),7.35(1H,s),7.24(1H,s),6.86(1H,s),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.50(2H,s),2.43(3H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.5(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,161.4,148.9,142.2,141.4,140.3,133.2,130.1,125.4,124.2,119.2,118.9115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.0,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C₃₉H₄₉N₃O₈[M+H]⁺,687.3497；found,687.8164.

實(shí)施例12

高烏甲素與3-(3-乙基-4-吡啶基)-丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(3-乙基-4-吡啶基)-丙烯醛20.08mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純，干燥得到白色結(jié)晶粉末(26.11mg)，總收率43.50％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.54(2H,d),7.30-8.30(4H,m),7.47(2H,d),7.35(1H,s),7.24(1H,s),6.86(1H,s),3.65(2H,s),3.40(2H,q),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.50(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.25(3H,t),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,160.1,148.6,142.2,141.4,140.3,133.2,130.1,125.4,124.2,119.2,118.9,117.5,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,30.9,26.9,26.4,24.0,13.6,13.0；HRMS(ESI)calcd.for C₄₀H₅₁N₃O₈[M+H]⁺,701.8482；found,701.3676.

實(shí)施例13

高烏甲素與3-(3,5-二甲基-4-吡啶基)-丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(3,5-二甲基-4-吡啶基)-丙烯醛20.08mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純，干燥得到白色結(jié)晶粉末(34.09mg)，總收率56.79％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),7.30-8.30(4H,m),7.35(1H,s),7.24(2H,s),7.19(1H,s),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.53(6H,t),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,157.9,142.4,141.4,140.3,133.2,130.1,125.4,124.2,119.2,115.7,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.0,20.4,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C40H51N3O8[M+H]+,701.3676；found,701.8482.

實(shí)施例14

高烏甲素與3-(5-甲基-2-吡啶基)-丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(5-甲基-2-吡啶基)-丙烯醛18.64mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純，干燥得到白色結(jié)晶粉末(35.22mg)，總收率59.87％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.46(1H,d),7.30-8.30(4H,m),7.76(1H,s),7.50(1H,s),7.39(1H,s),7.34(1H,d),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(4H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,155.2,148.3,147.0,140.3,138.2,133.2,130.1,127.1,124.5,124.2,119.2,115.7,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.0,21.7,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C39H49N3O8[M+H]+,687.3520；found,687.8217.

實(shí)施例15

高烏甲素與3-(5-乙基-2-吡啶基)-丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(5-乙基-2-吡啶基)-丙烯醛20.08mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純，干燥得到白色結(jié)晶粉末(33.70mg)，總收率56.15％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.46(1H,d),7.30-8.30(4H,m),7.76(1H,s),7.50(1H,s),7.39(1H,s),7.34(1H,d),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.60(2H,q),2.54(2H,d),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.25(3H,t),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:167.1,155.3,154.6,149.7,146.4,137.2,133.8,130.7,126.0,124.4,122.5,117.0,113.4,109.9,91.7,91.4,84.5,66.7,61.0,57.7,57.4,54.4,50.8,46.7,45.5,41.6,40.3,37.5,37.3,32.3,28.6,27.8,27.2,26.1,14.5,14.4,13.3；HRMS(ESI)calcd.for C40H51N3O8[M+H]+,701.3676；found,701.8482.

實(shí)施例16

高烏甲素與3-(3,5-二甲基-2-吡啶基)-丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(3,5-二甲基-2-吡啶基)-丙烯醛20.08mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純，干燥得到白色結(jié)晶粉末(30.07mg)，總收率51.15％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),7.76(1H,s),7.30-8.30(4H,m),7.50(1H,s),7.28(1H,s),7.23(1H,s),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.53(3H,s),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(4H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,158.3,154.8,146.6,140.3,138.2,133.2,130.1,124.5,124.2,123.6,122.6,119.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.0,2 2.0,20.4,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C40H51N3O8[M+H]+,701.3676；found,701.8482.

實(shí)施例17

高烏甲素與3-(5-異丙基-2-吡啶基)-丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(5-異丙基-2-吡啶基)-丙烯醛21.52mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純，干燥得到白色結(jié)晶粉末(27.99mg)，總收率46.63％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),8.46(1H,s),7.76(1H,s),7.30-8.30(4H,m),7.50(1H,s),7.39(1H,s),7.34(1H,d),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.87(1H,m),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.20(6H,t),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,158.1,155.1,146.9,140.3,138.2,133.2,130.1,124.5,124.2,123.0,119.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,33.6,31.9,26.9,26.4,24.0,23.3,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C₄₁H₅₃N₃O₈[M+H]+,715.3833；found,715.8748.

實(shí)施例18

高烏甲素與3-(3-甲基-2-吡啶基)-2-甲基丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(3-甲基-2-吡啶基)-2-甲基丙烯醛20.08mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純，干燥得到白色結(jié)晶粉末(24.87mg)，總收率41.43％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),7.30-8.30(4H,m),7.55(1H,d),7.48(1H,s),7.27(1H,d),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.53(3H,s),2.50(2H,s),2.43(1H,s)，2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:167.1,163.8,157.8,154.3,140.3,137.2,133.2,131.0,126.6,124.2,122.9,121.3,19.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24..3,24.0,11.9,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C40H51N3O8[M+H]+,701.8482；found,701.3676.

實(shí)施例19

高烏甲素與3-(3-甲基-2-吡啶基)-丙烯醛

向25ml雞心瓶中，加入高烏甲素50mg和5ml乙醇，加適量2％的鹽酸，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)控反應(yīng)完全后，50℃減壓蒸干溶劑，殘余固體加入適量DMF溶解，加入3-(3-甲基-2-吡啶基)-丙烯醛18.64mg和催化量的DCC，加熱到70℃攪拌反應(yīng)。TLC中控完全后停止加熱,向上述所得的反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，DCM萃取。有機(jī)相減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離提純，干燥得到白色結(jié)晶粉末(31.70mg)，總收率53.89％。目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其表征如下：

白色結(jié)晶粉末，M.P.182-184℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.12(1H,s),7.30-8.30(4H,m),7.76(1H,s),7.55(1H,d),7.51(1H,t),7.50(1H,s),7.27(1H,d),3.65(2H,s),3.30(9H,s),2.85(1H,d),2.78(1H,q),2.77(1H,t),2.75(2H,s),2.54(2H,d),2.53(3H,s),2.50(2H,s),2.40(2H,q),2.36(1H,m),2.13(4H,m),1.99(1H,t),1.95(2H,t),1.88(4H,m),1.80(2H,d),1.73(1H,t),1.70(4H,m),1.55(2H,d),1.48(1H,s),1.45(2H,q),1.02(3H,t)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:168.0,167.1,157.8,154.3,140.3,138.2,137.2,133.2,130.1,124.5,124.2,122.9,121.3,119.2,115.4,92.2,88.6,86.1,84.5,80.1,77.2,69.9,58.5,58.0,57.7,57.4,51.0,48.6,47.6,44.9,42.9,41.6,31.9,26.9,26.4,24.3,24.0,13.6；HRMS(ESI)calcd.for C39H49N3O8[M+H]+,687.3520；found,687.8217.

實(shí)施例20

本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性測(cè)試

對(duì)本發(fā)明的化合物進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn),試驗(yàn)方法采用常規(guī)的MTT法。

細(xì)胞株選用：人前列腺癌(PC-3),人胃腺癌細(xì)胞(SGC-7901),人肺癌細(xì)胞(A-549)。培養(yǎng)液為DMEM+15％NBS+雙抗。

樣品液的配制：用DMSO(Merck)溶解后,加入PBS(-)配成的100μmol/L的溶液或者均勻的混懸液,然后用DMSO的PBS(-)稀釋,最終濃度分別為0.1,1,10,20,40,60,80,100μmol/L。

將抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)以同樣的條件配成對(duì)照品溶液。

細(xì)胞培養(yǎng)：貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)于含10％滅活新生牛血清和青霉素、鏈霉素(各100萬(wàn)U/L)的1640培養(yǎng)液中,置于37℃,5％CO₂,飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),每2～3天傳代1次,傳代時(shí)首先倒出培養(yǎng)液,PBS洗2次,胰酶消化后,加入新鮮的培養(yǎng)液吹打均勻,調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)濃度移入新的培養(yǎng)瓶中,添加培養(yǎng)液至適量。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性及IC₅₀的測(cè)定：

實(shí)驗(yàn)原理：活細(xì)胞線粒體中脫氫酶能將黃色的MTT還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜(MTT formazan),并沉積在細(xì)胞中,生成的量與活細(xì)胞數(shù)目成正比,而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。DMSO能溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物,顏色深淺與所含的量成正比,因此用酶標(biāo)儀測(cè)定的光吸收值可反映細(xì)胞存活率。

實(shí)驗(yàn)方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,消化、計(jì)數(shù),以3×10⁵/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100μl。培養(yǎng)24小時(shí)后,將待測(cè)化合物以0.1,1,10,20,40,60,80,100μmol/L濃度處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔,以含0.4％DMSO的培養(yǎng)液作對(duì)照。藥物作用48小時(shí)后,去上清,每孔加入100μl MTT(2-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-3,5-二苯基-2H-四唑氫溴酸鹽)(1mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí),棄上清,每孔加入100μl DMSO,振蕩混勻,用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定吸光度值,采用IC₅₀計(jì)算軟件求出半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。

試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表1,其中,樣品是指相應(yīng)實(shí)施例中制備的巖白菜素氮雜肉桂酸酯類化合物,樣品編號(hào)對(duì)應(yīng)制備實(shí)施例中所得到的化合物的具體編號(hào)。

表1化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC₅₀(單位：μmol/L)

表1結(jié)果顯示,化合物1-19在所測(cè)試的3種細(xì)胞株中均表現(xiàn)出了不同程度的抗腫瘤活性,其中化合物11、12和5的活性較好,對(duì)細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的抑制效果,在特定細(xì)胞株中抗腫瘤活性優(yōu)于或等同于5-氟尿嘧啶,對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株具有明顯選擇性。綜上,本發(fā)明的高烏甲素氮雜肉桂酰胺類化合物可作為抗腫瘤候選藥物進(jìn)一步進(jìn)行臨床前研究,也可以做為抗腫瘤先導(dǎo)化合物進(jìn)一步研究。