本發(fā)明涉及一種大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，具體涉及一種可以大大提高大白菜游離小孢子誘導(dǎo)為胚性愈傷組織效率的培養(yǎng)基配方，屬于蔬菜培育高新技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

大白菜（Brassica campestris ssp. pekinensis Lour.）屬于十字花科蕓薹屬蕓薹種大白菜亞種，是原產(chǎn)于我國的一種重要蔬菜作物。大白菜生態(tài)類型多樣，分布廣，產(chǎn)量高，耐貯運(yùn)，供應(yīng)期長，營養(yǎng)全面，食用方法多樣，且種植簡易、省工、成本低，在我國菜籃子中居不可替代的重要地位。我國大白菜的栽培面積和產(chǎn)量均為各種蔬菜作物之首，大白菜生產(chǎn)在蔬菜業(yè)中占有主導(dǎo)地位。由于歷史、生態(tài)、生產(chǎn)和消費習(xí)慣差異的原因，我國北方地區(qū)是大白菜的主產(chǎn)區(qū)。

隨著人們生活質(zhì)量的提高，對大白菜品質(zhì)也提出了更高的要求，這就迫切需要育種工作者選育出更多的優(yōu)質(zhì)、抗病、豐產(chǎn)的優(yōu)良品種。大白菜為異花授粉植物，具有顯著的雜種優(yōu)勢，目前主要采用雜交育種方法進(jìn)行大白菜新品種培育。傳統(tǒng)雜交育種方法育成了一系列大白菜品種，為蔬菜生產(chǎn)做出了卓越的貢獻(xiàn)。然而，大白菜雜交育種方法存在周期長、效率低等突出問題，育成一個穩(wěn)定優(yōu)良自交系一般需要6-8年，甚至更長時間，選育自交系非常費事、費工。近年來隨著人工成本的增加，常規(guī)育種的不足在實際工作中日漸明顯。因此，各國學(xué)者開始尋找育種的新途徑和新方法。

游離小孢子培養(yǎng)，是指直接從花蕾或花藥中獲得游離的、新鮮的小孢子群體進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)由胚狀體或愈傷組織的誘導(dǎo)，再生出完整的單倍體植株，再經(jīng)過人工或自然加倍，成為正?？捎?、純合的二倍體植株的技術(shù)。游離小孢子培養(yǎng)具有純單倍性、單細(xì)胞性和培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量大等特點，因此越來越受到育種工作者的青睞。該技術(shù)用于育種可在1-2年內(nèi)獲得優(yōu)良自交系和自交不親和純系，因此可大大縮短育種年限，從而提高育種效率。游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，目前比較成功的研究領(lǐng)域是禾本科和茄科，多種禾本科和茄科作物均驗證成功出高效的誘導(dǎo)和分化體系。十字花科蔬菜的游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)也進(jìn)行了一系列研究，對大白菜小孢子胚胎發(fā)生的機(jī)制、影響因素做了大量的研究探索，并取得了許多重要的研究進(jìn)展。

我國的大白菜游離小孢子培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)80年代后期。1988年，河南省農(nóng)科院園藝研究所栗根義等在國內(nèi)首次將大白菜游離小孢子誘導(dǎo)成胚和胚再生成功。隨后，河南省農(nóng)科院將該技術(shù)應(yīng)用于DH純系和親本材料的培養(yǎng)，成功育成了豫白菜7號，成為國內(nèi)外首個大白菜游離小孢子培養(yǎng)方法培育成的新品種。之后，又先后選育出14個通過省級以上審（鑒）定的不同類型大白菜新品種，其中豫白菜7號在1994-1997年間推廣面積達(dá)到3.01萬hm²。2002年北京市蔬菜研究中心利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)育成的橘紅心品種獲得國家發(fā)明專利。雖然大白菜游離小孢子培養(yǎng)育種技術(shù)取得了一系列研究進(jìn)步，也培育出豫白菜7號、豫新3號、豫園5號、橘紅心等優(yōu)良品種，但是大白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)并不完善，主要是大白菜游離小孢子誘導(dǎo)率不高，胚狀體成苗率低等問題一直沒有得到很好的解決。小孢子誘導(dǎo)率低將導(dǎo)致難以獲得足夠的選擇群體，直接限制了大白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種上的應(yīng)用。

培養(yǎng)基是游離小孢子培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，直接關(guān)系到小孢子的生長與分化，培養(yǎng)基組分對小孢子的刺激和啟動，是游離小孢子能否誘導(dǎo)成功的最關(guān)鍵的因素。培養(yǎng)基組分的合適配比，可顯著影響小孢子誘導(dǎo)效率，一些有機(jī)和無機(jī)添加物，可以顯著提高小孢子誘導(dǎo)效率。目前有研究發(fā)現(xiàn)，相對于禾本科和茄科作物，低離子濃度的基本培養(yǎng)基配方對十字花科小孢子誘導(dǎo)更加有利，氨基酸和活性炭可以顯著提高大白菜游離小孢子的誘導(dǎo)能力。因此，繼續(xù)優(yōu)化組合基本培養(yǎng)基配比，發(fā)掘和試驗針對于提高大白菜游離小孢子成胚誘導(dǎo)能力的有機(jī)無機(jī)添加物，是建立大白菜游離小孢子高效誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的關(guān)鍵。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種可以大大提高大白菜游離小孢子胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效率、具有重要的應(yīng)用價值的大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的：

一種大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，其特征在于：該培養(yǎng)基的配方如下：

KNO₃ 56-64mg/L，MgSO₄?7H₂O 60-65mg/L，KH₂PO₄ 65-70mg/L，Ca(NO₃)₂?4H₂O 200-250mg/L，Na₂-EDTA 11-14mg/L，F(xiàn)eSO₄?7H₂O 12-15mg/L，MnSO₄?4H₂O 23-27mg/L，AgNO₃ 7-9mg/L，H₃BO₃ 8.0-8.5mg/L，ZnSO₄?7H₂O 8.5-9.5mg/L，KI 0.4-0.45mg/L，Na₂MoO₄?2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄?5H₂O 0.02-0.03mg/L，CoCl₂?6H₂O 0.02-0.03mg/L，L-谷氨酰胺 750-850mg/L，維生素B1 0.45-0.55mg/L，維生素B6 0.45-0.55mg/L，煙酸 4.5-5.5mg/L，葉酸 0.04-0.06mg/L，生物素 0.04-0.06mg/L，肌醇 90-110mg/L，甘氨酸 3.5-4.5mg/L，脯氨酸 17-23mg/L，絲氨酸 70-90mg/L，L-谷胱甘肽 27-33mg/L，甲基亞硝基脲 1.2-1.8g/L，蔗糖 120-140g/L，植物凝膠 3.0-3.5g/L，6-BA 0.2-0.3mg/L，復(fù)酞核酸 0.15-0.25mg/L，水解蛋白 0.5-0.7g/L，秋水仙堿 0.06-0.08mg/L，活性炭 0.04-0.06g/L，植物硫化激動素PSK-α 30-40pmol/L，pH 5.6-5.8。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點：

本發(fā)明根據(jù)禾本科和茄科小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，針對于大白菜游離小孢子的孢子體發(fā)育特性，繼續(xù)優(yōu)化并組合基本培養(yǎng)基配比，低離子濃度基本培養(yǎng)基的組配，有利于大白菜游離小孢子的誘導(dǎo)；采用低含量的植物凝膠，使配制成的培養(yǎng)基半固體化，對大白菜游離小孢子的誘導(dǎo)更有利；發(fā)掘和試驗針對于提高大白菜游離小孢子成胚誘導(dǎo)能力的有機(jī)添加物和無機(jī)添加物，水解蛋白、L-谷氨酰胺、葉酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、L-谷胱甘肽、甲基亞硝基脲、秋水仙堿、活性炭、植物硫化激動素PSK-α等物質(zhì)的合適濃度的添加，均不同程度的提高了大白菜游離小孢子的誘導(dǎo)率；6-BA和復(fù)酞核酸的復(fù)配，顯著提高了大白菜游離小孢子的誘導(dǎo)能力。

本發(fā)明所提供的大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是在現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)之上進(jìn)一步創(chuàng)造性改良的成果，是經(jīng)過大量單因子、多因子試驗所篩選的最優(yōu)組合，我們進(jìn)行了大量的實驗研究亦得出本發(fā)明的組分配比是最優(yōu)的。采用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基可以大大提高游離大白菜小孢子胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效率，因此具有較高的產(chǎn)業(yè)推廣價值。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

一種大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，其特征在于：該培養(yǎng)基的配方如下：

KNO₃ 56-64mg/L，MgSO₄?7H₂O 60-65mg/L，KH₂PO₄ 65-70mg/L，Ca(NO₃)₂?4H₂O 200-250mg/L，Na₂-EDTA 11-14mg/L，F(xiàn)eSO₄?7H₂O 12-15mg/L，MnSO₄?4H₂O 23-27mg/L，AgNO₃ 7-9mg/L，H₃BO₃ 8.0-8.5mg/L，ZnSO₄?7H₂O 8.5-9.5mg/L，KI 0.4-0.45mg/L，Na₂MoO₄?2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄?5H₂O 0.02-0.03mg/L，CoCl₂?6H₂O 0.02-0.03mg/L，L-谷氨酰胺 750-850mg/L，維生素B1 0.45-0.55mg/L，維生素B6 0.45-0.55mg/L，煙酸 4.5-5.5mg/L，葉酸 0.04-0.06mg/L，生物素 0.04-0.06mg/L，肌醇 90-110mg/L，甘氨酸 3.5-4.5mg/L，脯氨酸 17-23mg/L，絲氨酸 70-90mg/L，L-谷胱甘肽 27-33mg/L，甲基亞硝基脲 1.2-1.8g/L，蔗糖 120-140g/L，植物凝膠 3.0-3.5g/L，6-BA 0.2-0.3mg/L，復(fù)酞核酸 0.15-0.25mg/L，水解蛋白 0.5-0.7g/L，秋水仙堿 0.06-0.08mg/L，活性炭 0.04-0.06g/L，植物硫化激動素PSK-α 30-40pmol/L，pH 5.6-5.8。

在4-5月份的大白菜初花期，采取2.2mm-3.0mm的花蕾帶回實驗室，置于4℃冰箱內(nèi)低溫預(yù)處理1-2d。接種前，將花蕾轉(zhuǎn)移入超凈工作臺無菌燒杯中，倒入70%酒精進(jìn)行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用無菌水沖洗三次以充分除去氯化汞殘毒。瀝干水分后，在B5液體洗滌培養(yǎng)基中用平頭玻棒碾壓花蕾，擠出小孢子。懸浮液經(jīng)30μm無菌微孔紗布過濾，收集濾液于10ml離心管，1000rpm下離心3min，沉淀物加5mL B5洗滌培養(yǎng)基，搖勻，800rpm下離心2min，重復(fù)兩次，所得沉淀物即為大白菜游離小孢子。將大白菜游離小孢子轉(zhuǎn)移入本發(fā)明的大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，33℃熱激處理24h后轉(zhuǎn)入25℃暗培養(yǎng)直至胚性愈傷組織形成。

實施例

配制本發(fā)明所述的一種大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方具體如下：

KNO₃ 60mg/L，MgSO₄?7H₂O 62.5mg/L，KH₂PO₄ 67.5mg/L，Ca(NO₃)₂?4H₂O 225mg/L，Na₂-EDTA 12.5mg/L，F(xiàn)eSO₄?7H₂O 13.5mg/L，MnSO₄?4H₂O 25mg/L，AgNO₃ 8mg/L，H₃BO₃ 8.25mg/L，ZnSO₄?7H₂O 9.0mg/L，KI 0.425mg/L，Na₂MoO₄?2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄?5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂?6H₂O 0.025mg/L，L-谷氨酰胺 800mg/L，維生素B1 0.5mg/L，維生素B6 0.5mg/L，煙酸 5mg/L，葉酸 0.05mg/L，生物素 0.05mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 4mg/L，脯氨酸 20mg/L，絲氨酸 80mg/L，L-谷胱甘肽 30mg/L，甲基亞硝基脲 1.5g/L，蔗糖 130g/L，植物凝膠 3.25g/L，6-BA 0.25mg/L，復(fù)酞核酸 0.2mg/L，水解蛋白 0.6g/L，秋水仙堿 0.07mg/L，活性炭 0.05g/L，植物硫化激動素PSK-α 35pmol/L，pH 5.7。

2015年4月份在大白菜品種魯白17號和全勝的初花期，采取2.2mm-3.0mm的魯白17號和全勝花蕾帶回實驗室，置于4℃冰箱內(nèi)低溫預(yù)處理2d。接種前，將花蕾轉(zhuǎn)移入超凈工作臺無菌燒杯中，倒入70%酒精進(jìn)行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用無菌水沖洗三次以充分除去氯化汞殘毒。瀝干水分后，在B5液體洗滌培養(yǎng)基中用平頭玻棒碾壓花蕾，擠出小孢子。懸浮液經(jīng)30μm無菌微孔紗布過濾，收集濾液于10ml離心管，1000rpm下離心3min，沉淀物加5mL B5洗滌培養(yǎng)基，搖勻，800rpm下離心2min，重復(fù)兩次，所得沉淀物即為大白菜游離小孢子。將魯白17號和全勝的游離小孢子分別轉(zhuǎn)移入本發(fā)明的大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，33℃熱激處理24h后轉(zhuǎn)入25℃暗培養(yǎng)，胚性愈傷組織形成后分別統(tǒng)計魯白17號和全勝的小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率。小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷塊數(shù)/接種花蕾總數(shù)×100%。

為了比較本發(fā)明所提供的大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基與前人采用的培養(yǎng)基對大白菜游離小孢子胚性愈傷組織誘導(dǎo)效率的差異，我們另外選擇了2種前人采用過的大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基，試驗品種亦采用魯白17號和全勝，游離小孢子的分離方法、組培操作方法、培養(yǎng)方法均相同，胚性愈傷組織形成后分別統(tǒng)計魯白17號和全勝的小孢子在該2種培養(yǎng)基內(nèi)的小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率。

其它2種大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：

NLH基本培養(yǎng)基+30mg/L谷胱甘肽+100mg/L絲氨酸+800mg/L谷酰胺+0.4mg/L 6-BA，pH為5.8（對比文件來自于韓陽等《大白菜小孢子培養(yǎng)影響因素研究》）；

NLN-13培養(yǎng)基+0.1g/L活性炭，pH為5.8（對比文件來自于孫丹等《大白菜小袍子培養(yǎng)再生成株及其差異性初步分析》）。

培養(yǎng)基對比實驗

將采用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基誘導(dǎo)魯白17號和全勝游離小孢子統(tǒng)計所得小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率與對比實施例的魯白17號和全勝小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行比較，比較的結(jié)果如下表1所示。

由表1可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所提供的大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基對大白菜品種魯白17號和全勝的小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率平均值達(dá)到了30.2個/蕾，而前人所采用的兩種培養(yǎng)基對大白菜品種魯白17號和全勝的小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率平均值分別僅為9.2個/蕾和13.0個/蕾，可以發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所提供的大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基對大白菜游離小孢子的誘導(dǎo)能力做出了顯著的提升。

本發(fā)明所提供的大白菜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是在現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)之上進(jìn)一步創(chuàng)造性改良的成果，是經(jīng)過大量單因子、多因子試驗所篩選的最優(yōu)組合，我們進(jìn)行了大量的實驗研究亦得出本發(fā)明的組分配比是最優(yōu)的。采用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基可以大大提高游離大白菜小孢子胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效率，因此具有較高的產(chǎn)業(yè)推廣價值。

以上實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動，均落入本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)；本發(fā)明未涉及的技術(shù)均可通過現(xiàn)有技術(shù)加以實現(xiàn)。