本發(fā)明涉及金屬配合物領(lǐng)域，具體涉及一種稀土鈰席夫堿配合物及其制備方法，以及該配合物作為PTP1B和TCPTP活性抑制劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類(lèi)不含金屬的酶，它與蛋白激酶共同調(diào)控蛋白酪氨酸磷酸化這一可逆動(dòng)態(tài)過(guò)程。其中，蛋白酪氨酸使蛋白磷酸化，而蛋白激酶則使蛋白去磷酸化。PTPs能夠調(diào)控細(xì)胞周期和信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞信號(hào)的響應(yīng)方面，它能夠通過(guò)和蛋白酪氨酸激酶聯(lián)合來(lái)調(diào)控蛋白酪氨酸磷酸化的作用程度。這些信號(hào)系統(tǒng)的異常調(diào)控路徑被發(fā)現(xiàn)和許多疾病有關(guān)。不正常的PTPs活性可導(dǎo)致包括癌癥、糖尿病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等在內(nèi)的許多疾病的發(fā)生。由于PTPs在疾病控制方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此可作為藥物靶標(biāo)。目前人們研究發(fā)現(xiàn)的PTPs的種類(lèi)已有107種，如PTP1B、TCPTP、SHP-1、SHP-2、PTP-MEG2等。

其中PTP1B通過(guò)使胰島素受體去磷酸化，負(fù)向調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。生物化學(xué)研究表明，PTP1B基因敲除鼠不僅發(fā)育正常，而且對(duì)胰島素的敏感度增高，癌癥發(fā)病率和發(fā)胖的概率也未見(jiàn)提高。因此，PTP1B是治療Ⅱ型糖尿病和肥胖病的有效靶點(diǎn)。PTP1B抑制劑的研究可望篩選出高效低毒的抗糖尿病和抗肥胖癥的新藥物。

TCPTP在細(xì)胞體內(nèi)分布較廣，在所有組織和細(xì)胞的各個(gè)階段都有表達(dá)。參與多條細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖。對(duì)TCPTP缺陷小鼠的研究顯示，TCPTP對(duì)細(xì)胞因子應(yīng)答和紅細(xì)胞生成都有調(diào)控作用,骨髓中細(xì)胞數(shù)量的嚴(yán)重減少和骨髓中B細(xì)胞數(shù)的降低提示TCPTP在造血細(xì)胞發(fā)育中具有重要的作用。因此，TCPTP抑制劑的尋找及篩選有可能成為新型抗腫瘤藥物研發(fā)的重要途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種稀土鈰席夫堿配合物及其制備方法，以及該配合物作為PTP1B和TCPTP活性抑制劑的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種稀土鈰席夫堿配合物，其分子式為[Ce(HL)₂(NO₃)₃]，其中HL為N'-(吡啶-2-亞甲基)吡嗪-2-碳酰肼(N'-(pyridin-2-ylmethylene)pyrazine-2-carbohydrazide，化學(xué)式C₁₁H₉N₅O)，結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明提供的稀土鈰席夫堿配合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)將Ce(NO₃)₃與N'-(吡啶-2-亞甲基)吡嗪-2-碳酰肼分別溶于甲醇溶液；

(2)將上述兩種溶液置于反應(yīng)器中混合，40-60℃加熱回流6-9h，得墨綠色清液，過(guò)濾，濾液中析出淡黃色塊狀晶體。

步驟(1)Ce(NO₃)₃與N'-(吡啶-2-亞甲基)吡嗪-2-碳酰肼的摩爾比為2：1。

本發(fā)明制備的稀土鈰席夫堿配合物的晶體屬于單斜晶系的C_2/C空間群，晶胞參數(shù)：α＝90°,β＝126.447(1)°,γ＝90°。該配合物中鈰離子與配體形成1：2的摩爾比，兩個(gè)配體均以三齒螯合配位到鈰離子，同時(shí)鈰離子還與三個(gè)硝酸根離子配位達(dá)到電中性。從甲醇中結(jié)晶的本發(fā)明配合物含有兩分子的溶劑。

本發(fā)明的稀土鈰席夫堿配合物對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B和TCPTP)的活性具有抑制作用，對(duì)PTP1B的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)為：5.21μM，對(duì)TCPTP的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)為：2.02μM。其可以作為蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B和TCPTP)的抑制劑應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：

本發(fā)明的稀土鈰席夫堿配合物是稀土鹽Ce(NO₃)₃與席夫堿配體在加熱條件下反應(yīng)得到，制備方法方便簡(jiǎn)單，產(chǎn)物純度高，產(chǎn)率高，可達(dá)75％。

本發(fā)明提供的稀土鈰席夫堿配合物通過(guò)半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)的測(cè)定得知其對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶的活性有抑制作用，對(duì)不同PTPs的抑制能力不同，配合物對(duì)TCPTP顯示出選擇性。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明稀土鈰配合物[Ce(HL)₂(NO₃)₃]·2CH₃OH的晶體結(jié)構(gòu)圖

圖2本發(fā)明稀土鈰配合物[Ce(HL)₂(NO₃)₃]的電噴霧質(zhì)譜圖

圖3本發(fā)明稀土鈰配合物[Ce(HL)₂(NO₃)₃]抑制PTP1B活性的IC₅₀值測(cè)定曲線

圖4本發(fā)明稀土鈰配合物[Ce(HL)₂(NO₃)₃]抑制TCPTP活性的IC₅₀值測(cè)定曲線

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.本發(fā)明配合物[Ce(HL)₂(NO₃)₃]的制備及晶體培養(yǎng)方法。

稱取0.434g Ce(NO₃)₃溶于2ml甲醇,0.114g N'-(吡啶-2-亞甲基)吡嗪-2-碳酰肼溶于50ml甲醇,將上述兩種溶液置于反應(yīng)器中混合，55℃加熱回流8h，得墨綠色清液，過(guò)濾，濾液中析出淡黃色塊狀晶體，收集晶體分別用水、甲醇各洗滌三次，真空干燥，產(chǎn)率為65％。元素分析[Ce(C₁₁H₉N₅O)₂(NO₃)₃]·2CH₃OH：理論值：C 33.53H 2.70N 22.03；實(shí)驗(yàn)值：C 33.99，H 2.73，N 22.41。

實(shí)施例2.本發(fā)明配合物[Ce(HL)₂(NO₃)₃]·2CH₃OH的單晶X-ray衍射試驗(yàn)條件結(jié)果。

在高倍顯微鏡下，挑選規(guī)則、透明的黃塊狀單晶顆粒。將所選晶體用玻璃絲粘牢，并固定在Bruker SMART 1000CCD面探衍射儀上。以石墨單色器Mo-Kα為輻射光源，收集樣品對(duì)波長(zhǎng)為的X-ray衍射數(shù)據(jù)。以ω掃描方式，衍射數(shù)據(jù)經(jīng)LP因子和經(jīng)驗(yàn)吸收校正。全部X-ray衍射圖還原為衍射指標(biāo)數(shù)據(jù)后，用SHELXL-97直接法解得晶體結(jié)構(gòu)，氫原子采用理論加氫，并作各向異性精修，最后畫(huà)出相應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)圖。有關(guān)晶體其它一些詳細(xì)的信息列于表1.

表1配合物[Ce(C₁₁H₉N₅O)₂(NO₃)₃]·2CH₃OH的晶體學(xué)數(shù)據(jù)

實(shí)施例3.配合物[Ce(HL)₂(NO₃)₃]的電噴霧質(zhì)譜：

為了研究配合物在溶液中的存在形式，將少量的配合物固體粉末溶于甲醇，離心得到澄清透明溶液，上樣到電噴霧質(zhì)譜儀，采用電噴霧離子源，以正離子方式檢測(cè)并記錄數(shù)據(jù)。圖2是配合物的正離子電噴霧質(zhì)譜圖。所有圖譜中都能觀察到相應(yīng)配合物的分子離子峰。表2是配合物的正離子電噴霧質(zhì)譜歸屬。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)值與理論值一致，配合物在溶液中是以合成得到的形式穩(wěn)定存在。

表2配合物[Ce(HL)₂(NO₃)₃](1)的正離子電噴霧質(zhì)譜歸屬

實(shí)施例4.本發(fā)明稀土配合物[Ce(HL)₂(NO₃)₃]對(duì)PTP1B和TCPTP抑制效果檢測(cè)。

IC₅₀測(cè)定原理：

蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)能使反應(yīng)底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽(pNPP)分解成黃色的對(duì)硝基苯酚，該產(chǎn)物在405nm處有很強(qiáng)的吸收。PTPs與配合物作用后，通過(guò)檢測(cè)405nm處吸光度值的變化來(lái)間接檢測(cè)酶活性的變化情況。

IC₅₀值的意義：

IC₅₀指的是酶的活性降低為原活性的一半時(shí)，此時(shí)的抑制劑濃度，以此來(lái)衡量抑制劑的抑制效果，IC₅₀數(shù)值越小，說(shuō)明抑制劑抑制PTPs活性的效果就越好，以此為依據(jù)來(lái)檢測(cè)抑制率。

IC₅₀的測(cè)定方法：

酶活性抑制實(shí)驗(yàn)的測(cè)定是以0.1M對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽(pNPP)為反應(yīng)底物在pH為6.00的MOPS緩沖體系[30mM嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)，50mM NaCl]中進(jìn)行的。

將配合物用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配成10^-2M的母液，再用DMSO稀釋成不同濃度的溶液(10^-3M、10^-4M、10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M)。用MOPS緩沖溶液將所要用的PTPs稀釋至一定濃度(現(xiàn)用現(xiàn)配)。在96孔板中，每孔依次加入83μl含酶緩沖溶液，10μl不同濃度的配合物溶液，水浴37℃恒溫30min后，用2μl(0.1M)的pNPP啟動(dòng)反應(yīng)，30min后，加5μl(2M)的NaOH終止反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定底物的分解產(chǎn)物—對(duì)硝基苯酚(pNP)在波長(zhǎng)λ＝405nm處的吸收強(qiáng)度。以配合物濃度的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，抑制率作為縱坐標(biāo)，利用Origin程序作圖，擬合得到配合物對(duì)酶抑制能力的曲線，求得抑制率在50％時(shí)相應(yīng)的配合物濃度，也就是IC₅₀值。

所有測(cè)定過(guò)程都設(shè)有空白及對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以排除溶劑干擾、配合物本身顏色的干擾。每次都用新配制的配合物溶液，并且重復(fù)三次以上平行實(shí)驗(yàn)。

檢測(cè)結(jié)果1：配合物[Ce(HL)₂(NO₃)₃]對(duì)PTP1B的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)為：5.21μM(見(jiàn)圖3)。

檢測(cè)結(jié)果2：配合物[Ce(HL)₂(NO₃)₃]對(duì)TCPTP的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)為：2.02μM(見(jiàn)圖4)。