本發(fā)明屬于海洋生物活性物質(zhì)制備技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種采用殼聚糖吸附法制備紫球藻藻紅蛋白的方法。

背景技術(shù)：

紫球藻(Porphyridium cruentum)屬于紅藻門單細(xì)胞藻類，可以生產(chǎn)多種生物活性物質(zhì)如：藻膽蛋白、多不飽和脂肪酸及胞外多糖等。其中所含的藻紅蛋白是一類捕光色素蛋白。它是由脫輔基蛋白和色基組成，其脫輔基蛋白是一類寡聚蛋白，開環(huán)的四吡咯藻紅素作為色基部分，由于色基的存在，藻紅蛋白在可見光區(qū)480～570nm處有較強的光吸收，并且具有強烈的熒光。藻紅蛋白用途非常廣泛，它既可以作為天然色素應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)，還可制成熒光試劑，用于生物醫(yī)學(xué)分析和免疫化學(xué)等領(lǐng)域。藻紅蛋白也是一種重要的生理活性物質(zhì)，具有抗腫瘤，抗病毒，增強免疫力等，它還是一種具有開發(fā)潛力的光敏劑，可制成光敏劑應(yīng)用于腫瘤光動力學(xué)治療。藻紅蛋白的純度通常用(A₅₄₅/A₂₈₀)來表示，等級劃分為0.7<食品級<3.0<反應(yīng)級<4.0<分析級，藻紅蛋白的純度越高，價格越高。國外很多家公司已經(jīng)投資開發(fā)藻紅蛋白，產(chǎn)品售價甚至達(dá)到了每毫克100美元以上。但國內(nèi)對其研究比較少，目前國內(nèi)使用的同類產(chǎn)品，全部依賴于進(jìn)口，其高成本已成為藻紅蛋白在工業(yè)及醫(yī)藥范疇大量使用的限制要素，因此開發(fā)此類新型海洋產(chǎn)品十分重要。目前人們主要采用硫酸按分級沉淀、羥基磷灰石柱層析、凝膠過濾層析等相結(jié)合的方法制備藻紅蛋白，現(xiàn)有的制備工藝流程存在操作復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，且難以實現(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)模的生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對上述問題，提供一種操作簡便、成本低廉且易于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，從紫球藻中制備高純度藻紅蛋白的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的制備方案為：

(1)離心收集新鮮培養(yǎng)的紫球藻，將藻泥與磷酸鹽緩沖液按1:5～1:10比例充分混勻，得細(xì)胞懸液；

(2)將步驟(1)所得細(xì)胞懸液反復(fù)凍融5～7次，得到破壁液；將破壁液按照10000r/min冷凍離心10min,收集上清液；

(3)將步驟(2)所得上清液中逐滴加入殼聚糖溶液，至混合溶液中的殼聚糖質(zhì)量濃度為0.2％～1.5％，充分混勻后按照10000r/min冷凍離心10min，取沉淀；

向沉淀中加入含0.1mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液，充分混勻后按照10000r/min冷凍離心10min，取沉淀；

接著向沉淀中加入含0.3mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液，充分混勻后按照10000r/min冷凍離心10min，取上清液；

(4)室溫下將步驟(3)所得上清液超濾，然后收集濾液，并將濾液冷凍干燥，即得到純化的藻紅蛋白；

其中，所述步驟(1)和步驟(3)中用的磷酸鹽緩沖液為pH值為6.8～7.0，濃度為0.01～0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液；

所述步驟(3)中所用的殼聚糖溶液pH值為4.5～5.0，濃度為0.03g/ml。

優(yōu)選，所述步驟(4)中超濾所用膜包為分子截留量為50～60kD的膜包；進(jìn)一步，超濾次數(shù)為4～6次。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明采用的殼聚糖吸附法制備高純度藻紅蛋白的方法，與傳統(tǒng)技術(shù)相比省去了柱層析的步驟，操作方法簡便易行，成本低廉，回收率高，純度高，并且經(jīng)過了實驗室放大設(shè)備的驗證。采用本發(fā)明方法得到的藻紅蛋白純度A₅₄₅/A₂₈₀>4.0，達(dá)到了分析級要求，為藻紅蛋白應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)分析和免疫化學(xué)等領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1提供的純化后藻紅蛋白的全波長掃描圖。

圖2為本發(fā)明實施例1提供的純化后藻紅蛋白的SDS-PAGE電泳圖。

其中圖2中，1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，2為純化的藻紅蛋白。

具體實施方式

根據(jù)以上技術(shù)方案，首先制備殼聚糖溶液，準(zhǔn)確稱取3g殼聚糖，加入80ml水，再加入1mol/L的醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5～5.0，加蒸餾水定容至100ml，然后放在磁力加熱攪拌器使其溶解至澄清透明，從而制備出實施例1和實施例2所用濃度為0.03g/ml的殼聚糖溶液。

實施例1

(1)離心收集新鮮培養(yǎng)的紫球藻10g，將藻泥與磷酸鹽緩沖液按1:5比例混合，得細(xì)胞懸液；

(2)將步驟(1)得到的細(xì)胞懸液反復(fù)凍融5次得到破壁液；將破壁液按照10000r/min冷凍離心10min，收集上清液；

(3)將步驟(2)所得上清液中逐滴加入殼聚糖溶液至殼聚糖質(zhì)量濃度為0.5％，充分混勻，按照10000r/min冷凍離心10min，然后取沉淀；向沉淀中加入含0.1mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液，充分混勻后按照10000r/min冷凍離心10min，取沉淀；接著向沉淀中加入含0.3mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液，充分混勻后按照10000r/min冷凍離心10min，取上清液；取少量樣品測定吸光度A₅₄₅和A₂₈₀，藻紅蛋白純度(A₅₄₅/A₂₈₀)＝4.1；

(4)室溫下將上清液經(jīng)分子截留量為50kD膜包超濾，超濾4次，收集濾液，將濾液冷凍干燥后得到純化的藻紅蛋白；

其中，步驟(1)和步驟(3)中用的磷酸鹽緩沖液的pH為6.8，濃度為0.01mol/L。

取少量樣品進(jìn)行全波長掃描和電泳分析，結(jié)果見圖1、圖2，制備的藻紅蛋白最大吸收峰為545nm，純度(A₅₄₅/A₂₈₀)>4.0，達(dá)到了分析級要求，經(jīng)純化后的藻紅蛋白在SDS-PAGE圖譜中特異條帶明顯；實例中藻紅蛋白的回收率為40.9％。

實施例2

(1)離心收集新鮮培養(yǎng)的紫球藻30g，將藻泥與磷酸鹽緩沖液按1:8比例混合，得細(xì)胞懸液；

(2)將步驟(1)得到的細(xì)胞懸液反復(fù)凍融6次得到破壁液；將破壁液按照10000r/min冷凍離心10min，收集上清液；

(3)將步驟(2)所得上清液中逐滴加入殼聚糖溶液至殼聚糖質(zhì)量濃度為0.3％，充分混勻，按照10000r/min冷凍離心10min，取沉淀；向沉淀中加入含0.1mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液，充分混勻后按照10000r/min冷凍離心10min，取沉淀，接著向沉淀中加入含0.3mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液，充分混勻后按照10000r/min冷凍離心10min，取上清液；

(4)室溫下將上清液經(jīng)分子截留量為60kD膜包超濾，超濾5次，收集濾液，將濾液冷凍干燥后得到純化的藻紅蛋白；

其中，步驟(1)和步驟(3)中用的磷酸鹽緩沖液的pH為6.8，濃度為0.02mol/L。

該實施例中制備的藻紅蛋白純度(A₅₄₅/A₂₈₀)>4.0，回收率為42.7％。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種等同變換，這些等同變換均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合。為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。