本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，尤其涉及重組人脫氧核糖核酸酶Ⅰ的制備方法。
背景技術：
：隨著氣候環(huán)境的變化及和生活方式的改變，現(xiàn)代人患呼吸道疾病的機率越來越大，人群分布也越來越多。呼吸系統(tǒng)疾病近年來成為一種常見病、多發(fā)病，世界范圍內其發(fā)病率都較高，并有增加的趨勢，它是我國人口死亡的第二大因素，而且，65歲以上老人因呼吸系統(tǒng)疾病死亡占相當大的比例。以慢性支氣管炎為例，據(jù)統(tǒng)計，我國50歲以上中老年人發(fā)病率為15％～30％左右。喘、咳、痰、炎四癥是呼吸系統(tǒng)疾病常見癥狀，同時互為因果。痰是呼吸道炎癥的產物，可刺激呼吸道粘膜，引起咳嗽及哮喘，并可加重感染。急慢性支氣管炎或慢性肺病患者呼吸衰竭時，如病人痰液粘稠度過高或形成痰栓，可阻塞呼吸道而導致窒息。目前對該病的治療原則是抗炎，化痰，止咳，其中化痰藥主要包括惡心性和刺激性祛痰藥，痰液溶解劑和黏液調節(jié)劑，10年市場總銷售額約為31億，其中排名前五位的氨溴索約占市場份額的80％多，乙酰半胱氨酸、復方可待因、復方右美沙芬、愈創(chuàng)木酚甘油醚各占3％左右。這些祛痰藥的基理是對胃黏膜及呼吸道黏膜進行刺激而增加呼吸道的分泌物，使痰液變稀，或者作用于氣管和支氣管的黏液產生細胞，使分泌物黏滯性降低。但這些藥物的藥理或臨床上存在一些缺陷，這主要是由于其分子結構中游離的巰基會吸附胃腸道粘蛋白，口服后會產生胃腸道局部損傷，副作用較大，患者使用多有不良反應，會伴有惡心、嘔吐、胃腸道出血等癥狀。并且，這些祛痰藥會減弱青霉素、頭孢類抗生素、紅霉素、四環(huán)素等的抗菌活性，不宜聯(lián)合用藥，對某些呼吸參數(shù)如痰粘度等的改善效力不高等，故限制了患者對該類藥的長期口服治療。市場迫切需求一種新的安全有效的痰液降解劑問世。重組人脫氧核糖核酸酶I(rHuDNaseI)可直接作用于痰液中的主要粘性成分DNA，改變分泌物的組成和流變學性質，降低痰液粘度，改善受抑制的呼吸功能。對囊性纖維化病人形成的頑固呼吸道分泌物的臨床治療顯示，rHuDNaseI對病人粘液的降解及肺功能的改善效果顯著，并可長期安全使用。盡管該藥物上市的定位是針對囊性纖維化病人，但調查結果顯示，其它呼吸道疾病患者對該藥的需求呈快速上升趨勢，rHuDNaseI在未來祛痰藥市場上將具有廣闊的市場發(fā)展空間，它不但會為臨床祛痰藥物帶來新的選擇，而且隨著其市場推進發(fā)展，也必將會改變目前祛痰藥市場的格局。2010年，該藥在全球的銷售總額達到25.2億，預計2015年將達到37.3億。但是目前，該藥價格非常昂貴。究其原因，是由于rHuDNaseI的生產效率十分的低。目前，對rHuDNaseI的制備方法主要通過細菌或哺乳動物細胞表達。哺乳動物細胞對重組蛋白的表達效率較低。細菌表達雖然能夠提高重組蛋白的產量，但氨基酸鏈在折疊過程中卻容易出現(xiàn)問題，導致制備的重組蛋白活性較低或徹底失活。因此，進一步開發(fā)表達量大、蛋白活性高的rHuDNaseI的制備方法，具有重大的經濟和社會意義。技術實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供重組人脫氧核糖核酸酶Ⅰ的制備方法。該方法所得蛋白量較大，蛋白活性較高。本發(fā)明提供了表達載體，其以pPIC9載體為骨架其中包括rHuDNaseI基因。pPIC9載體的質粒圖譜如圖1；pPIC9載體為畢赤酵母的蛋白表達載體，其為融合表達載體，表達水平為高拷貝，啟動子為AOX1；抗性標記為氨芐霉素，營養(yǎng)標記為HIS4；可選用的酶切位點為XhoI，SnaBI，EcoRI，AvrII，NotI。本發(fā)明將rHuDNaseI基因的5’端鏈接有6×His標簽。本發(fā)明選擇的rHuDNaseI基因的插入位點為XhoI與NotI酶切位點之間。所述rHuDNaseI基因的來源為人肝cDNA文庫。基因片段的長度為0.85kb。本發(fā)明構建的載體能夠將rHuDNaseI基因插入畢赤酵母GS115的his4區(qū)，從而使rHuDNaseI基因能夠順利的表達。所述表達載體在轉化入酵母菌前，轉化入大腸桿菌DH5α進行擴增和保存。本發(fā)明還提供了一種工程菌，其為轉化本發(fā)明所述表達載體的酵母菌。本發(fā)明采用的酵母菌為畢赤酵母GS115。所述轉化采用電轉化，轉化條件為1500V，5ms。所述轉化前，表達載體經線性化，所述線性化的酶SalI。所述轉化后，采用MD固體培養(yǎng)基篩選陽性轉化子；每升MD固體培養(yǎng)基中包括葡萄糖20g，YNB13.4g，生物素0.4mg；瓊脂20g；篩選培養(yǎng)的溫度為28℃。倒置培養(yǎng)。經培養(yǎng)，MD固體培養(yǎng)基上生長的轉化子經DNA測序，PCR檢測，驗證成功插入rHuDNaseI基因。本發(fā)明還提供了重組人脫氧核糖核酸酶Ⅰ的制備方法，其為發(fā)酵本發(fā)明提供的工程菌。本發(fā)明中，發(fā)酵前還包括種子活化的步驟。所述活化采用BMGY培養(yǎng)基。發(fā)酵的培養(yǎng)基為BMDY培養(yǎng)基。每升BMGY培養(yǎng)基中含酵母提取物10g，蛋白胨20g，YNB13.4g，甘油10g，生物素0.4mg。每升BMDY培養(yǎng)基中含酵母提取物15g，蛋白胨30g，YNB13.4g，葡萄糖40g，生物素0.4mg，硫酸銨2g。本發(fā)明中，發(fā)酵包括培養(yǎng)和誘導的步驟；所述發(fā)酵在發(fā)酵罐中進行。所述培養(yǎng)的溫度為30℃，攪拌速度為150rpm～300rpm；培養(yǎng)至菌體體積為10％。菌體體積是指為離心以后菌體所占培養(yǎng)液的體積。所述誘導的誘導劑為甲醇，溫度為25℃～30℃，攪拌速度為200rpm～450rpm。具體的，開始誘導后2h溫度為30℃；攪拌轉速為250rpm；誘導后2～4h，溫度由30℃降至25℃，轉速由250rpm升至450rpm；誘導后4h至誘導結束，溫度為25℃；轉速為450rpm。所述誘導劑的加入采用流加方式，其占培養(yǎng)基體積的1％。所述發(fā)酵過程pH值為6.0。所述發(fā)酵步驟中，溶氧呈現(xiàn)先下降再升高后又下降的趨勢；其波動范圍為20％～90％；具體的，在培養(yǎng)的過程中，溶氧由80％下降至20％，后又升高至90％；誘導過程中，溶氧由90％下降至35％。本發(fā)明所述溶氧量為：即時溶氧量所占初始溶氧量的百分比，定義充分通氣時的溶氧量為100％。本發(fā)明中，發(fā)酵步驟持續(xù)108h，其中，轉速、溶氧、溫度、菌體密度、pH值參數(shù)如圖4所示。經過發(fā)酵，所得重組人脫氧核糖核酸酶Ⅰ存在于培養(yǎng)液中。發(fā)酵后進行純化，所述純化采用鎳柱層析。所述純化包括：步驟1：收集發(fā)酵上清液經稀釋后、調整pH值為7.2，離心后取上清液上樣鎳層析柱；步驟2：平衡鎳層析柱后，以洗脫液洗脫，收集rHuDNaseI。所述平衡的緩沖液中，包括50mMNaH2PO4、300mMNaCl、20mMimidazole，其pH值為8.0。所述平衡緩沖液的體積為層析介質體積的10倍。所述洗脫液中，包括50mMNaH2PO4、300mMNaCl、500mMimidazole，其pH值為8.0。所述洗脫液的體積為層析介質體積的5倍。將分離純化的rHuDNaseI重組蛋白以SDS-PAGE檢測，其分子量約為37kDa；以程序Gel-ProAnalyzer圖像掃描分析，純度近乎100％；分別測定純化后的rHuDNaseI重組蛋白活性濃度，計算出其比活性為2677IU/mg。本發(fā)明所述制備方法制備的重組人脫氧核糖核酸酶Ⅰ。本發(fā)明所述制備方法制備的重組人脫氧核糖核酸酶Ⅰ在制備治療呼吸道疾病的藥物中的應用。實驗表明，本發(fā)明提供的重組人脫氧核糖核酸酶Ⅰ在Ca2+和Mg2+存在條件下，能夠降解DNA。本發(fā)明還提供了一種治療呼吸道疾病的藥物，其中包括本發(fā)明制備方法制備的重組人脫氧核糖核酸酶Ⅰ。所述治療呼吸道疾病的藥物中包括1mg/mLrHuDNaseI，0.15mg/mLCaCl2·2H2O，8.77mg/mLNaCl，pH值為7.2。所述治療呼吸道疾病的藥物中還可以包括糖類，所述糖類選自蔗糖，海藻糖或菊粉。本發(fā)明提供了質粒載體、工程菌、由工程菌發(fā)酵產生重組人脫氧核糖核酸酶Ⅰ的方法，由該方法制備的重組人脫氧核糖核酸酶Ⅰ及其應用與藥物。本發(fā)明實現(xiàn)了rHuDNaseI在畢赤酵母中的分泌表達，保證了與人體rHuDNaseI結構的相似性，所得產物活性高達2677IU/mg，表達量高達87mg/L，純度近乎為100％。附圖說明圖1示rHuDNaseI(6×His)基因PCR擴增產物；圖2示質粒pPIC9圖譜；圖3示各個轉化子分泌表達rHuDNaseI(6×His)的比較；圖4示小試各個轉化子分泌表達rHuDNaseI(6×His)的比較；圖5示中試發(fā)酵工藝條件；圖6示甲醇誘導過程中發(fā)酵液中總蛋白濃度的變化；圖7示甲醇誘導過程中發(fā)酵液中DNaseI酶活性的變化；圖8示純化后的rHuDNaseI重組蛋白的檢測，其中圖8-a示SDS-PAGE電泳檢測結果，圖8-b示Gel-ProAnalyzer圖像掃描分析；圖9示rHuDNaseI(6XHis)降解DNApUC18；圖10示rHuDNaseI降解DNA的特性；圖11示rHuDNaseI的穩(wěn)定性；其中，圖11-a示rHuDNaseI在4℃保存6個月的穩(wěn)定性；圖11-b示rHuDNaseI在25℃保存6個月的穩(wěn)定性；圖11-c示rHuDNaseI在60℃保存6個周的穩(wěn)定性。具體實施方式本發(fā)明提供了重組人脫氧核糖核酸酶Ⅰ的制備方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內容、精神和范圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例1rHuDNaseI分泌表達質粒的構建本發(fā)明所用rHuDNaseI基因片段經高保真Pfu酶PCR擴增獲得(模板為人肝cDNA文庫，序列的genbank登錄號為AAA63170.1，引物序列為ATCTCGAGAAAAGACATCATCATCATCATCATCTGAAGATCGCAGCC和ATGCGGCCGCTCACTTCAGCATCACCTC)，片段長約為0.85kb(圖1-a)；同時以PCR擴增了帶有6×His標記的rHuDNaseI基因片段(圖1-b)，平行構建對應的表達質粒。PCR產物經酶切(酶切位點為XhoI/NotI)后，插入表達質粒pPIC9(圖2)。兩個片段經T4DNA連接酶連接后，轉化DH5α感受態(tài)細胞；得到的轉化子以PCR檢測是否能擴增出0.85kb的條帶；對能夠擴增出目的條帶的菌落，擴大培養(yǎng)然后提取質粒DNA，酶切驗證質粒是否含有0.85kb片段插入；最后，選取3個克隆的質粒DNA進行序列測定，結果顯示我們所選取的克隆中rHuDNaseI基因的DNA序列完全正確。至此，我們得到了含有rHuDNaseI表達單元的質粒pP/DNase(6×His)。在我們所構建的質粒的表達單元中，rHuDNaseI結構基因的上游分別是由AOX1啟動子、分泌信號肽順序和信號肽切割順序。AOX1啟動子受甲醇的調控，因此，rHuDNaseI基因的表達可以用甲醇作為誘導物進行誘導。實施例2rHuDNaseI畢赤酵母表達菌株的構建和篩選將實施例1中構建的含有rHuDNaseI表達單元的質粒pP/DNase(6×His)，經SalI酶線性化后，電轉化(1500V，5ms)畢赤酵母感受態(tài)細胞，后涂布于MD平板(每升含葡萄糖20g，YNB13.4g，生物素0.4mg)，28℃培養(yǎng)至長出轉化子。選取4個轉化子(依次記為1～4)，提取其基因組DNA，然后進行PCR檢測，觀察能否擴增出特征性的0.85kb條帶。每個轉化子在5mLBMGY，28℃培養(yǎng)48小時，然后連續(xù)加入1％的甲醇誘導，取上清液，SDS-PAGE電泳觀察，比較空白對照，可以看到一條分子量接近人DNaseI的條帶(圖3)。說明這些轉化子皆能夠成功表達rHuDNaseI，且表達量較為接近。檢測各轉化子的發(fā)酵液中的總蛋白濃度(生工生物公司的改良型BCA法蛋白質濃度測定試劑盒)和DNaseI酶活性(參考Benzonaseendonuclease標準活性測定法)，進行測定，酶活力的計算公式為：結果如表1：表1各轉化子發(fā)酵液中蛋白濃度及DNase活性轉化子1轉化子2轉化子3轉化子4蛋白質濃度(mg/mL)0.540.530.530.52DNase活性(IU/μL)0.3170.3300.3220.308從上表的數(shù)據(jù)結果可以看出，4個轉化子的表達能力相近，無顯著差異，對各菌種予以-80℃保存。實施例3rHuDNaseI在酵母中的小試誘導表達實施例2制得的4個轉化子，分別接種于4mLYPD(每升含酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g)，28℃，培養(yǎng)過夜。2mL種子液接入500mLBMMY(每升含酵母提取物10g，蛋白胨20g，YNB13.4g，甲醇10g，生物素0.4mg)，28℃，培養(yǎng)過夜。500mL培養(yǎng)液離心，菌體懸浮于250mLBMMY，1％甲醇開始誘導表達。表達情況如圖4，結合圖3～4和表1可知，各轉化子的表達量皆較高，不同的轉化子之間表達量不存在顯著性差異。實施例4rHuDNaseI誘導表達的中試生產工藝研究挑取實施例2制得的轉化子，接種于500mLBMGY(每升含酵母提取物10g，蛋白胨20g，YNB13.4g，甘油10g，生物素0.4mg)，30℃，培養(yǎng)1天為種子液。轉接于30升BMDY(每升含酵母提取物15g，蛋白胨30g，YNB13.4g，葡萄糖40g，生物素0.4mg，硫酸銨2g)(接種量為500mL)，30℃培養(yǎng)，24小時后，菌體達到約10％，至此開始流加甲醇誘導。在整個發(fā)酵過程中，控制pH于6.0，溶氧于40～50。整個發(fā)酵過程的參數(shù)變化請參見圖5。其中，轉化子2以甲醇誘導開始以后發(fā)酵罐中發(fā)酵液的總蛋白濃度(圖6，生工生物公司的改良型BCA法蛋白質濃度測定試劑盒)和DNaseI酶活性(圖7，參考Benzonaseendonuclease標準活性測定法)，酶活力的計算公式為：由圖可以看到兩者在整個誘導過程中一直在不斷地上升，經甲醇誘導至82h時，總蛋白的濃度為2.7mg/mL；DNaseI酶活性為1.2U/μL。轉化子1和轉化子3～4的蛋白表達量與酶活性與此相似，無顯著差異。實施例5酵母中rHuDNaseI的分離純化以實施例2的轉化子為種子，發(fā)酵誘導至108h終止發(fā)酵，測定總蛋白濃度為2.7mg/mL，DNaseI酶活性為1.2U/μL。將各菌株的培養(yǎng)液上清以50mMNaH2PO4,300mMNaCl,pH8.0緩沖液稀釋5倍，以0.5NNaOH調整至pH7.2，離心后上樣Ni2+層析柱，以10倍層析介質體積的50mMNaH2PO4,300mMNaCl,20mMimidazole,pH8.0緩沖液平衡，然后以5倍層析介質體積的50mMNaH2PO4,300mMNaCl,500mMimidazole,pH8.0緩沖液洗脫，收集獲得rHuDNaseI重組蛋白。將表達子2表達的rHuDNaseI重組蛋白經分離純化后的以SDS-PAGE檢測，其分子量約為37kDa(圖8-a)。以程序Gel-ProAnalyzer圖像掃描分析，蛋白的純度高于95％(程序結果顯示為幾乎100％)(圖8-b)，比活性可高達2677IU/mg。轉化子1和轉化子3～4的蛋白純度與比活性與此相似，無顯著差異。實施例6酵母分泌的rHuDNaseI降解DNA的特性用實施例4純化的表達子2表達的rHuDNaseI重組蛋白和質粒pUC18DNA一起37℃保溫，如圖9所示，很少量的重組蛋白即可以將DNA完全降解。為了進一步驗證本發(fā)明中的rHuDNaseI的體外活性，我們用以下一組實驗檢測了該重組蛋白的特征，如圖10所示，在僅有DNA存在的情況下，DNA并不會發(fā)生降解；在加入2μl重組蛋白后，DNA則全部被降解；重組蛋白在經過100℃高溫處理被滅活后，DNA則不發(fā)生降解；眾所周知，DNaseI的作用必須有Mg2+和Ca2+的參與，當體系中有缺乏Mg2+和Ca2+時，rHuDNaseI幾乎沒有活性，反之，當Mg2+或Ca2+存在時，DNA就基本被rHuDNaseI降解。實施例7rHuDNaseI蛋白的穩(wěn)定性測試我們測定了實施例4中純化的rHuDNaseI保存于4℃、25℃和60℃條件下的熱穩(wěn)定性。各菌種表達的rHuDNaseI分別配制成為制劑，其中包括1mg/mlrHuDNaseI,0.375mg/mlCaCl2,11.0mg/mlNaCl,22.5mg/ml碳水化合物(蔗糖、海藻糖或者菊粉)，使用0.2N的鹽酸調節(jié)pH至6.3。將1ml樣品溶液冷凍干燥，干粉樣品放入真空干燥器中干燥一天。冰凍干燥這一步驟大概要損失活性20％，這個現(xiàn)象也曾見報道。然后，在相對濕度為0％、避光條件下分別保溫于4℃和25℃，測定儲存0、2、4、6月后樣品的DNaseI活性；同時為了檢驗rHuDNaseI在較高溫度下的穩(wěn)定性，我們將樣品也保溫于60℃，測定儲存0、2、4、6周后樣品的DNaseI活性。對表達子2表達的rHuDNaseI重組蛋白的檢測結果顯示，在4℃和25℃兩種溫度環(huán)境中，rHuDNaseI無論在是否添加糖類輔料的情況下均很穩(wěn)定，保存6個月，依然保持著起始時90％以上的活性(圖11-a、圖11-b)；在高溫60℃環(huán)境中，所有添加的糖類輔料均對保持樣品rHuDNaseI活性具有重要作用。無糖類添加時60℃保存6周，rHuDNaseI活性降低至起始時的一半左右；而在樣品中添加蔗糖、海藻糖或者菊粉時，在60℃保存6周，rHuDNaseI活性依然能夠保持在起始時的90％左右(圖11-c)。轉化子1和轉化子3～4的表達蛋白的穩(wěn)定性與此相似，無顯著差異。實施例8霧化過程對rHuDNaseI活性的影響以1mg/mLrHuDNaseI(實施例4純化的表達子2表達的蛋白)，0.15mg/mLCaCl2·2H2O，8.77mg/mLNaCl，pH7.2為霧化配方配制rHuDNaseI溶液，裝入小型藥用噴霧器。噴霧過程中，以一玻璃板擋在前方，收集噴霧后的溶液，比較噴霧前后的rHuDNaseI活性濃度。經測定，噴霧后的rHuDNaseI活性濃度和噴霧前的幾乎相同，證明噴霧過程可能對rHuDNaseI活性沒有影響。轉化子1和轉化子3～4的表達蛋白的穩(wěn)定性與此相似，無顯著差異。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3