本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種煙草akt1基因及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鉀離子通道是允許鉀離子特異通透質(zhì)膜的離子通道，而阻礙其他離子通透-特別是鈉離子。這些通道一般由兩部分組成：一部分是通道區(qū)，選擇并允許鉀離子通過，而阻礙鈉離子；另一部分是門控開關(guān)，根據(jù)環(huán)境中的信號(hào)而開關(guān)通道。

現(xiàn)有技術(shù)對(duì)于鉀離子通道基因的研究在模式植物擬南芥中比較廣泛，例如，研究表明擬南芥鉀通道基因akt1編碼一個(gè)內(nèi)向整流通道，可以形成同源多聚體，主要在擬南芥根的表皮和皮層細(xì)胞中表達(dá)(bassetetal.,1995；lagardeetal.,1996)；akt1負(fù)責(zé)介導(dǎo)擬南芥根細(xì)胞從土壤中吸收鉀營養(yǎng)，akt1的功能缺失造成akt1突變體植株k⁺吸收能力降低，從而使得akt1突變體冠部的k⁺含量顯著降低，導(dǎo)致幼苗在低鉀脅迫下表現(xiàn)出冠部失綠黃化的低鉀敏感表型(lagardeetal.,1996；hirschetal.,1998；spaldingetal.,1999；xuetal.,2006)。

煙草是一種耗鉀量很大的作物，煙葉鉀含量是衡量煙葉品質(zhì)的的重要指標(biāo)，目前，對(duì)于煙草中鉀離子通道的研究較少，煙草akt1的功能未知。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供煙草akt1基因及其制備方法和應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種煙草akt1基因，所述akt1基因的序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述akt1基因的制備方法，包括以下步驟：設(shè)計(jì)pcr擴(kuò)增引物，所述的pcr擴(kuò)增引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的核苷酸序列為：5’-atgccgttgccagagacaccga-3’，所述的反向引物的核苷酸序列為5’-tcaaaagatatacaagcgatc-3’；提取煙草細(xì)胞總rna；合成煙草細(xì)胞的cdna；以所述煙草細(xì)胞cdna為模板進(jìn)行akt1基因的pcr擴(kuò)增，得到目的片段，測(cè)序后得到akt1基因序列。

優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)是以ncbireferencesequence:

xm_009802835.1為參考序列，使用軟件primer5設(shè)計(jì)得到的，所述

xm_009802835.1的核苷酸序列如seqidno.2所示。

優(yōu)選的，所述的pcr擴(kuò)增的體系為20μl體系，包括premixextaq10μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，煙草細(xì)胞cdna1μl，ddh2o8μl。

優(yōu)選的，所述的pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35個(gè)循環(huán)。

優(yōu)選的，所述的目的片段在測(cè)序之前還包括，將所述目的片段導(dǎo)入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，驗(yàn)證為陽性克隆后進(jìn)行測(cè)序。

優(yōu)選的，所述菌落pcr驗(yàn)證使用的正向引物核苷酸序列為：5’-atgccgttgccagagacaccga-3’，菌落pcr驗(yàn)證使用的反向引物核苷酸序列為：5’-tcaaaagatatacaagcgatc-3’。

優(yōu)選的，所述菌落pcr驗(yàn)證的體系為10μl，包括premixextaq5μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，ddh2o4μl。

本發(fā)明還提供了一種煙草akt1基因在促進(jìn)煙草植株鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)方面的應(yīng)用。

優(yōu)選的，將所述的煙草akt1基因轉(zhuǎn)入到煙草植株中，使akt1基因超量表達(dá)以提高煙草植株的煙葉中鉀離子的含量。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的akt1基因，是通過同源克隆的方法制備獲得的，所述的akt1基因全長1908bp，經(jīng)功能驗(yàn)證，本發(fā)明提供的akt1基因轉(zhuǎn)入鉀吸收缺陷型酵母突變株r5421后的重組酵母具有鉀離子吸收，轉(zhuǎn)運(yùn)功能。本發(fā)明實(shí)施例中，3個(gè)akt1基因轉(zhuǎn)基因煙草葉中鉀離子的質(zhì)量含量分別是1.61％，1.63％和1.65％，非轉(zhuǎn)基因的煙草葉中鉀離子的質(zhì)量含量是0.84％，轉(zhuǎn)基因的煙草葉中鉀離子的含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因的，可見，煙草植株中超量表達(dá)akt1基因可促進(jìn)煙草對(duì)鉀離子的吸收。因此，本發(fā)明提供的akt1基因具有促進(jìn)鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。

附圖說明

圖1為實(shí)施例2中akt1基因轉(zhuǎn)入鉀吸收缺陷型酵母突變株r5421后的重組酵母在鉀離子濃度為0mm和2mm的培養(yǎng)基上的生長情況；其中圖1a為鉀離子濃度為0mm的培養(yǎng)基上的生長情況，圖1b為鉀離子濃度為2mm的培養(yǎng)基上的生長情況；

圖中，1為轉(zhuǎn)入akt1基因的重組酵母，2為陰性對(duì)照p416，3為陽性對(duì)照；從左到右依次為原液、10倍稀釋液、100倍稀釋液在培養(yǎng)基上的生長結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種煙草akt1基因，所述煙草鉀離子通道基因的序列如seqidno.1所示，本發(fā)明中所述的akt1基因全長1908bp。

本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述煙草akt1基因的制備方法，包括以下步驟：設(shè)計(jì)pcr擴(kuò)增引物；提取煙草細(xì)胞總rna；合成煙草細(xì)胞cdna；以所述煙草細(xì)胞cdna為模板進(jìn)行akt1基因的pcr擴(kuò)增，得到目的片段，測(cè)序后得到akt1基因序列。

本發(fā)明中，所述的pcr擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)，是以ncbireferencesequence:xm_009802835.1為參考序列，使用軟件primer5設(shè)計(jì)得到的，所述xm_009802835.1的序列如seqidno.2所示。

在本發(fā)明中，所述的pcr擴(kuò)增引物優(yōu)選包括正向引物和反向引物，所述的正向引物核苷酸序列為：5’-atgccgttgccagagacaccga-3’，長度為22bp；所述反向引物的核苷酸序列為5’-tcaaaagatatacaagcgatc-3’，長度為21bp。

本發(fā)明在進(jìn)行akt1基因的pcr擴(kuò)增之前，提取煙草細(xì)胞總rna，并將提取得到的總rna反轉(zhuǎn)錄為cdna。在本發(fā)明中，所述的煙草細(xì)胞總rna的提取采用本領(lǐng)域常用的提取細(xì)胞總rna的技術(shù)方案即可，本發(fā)明的實(shí)施例中具體的可采用trizol法。在本發(fā)明中，所述的煙草細(xì)胞總rna提取的原料為煙草的新鮮葉片，所述煙草采用為本領(lǐng)域常規(guī)的煙草品種，本發(fā)明實(shí)施例中，所述煙草品種為k326。

本發(fā)明在提取得到煙草細(xì)胞總rna后，將所述煙草細(xì)胞總rna反轉(zhuǎn)錄合成cdna。本發(fā)明中，所述的cdna的合成，采用本領(lǐng)域常規(guī)的cdna的合成方法即可，無其他特殊要求；具體的本發(fā)明實(shí)施例中采用takara公司的cdna合成試劑盒完成cdna的合成。

本發(fā)明在得到cdna之后，進(jìn)行akt1基因pcr擴(kuò)增，得到目的片段。在本發(fā)明中，所述akt1基因pcr擴(kuò)增的體系優(yōu)選為20μl體系，包括premixextaq10μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，煙草細(xì)胞cdna1μl，ddh2o8μl。在本發(fā)明中，所述akt1基因的pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序優(yōu)選為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明在akt1基因pcr擴(kuò)增得到目的片段后，將所述目的片段進(jìn)行測(cè)序，得到akt1基因。本發(fā)明在所述的pcr擴(kuò)增后優(yōu)選的對(duì)目的片段進(jìn)行純化，本發(fā)明對(duì)所述純化的方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的dna純化試劑盒進(jìn)行即可。

本發(fā)明在所述純化完成后，優(yōu)選將所述純化后的目的片段導(dǎo)入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，驗(yàn)證為陽性克隆后進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明在得到陽性克隆后，優(yōu)選的采用菌落pcr的方法來驗(yàn)證陽性克隆。在本發(fā)明中，所述菌落pcr的正向引物核苷酸序列為：5’-atgccgttgccagagacaccga-3’，反向引物核苷酸序列為：5’-tcaaaagatatacaagcgatc-3’；所述菌落pcr的體系為10μl，包括premixextaq5μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，ddh2o4μl。在本發(fā)明中，所述的將純化后的目的片段導(dǎo)入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞所采用的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法，具體的在本發(fā)明實(shí)施例中采用以下方法：將所述目的片段與pmd19-t載體在16℃的條件下連接10～14h，得到連接產(chǎn)物；將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌dh5α；將所述的轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌dh5α接種于涂有氨芐青霉素的lb平板上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，得到陽性克隆。

本發(fā)明在菌落pcr驗(yàn)證陽性克隆后，優(yōu)選的，從已驗(yàn)證的陽性克隆中隨機(jī)選取2～4個(gè)獨(dú)立的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，得到所述的akt1基因的序列?；赼kt1基因的鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)性能，本發(fā)明還提供了一種煙草akt1基因在促進(jìn)煙草植株鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)方面的應(yīng)用。本發(fā)明將所述的煙草akt1基因轉(zhuǎn)入到煙草植株中，使akt1基因超量表達(dá)以提高煙草植株的煙葉中鉀離子的含量。在本發(fā)明中，將所述的煙草akt1基因轉(zhuǎn)入到煙草植株的方法優(yōu)選的為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的akt1基因及其功能驗(yàn)證方法進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

取0.5g煙草新鮮葉片，采用trizol法提取煙草細(xì)胞的總rna，然后采用takara公司的cdna合成試劑盒合成cdna，進(jìn)一步采用primer5.0軟件設(shè)計(jì)并經(jīng)過人工優(yōu)化得到引物，所述引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列為：5’-atgccgttgccagagacaccga-3’，所述的反向引物的序列為5’-tcaaaagatatacaagcgatc-3’，以合成的cdna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增體系為為20μl體系，包括premixextaq10μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，煙草細(xì)胞cdna1μl，ddh2o8μl；所述的pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35個(gè)循環(huán)。

pcr擴(kuò)增完成后，使用dna純化試劑盒進(jìn)行目的片段的純化，將純化后的目的片段與pmd19-t載體16℃連接12h得到連接產(chǎn)物，將所述得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞得到轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌dh5α，將所述的轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌dh5α接種于涂有氨芐青霉素的lb平板上進(jìn)行篩選培養(yǎng)得到陽性克隆。在得到陽性克隆后，采用菌落pcr的方法來驗(yàn)證陽性克隆，所述菌落pcr的正向引物為：5’-atgccgttgccagagacaccga-3’，反向引物為：5’-tcaaaagatatacaagcgatc-3’；所述菌落pcr的體系為10μl，包括premixextaq5μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，ddh2o4μl。然后從已驗(yàn)證的陽性克隆中隨機(jī)選取3個(gè)獨(dú)立的陽性克隆送到生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，本發(fā)明在測(cè)序后得到所述的akt1基因的序列，如seqidno.1所示。

實(shí)施例2

將連接有實(shí)施例1中所述的akt1基因的t-載體與表達(dá)載體p416分別進(jìn)行雙酶切(酶切位點(diǎn)為：xbaⅰ和smaⅰ)，回收目的基因和表達(dá)載體p416，然后用連接酶連接，將連接后的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α的感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌單菌落進(jìn)行pcr擴(kuò)增、酶切來驗(yàn)證是否構(gòu)建成功，將構(gòu)建成功的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到r5421中具體步驟如下：用接菌環(huán)取保存的r5421酵母菌劃線于固體培養(yǎng)基ypda上，28℃培養(yǎng)12h；挑取r5421酵母單菌落于ep管中，加1mlypda培養(yǎng)液渦旋；將上述菌液全部轉(zhuǎn)入裝有ypda培養(yǎng)液的三角瓶中，于30℃，250rpm搖菌至od600＝1.2，16h；按1:10轉(zhuǎn)接，搖至od600＝1.0～1.2；于28℃，1000rpm離心5min集菌，用1/2體積的滅菌超純水重懸；于28℃，1000rpm離心5min集菌，吸干上清；依次加入下列成分(每5ml原始菌液)：

渦旋1min，使轉(zhuǎn)化體系完全混勻；放于30℃的水浴中溫育30min；再放入42℃的水浴中熱擊28min，冰上冷卻10min；7000rpm離心15s，棄上清；用1ml的無菌水輕輕重懸沉淀；取200μl轉(zhuǎn)化混合物鋪于營養(yǎng)缺陷型平板上；30℃培養(yǎng)3天。提取酵母質(zhì)粒并鑒定結(jié)果

挑取酵母單克隆于加kcl的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至飽和；

收集菌液1.5ml，離心，棄上清，用200μl酵母提取液重懸沉淀；

加入0.45mm的無菌玻璃珠(promega)剛好低于液面，渦旋1min，加入200μl的酚/氯仿，再渦旋1min，離心取上清至另一新離心管中，再加入200μl的酚/氯仿，離心取上清；用60μl3m的naac和400μl無水乙醇，于-20℃沉淀dna，30min。離心，干燥，將質(zhì)粒溶于15μl無菌水，進(jìn)行pcr鑒定。

挑取鑒定過的酵母單菌落在營養(yǎng)缺陷平板上劃線，30℃培養(yǎng)3天；用牙簽在營養(yǎng)缺陷平板上蘸取少量菌體于2ml營養(yǎng)缺陷液中培養(yǎng)12h；8000rpm離心1min收集菌體；棄上清，用1ml雙蒸水懸浮菌體，8000rpm離心1min；棄上清，用1ml雙蒸水重懸浮，調(diào)od600為0.8；將未稀釋菌液及分別稀釋10倍、100倍后的菌液，分別取5ul在鉀離子濃度為0，2mm的培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天觀察結(jié)果。

結(jié)果如圖1b所示，在鉀離子濃度為0mm培養(yǎng)基上，陰性對(duì)照p416幾乎不生長，本發(fā)明鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體和陽性對(duì)照akt1均可以生長，且生長明顯比p416好。隨著稀釋倍數(shù)的增加，鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體及陽性對(duì)照akt1仍然可以生長。

上述結(jié)果證明，本發(fā)明所述的akt1基因具有鉀吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

實(shí)施例3

使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將akt1基因轉(zhuǎn)入到煙草中使其超量表達(dá)得到轉(zhuǎn)基因煙草t1代，在得到轉(zhuǎn)基因煙草t1代后，使轉(zhuǎn)基因煙草t1自然繁殖得到轉(zhuǎn)基因煙草t2代，使用火焰光度計(jì)法對(duì)3個(gè)株系超量表達(dá)該基因的t2代轉(zhuǎn)基因煙草葉片進(jìn)行鉀含量測(cè)定，結(jié)果表明3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系鉀質(zhì)量含量分別是1.61％.1.63％，1.65％，而同一條件下非轉(zhuǎn)基因煙草葉片中鉀離子的質(zhì)量含量是0.84％，3個(gè)株系轉(zhuǎn)基因材料的鉀含量明顯高于非轉(zhuǎn)基因材料，說明該基因超量表達(dá)后能夠促進(jìn)煙草對(duì)鉀的吸收。

由以上實(shí)施例可知，本發(fā)明所述的akt1基因具有促進(jìn)鉀吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。