本發(fā)明涉及一種玉米花粉發(fā)育調(diào)控基因Ms33及其編碼蛋白序列，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：植物的生殖生長(zhǎng)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，從造孢細(xì)胞到成熟的生殖細(xì)胞要經(jīng)歷數(shù)十個(gè)發(fā)育階段，任何一個(gè)發(fā)育階段出現(xiàn)異常都會(huì)造成生殖生長(zhǎng)的停滯并導(dǎo)致植物育性的喪失。配子體發(fā)育是植物生殖生長(zhǎng)中的重要階段，植物雄配子體的非正常發(fā)育會(huì)導(dǎo)致無法形成花粉或花粉生育力喪失，這一現(xiàn)象稱為雄性不育（MaleSterile）。因此對(duì)雄性不育的研究有助于理解復(fù)雜的植物生殖生長(zhǎng)過程。玉米（ZeamaysL.）是我國(guó)重要的禾本科糧食作物，因?yàn)槠浯菩弁戤惢ǖ奶攸c(diǎn)而被視作植物生殖生長(zhǎng)的理想研究對(duì)象。此外，具有雄性不育性的玉米自交系應(yīng)用于雜交育種和商業(yè)化種子生產(chǎn)中，具有不需要人工去雄、種子純度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠大幅降低科研育種和商業(yè)化種子生產(chǎn)的成本，提高育種效率。本發(fā)明提供了一種控制玉米花粉發(fā)育基因的DNA序列、啟動(dòng)子序列及該基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該基因的功能缺失會(huì)造成玉米的雄花敗育，由此可以產(chǎn)生新的雄性不育材料，在科研和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種新的調(diào)控玉米花粉發(fā)育基因Ms33的DNA序列、cDNA序列、啟動(dòng)子序列和該基因所編碼功能蛋白的氨基酸序列，所述基因是一種植物雄穗特異性表達(dá)基因，所述基因功能的缺失會(huì)特異性導(dǎo)致玉米雄花不育。本發(fā)明的第一個(gè)發(fā)明目的是：提供一種調(diào)控玉米花粉發(fā)育的新基因Ms33，其特征在于，是選自如下1）或2）或3）的DNA分子。1）SEQIDNO.1所示DNA分子（克隆自玉米自交系B73的基因組DNA）：該DNA分子由2198個(gè)核苷酸組成，-119至-1為核苷酸為5’端非翻譯區(qū)（5’-UTR），第+1至+705位核苷酸為第一外顯子，+706至+836位核苷酸為內(nèi)含子，+837至+1709位核苷酸為第二外顯子，+1710至+2079位核苷酸為3’端非翻譯區(qū)（3’-UTR）。2）SEQIDNO.2所示的DNA分子（克隆自玉米自交系B73的cDNA）。3）在SEQIDNO.1基礎(chǔ)之上經(jīng)過一至數(shù)個(gè)堿基替換和\或一至數(shù)個(gè)堿基的插入和\或缺失以及大片段的核苷酸序列插入\缺失\移位\倒位所形成能夠影響植物花粉生育能力的DNA分子。本發(fā)明的第二個(gè)發(fā)明目的是：提供上述基因所編碼的調(diào)控植物花粉發(fā)育的相關(guān)蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因編碼如下1）或2）所述的蛋白質(zhì)。1）序列表的SEQIDNO.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。2）將序列表的SEQIDNO.3經(jīng)過一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的取代、和/或缺失、和/或添加且具有影響植物花粉發(fā)育功能相關(guān)活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的第三個(gè)發(fā)明目的是：提供在植物雄花器官中調(diào)節(jié)所述基因序列轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列如SEQIDNO.4所示DNA序列，該序列具有在植物雄花器官中特異啟動(dòng)如SEQIDNO.1所述基因序列轉(zhuǎn)錄的功能。序列表的SEQIDNO.4為所述基因的啟動(dòng)子序列，總長(zhǎng)1429個(gè)核苷酸對(duì)應(yīng)圖6.A所示基因結(jié)構(gòu)-1至-1429位，所述啟動(dòng)子含有第1368bp-1371bp核苷酸的CAAT框（CAATbox）對(duì)應(yīng)圖6.A所示基因結(jié)構(gòu)-61至-58，第1371bp-1375bp核苷酸的TATA框（TATAbox）對(duì)應(yīng)圖6.A所示基因結(jié)構(gòu)-58至-54，啟動(dòng)子的必要區(qū)域包括TATA框和CCAAT框的-54位至-61位，-1至-82區(qū)域是特別必要區(qū)域。本發(fā)明的第四個(gè)發(fā)明目的是：提供含有所述基因和/或啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。本發(fā)明的第五個(gè)發(fā)明目的是：提供上述基因用于轉(zhuǎn)基因改良作物的用途。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述基因用于誘導(dǎo)作物植株雄性不育，以便導(dǎo)入外源基因以獲得優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因作物。在另一具體實(shí)施方案中，所述作物是自花授粉或異花授粉作物。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方案中，所述作物包括但不限于玉米、大麥、高粱、谷子、水稻。本發(fā)明的第六個(gè)發(fā)明目的是：提供了一種在其它植物中獲取Ms33基因的直系同源基因的方法，以及利用該方法獲高粱（Sorghumbicolor）、谷子（Setariaitalica）、大麥（Hordeumvulgare）、水稻（Oryzasativa）的氨基酸序列（圖10）。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明提供的玉米花粉發(fā)育調(diào)控基因Ms33直接參與小孢子時(shí)期的發(fā)育調(diào)控，該基因的表達(dá)受到抑制后，小孢子細(xì)胞壁發(fā)育受到抑制，同時(shí)花藥表皮細(xì)胞發(fā)生降解，并最終導(dǎo)致在小孢子發(fā)育末期的凋亡和花器官的雄性不育現(xiàn)象。通過植物生物技術(shù)途徑，本發(fā)明在農(nóng)作物的雜種優(yōu)勢(shì)利用和不育化雜交種制種生產(chǎn)中都將發(fā)揮重要作用。術(shù)語(yǔ)定義術(shù)語(yǔ)“調(diào)控植物花粉發(fā)育的基因”指一段具有編碼蛋白能力的核苷酸序列，該序列特異編碼具有調(diào)控植物花粉發(fā)育功能的蛋白活性多肽，如SEQIDNO.2的第83-1660位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)并序列”是指，位于SEQIDNO.2的編碼框第83-1660位核苷酸序列中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQIDNO.2的第83-1660位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQIDNO.2所編碼的氨基酸序列。所述“調(diào)控植物花粉發(fā)育的基因”，還包括在中度嚴(yán)格條件下，更佳的在高度嚴(yán)格條件下可以與SEQIDNO.2的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。其中，中度嚴(yán)格條件可以是0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS（w/v）的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜的條件。所述“調(diào)控植物花粉發(fā)育的基因”，還包括與SEQIDNO.2中從第83-1660位核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地具有至少80%、82%、85%、86%、88%、89%同源性，更佳地具有至少90%、91%、92%、93%、94%同源性，最佳地具有至少95%、96%、97%、98%、99%同源性的核苷酸序列。所述“調(diào)控植物花粉發(fā)育的基因”，還包括能編碼具有與天然的調(diào)控玉米花粉發(fā)育基因Ms33基因相同功能蛋白的、SEQIDNO.2開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：1個(gè)或幾個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’-UTR或3’-UTR端添加1至數(shù)個(gè)核苷酸。所述“調(diào)控植物花粉發(fā)育的基因”，還包括能夠翻譯一類具備調(diào)控玉米花粉發(fā)育功能的氨基酸序列，如SEQIDNO.3的氨基酸序列。該類氨基酸序列還包括具有與天然調(diào)控玉米花粉發(fā)育蛋白相同功能的SEQIDNO.3的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：1個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸。在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能；在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。另外，所述的“調(diào)控植物花粉發(fā)育的基因”的核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本實(shí)施例公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。通常是將其克隆入載體，然后細(xì)胞轉(zhuǎn)化等常規(guī)方法從增殖的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入實(shí)施例蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，實(shí)施例蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成多肽而加以生產(chǎn)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用人工或自動(dòng)進(jìn)行，可以分別化學(xué)合成實(shí)施例蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)分子。附圖說明圖1為野生型和玉米突變體ms33-6029的小花在抽雄期的形態(tài)觀察示意圖：圖A，正?？捎仓辏╓T）的小花和不育突變體（ms33-6029）的雄穗形態(tài)比較；圖B，正常可育植株（WT）的小花和不育突變體（ms33-6029）的小花形態(tài)比較；圖C和D，可育株（WT，C）和突變體（ms33-6029，D）的花粉經(jīng)1%KI-I2染色結(jié)果比較。圖2為Ms33基因的遺傳定位結(jié)果：基因被定位在玉米2號(hào)染色體（標(biāo)記EP97和bnlg1893之間）。圖3為Ms33基因的物理定位結(jié)果：基因被精細(xì)定位在一個(gè)349Kb的物理區(qū)間內(nèi)（標(biāo)記EP603和EP605之間），矩形所示為區(qū)間內(nèi)的功能基因，黑色框代表候選基因GRMZM2G070304。圖4為分子標(biāo)記苗期鑒定可育株和純合不育株的電泳圖：利用EP198引物擴(kuò)增目的條帶大小為500bp，隱性純合體為上帶，顯性純合體為下帶，雜合體為雙帶；利用EP605引物擴(kuò)增目的條帶大小為750bp，隱性純合體為下帶，顯性純合體為上帶，雜合體為雙帶。圖5為利用引物1和引物2在基因組DNA中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，經(jīng)濃度2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定不育突變特異的分子量條帶（黑色箭頭標(biāo)注為可育基因型和不育基因型的特異擴(kuò)增條帶）：M，DNALadder；1-2，ms33-6029突變體（基因型ms33-6029/ms33-6029）；3-4，野生型（基因型Ms33/Ms33）。圖6為野生型與突變體中Ms33的基因結(jié)構(gòu)示意圖：A，Ms33基因在野生型B73中的基因結(jié)構(gòu)，由2198個(gè)核苷酸組成，-119至-1為核苷酸為5’端非翻譯區(qū)（5’-UTR），第+1至+705位核苷酸為第一外顯子，+706至+836位核苷酸為內(nèi)含子，+837至+1709位核苷酸為第二外顯子，+1710至+2079位核苷酸為3’端非翻譯區(qū)（3’-UTR）；B，Ms33基因在突變體ms33-6029中的基因結(jié)構(gòu)示意圖，在第一外顯子+223與+224位之間插入了一個(gè)長(zhǎng)度為1368bp的轉(zhuǎn)座子（DTA_ZM00216），使得該突變基因翻譯提前終止。圖7為Ms33基因預(yù)測(cè)編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列在野生型B73和突變體ms33-6029的比較結(jié)果，紅色下劃線注為L(zhǎng)ysophospholipidacyltransferases(LPLAT)結(jié)構(gòu)域。圖8為Ms33基因在B73中的半定量反轉(zhuǎn)錄PCR的表達(dá)譜分析：EV，早期大液泡小孢子時(shí)期雄穗；MV，中期大液泡小孢子時(shí)期雄穗；LV，后期大液泡小孢子時(shí)期雄穗；Root，根；Stem，莖；Leaf，葉片；Tassel（雄穗）標(biāo)注的三個(gè)泳道代表檢測(cè)樣品來自不同時(shí)期雄穗總RNA轉(zhuǎn)錄的cDNA。圖9為利用半定量RT-PCR對(duì)Ms33基因在純合不育突變體ms33-6029/ms33-6029和純合可育Ms33/Ms33（WT）植株在不同發(fā)育時(shí)期雄穗中表達(dá)量差異的分析結(jié)果：Q，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂四分體時(shí)期雄穗；EV，早期大液泡小孢子時(shí)期雄穗。圖10為玉米Ms33基因翻譯的氨基酸序列與其在大麥、高粱、谷子、水稻中直系同源基因翻譯產(chǎn)物的比較結(jié)果，紅色下劃線標(biāo)注為保守的Lysophospholipidacyltransferases(LPLAT)結(jié)構(gòu)域。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明的應(yīng)用范圍。下述實(shí)施例中的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)，如無特殊說明，均為本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。除非有相反指明，本發(fā)明所使用或提及的技術(shù)均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。所述試驗(yàn)材料，如無特別注明，均為本發(fā)明領(lǐng)域通用的試驗(yàn)材料。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。材料、方法和實(shí)施例謹(jǐn)作闡述用，而非加以限制。本發(fā)明所述的雄性不育，特指由植物細(xì)胞核基因發(fā)生功能變化導(dǎo)致植物雄花發(fā)育出現(xiàn)異常（無法產(chǎn)生雄花、花藥或者正常的雄性配子體）并出現(xiàn)育性的喪失，即通常所說的雄性核不育（Genicmalesterility）而非細(xì)胞質(zhì)核不育（Cytoplasmicmalesterility）。雄花育性的異常和恢復(fù)均由細(xì)胞核內(nèi)的基因加以控制。因此，本發(fā)明也包括利用序列表所述序列調(diào)控植株的雄配子生育能力，即利用本發(fā)明提供的基因序列在基因組、和/或轉(zhuǎn)錄組、和/或蛋白質(zhì)組水平影響其它植物中相同或同源基因的功能來達(dá)到控制雄花育性的目的。例如，下述方法但不限于下述方法：通過天然序列的變異導(dǎo)致基因表達(dá)抑制或蛋白質(zhì)功能的喪失、通過向植物中轉(zhuǎn)入所述基因的反義序列或引入發(fā)卡結(jié)構(gòu)、或?qū)⑺龌蚺c其它序列（DNA或RNA）相結(jié)合產(chǎn)生新的具有功能活性的DNA或RNA鏈，來影響或改變植物基因的功能?；蚱渌绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的可用于影響植物雄花育性的技術(shù)方法中的任何一種技術(shù)方法。本發(fā)明包括玉米Ms33基因，其顯性等位基因?qū)χ参镄刍ㄓ跃哂嘘P(guān)鍵作用，功能缺失性的隱性等位基因會(huì)導(dǎo)致雄性不育。該基因位于玉米2號(hào)染色體，其基因具體位置如圖2、圖3所示。該基因序列及其同源序列可從任何顯花植物中獲得，包括但不限于玉米（Zeamays）、普通小麥（Triticumaestivum）、高粱（Sorghumbicolor）、水稻（Oryzasativa）、短柄草（Brachypodiumdistachyon）、谷子（Setariaitalica）、大麥（Hordeumvulgare）、黑麥（Secalecereale）、粗山羊草（Aegilopstauschii）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）、甘藍(lán)（Brassicaoleracea）、大豆（Glycinemax）、番茄（Lycopersiconesculintum）等。獲得方法包括但不限于：通過玉米Ms33基因序列利用blastx、blastn或通過氨基酸序列利用blastp從其它植物的基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)、和/或cDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)、和/或蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)??；以Ms33基因的DNA或cDNA或RNA序列為參考序列設(shè)計(jì)引物，直接從其它植物的基因組DNA或cDNA或RNA中利用PCR的方法直接獲得；以玉米Ms33的基因序列設(shè)計(jì)探針，利用核酸雜交的方法從基因組文庫(kù)中分離含有同源基因序列的DNA或cDNA或RNA片段?！癕s33基因同源序列”指在與SEQIDNO.3的氨基酸進(jìn)行blastx比較分析后，Identities大于或等于35%、Positives大于或等于50%，且識(shí)別區(qū)域位于SEQIDNO.3的314至482位氨基酸即Lysophospholipidacyltransferases(LPLAT)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的植物基因的DNA序列。進(jìn)行blastx時(shí)，所有參數(shù)均遵照http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/所示的默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行。下文通過說明和闡述提供了更為詳細(xì)的描述，但這并非意欲對(duì)本發(fā)明的范圍加以限制。實(shí)施例1.Ms33基因突變體的鑒定和基因精細(xì)定位雄性不育是由于控制雄花發(fā)育的基因發(fā)生變異導(dǎo)致雄花敗育，通常表現(xiàn)為沒有雄花或雄花花藥干癟、花藥中沒有花粉或只有有少量非正常發(fā)育的花粉。與育性正常的植株的雄花相比，ms33-6029突變植株（天然突變體，選自專利權(quán)人單位北京首佳利華科技有限公司收集的玉米育種材料）的雄花花藥不外露（圖1.A），花藥嚴(yán)重退化（圖1.B），經(jīng)過1%KI-I2花粉染色，野生型花粉可以正常染色（圖1.C），突變體無花粉不能染色（圖1.D），從而表明ms33-6029突變體是一個(gè)無花粉型雄性不育突變體。以昌7-2為父本、隱性不育突變體ms33-6029為母本，構(gòu)建了F2分離群體。2013年夏季種植于北京通州育種基地。按上述性狀特征對(duì)其進(jìn)行育性調(diào)查，選取了228株表現(xiàn)雄性不育表型的單株作為不育基因池，采用集團(tuán)分離分析法（Bulk-segregantanalysis，BSA）對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行遺傳分析。已有研究表明，ms33位點(diǎn)位于2號(hào)染色體長(zhǎng)臂（參考文獻(xiàn)1-4）。基于maizeGDB（http://www.maizegdb.org/）中標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)信息，從40對(duì)SSR標(biāo)記中篩選出5個(gè)在ms33-6029與昌7-2間有多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記（表1，第1-5行），通過對(duì)228株不育單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳分析，檢測(cè)不育基因與標(biāo)記的連鎖關(guān)系。結(jié)果顯示這5個(gè)分子標(biāo)記在不育基因池中超過60%的單株表現(xiàn)出與不育基因供體ms33-6029一致的基因型（表2），表明這5個(gè)標(biāo)記與ms33位點(diǎn)緊密連鎖。表1.基因定位引物序列表。序號(hào)引物名稱正向序列反向序列1mmc0381GTGGCCCTGTTGATGAGCGACGAGTACCAGGCAT2bnlg1940CCTTTTGTTTCAGGCCGTTACAGCAGCCTGATGATGAACA3umc1230GTACGACCGTTGAAACTGTTGTTTTGCGATTTCAACTATTTGTGGTAAAGG4umc1551CACCGGAACACCTTCTTACAGTTTCGAAACCTTCTCGTGATGAGC5umc2214CTGGATGAGGAGGAAGAATACGAGACCCCCTGATTCTCTCTTACGTTT6umc1252GCGTCGGAGAAGTACATCAAGTTTCTTCTGCATCATCATCATCGTCTT7bnlg1893AATCCTGTAGCGTGTGTCCCTAACTGAGTTGTTGAAGGAAATTG8EP95AACCTAGCAGTGGTCGTTGGGACGTAGTTCTGTCCAGCCC9EP97CGAGATGACGTTGAAACACGTGTGAAAGTTGGCATTGACC10EP198AGCCTCGATTCCTTCATCCGGCAGTAAAGCCACTACAACAGG11EP603GAAGCACTCAATCGAGCCGCATAGAAGCCCTTACACAC12EP605GGCACTCATGGTCAACAACTCGAAATTCAGATTGCAGG13EP480CAACAAAGCTAGGATTCCTCGATACAGCCCCTTGAGGTCCA表2.多態(tài)性標(biāo)記與ms33不育位點(diǎn)的連鎖關(guān)系分析。標(biāo)記名稱：mmc0381bnlg1940umc1230umc1551umc2214不育基因池ms33-6029基因型比例64.47%66.23%70.18%77.63%60.96%2013年冬季在海南南繁基地種植了F2群體（916株），對(duì)其進(jìn)行育性調(diào)查，可育表型和不育表型單株比例為681:235，符合3:1的單基因分離比（χ2=0.087，P=0.7681）?；诒?信息從maizeGDB中調(diào)取了mmc0381至umc2214之間的9對(duì)多態(tài)標(biāo)記（含umc0381和umc2214，表1第1-9行）對(duì)該F2群體單株進(jìn)行了基因型鑒定，構(gòu)建了ms33區(qū)間的遺傳連鎖圖譜，并根據(jù)單株的育性數(shù)據(jù)初步將ms33定位于EP97與bnlg1893之間11.5cM的區(qū)間內(nèi)（圖2）。進(jìn)一步調(diào)取B73基因組序列設(shè)計(jì)了4對(duì)多態(tài)標(biāo)記EP198、EP603、EP605和EP480（表1第10-13行），最終將ms33定位在EP603和EP605之間約349Kb的物理區(qū)間內(nèi)。從MaizeGDB調(diào)取B73的基因組序列，在去除假基因和轉(zhuǎn)座子序列后，在該249Kb區(qū)間共有15個(gè)功能基因（圖3），其中一個(gè)預(yù)測(cè)為GPAT家族基因GRMZM2G070304具有與花器官發(fā)育相關(guān)的功能。有文獻(xiàn)報(bào)道GPAT基因家族參與花器官的發(fā)育和形態(tài)建成，因此選取該基因作為Ms33的候選基因進(jìn)行后續(xù)分析。實(shí)施例2.Ms33基因在野生型和突變體中的克隆首先，利用Ms33的緊密連鎖分子標(biāo)記EP198和EP605,通過PCR和電泳分析，可以在苗期區(qū)分野生型和突變體的基因型（圖4）。其次，利用引物1（5’-GGGATAACCTAAAGCAAGGC-3’）和引物2（5’-GCACCGCAGAGATACAATAAAG-3’）可在B73和Ms33位點(diǎn)的隱性突變體ms33-6029中特異克隆GRMZM2G070304基因（圖5）。同時(shí)用引物3（5’-AGTAGACACCGCCCAATCTC-3’）和引物2在B73的花器官cDNA中擴(kuò)增全長(zhǎng)編碼區(qū)對(duì)上述基因組中的擴(kuò)增片段進(jìn)行驗(yàn)證。所有PCR擴(kuò)增均使用KODFXDNAPolymerase（TOYOBOCO.，LTD.LifeScienceDepartment，Osaka，Japan），并按照產(chǎn)品說明的反應(yīng)體系和條件，在Bio-radMyCyclerPCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過測(cè)序，并且與玉米B73基因組序列信息比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)2198bp（SEQIDNO.1），其在玉米基因組內(nèi)為單拷貝基因。通過野生型B73中的基因組序列（SEQIDNO.1）、cDNA序列（SEQIDNO.2）的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該基因的基因組序列結(jié)構(gòu)特征如下（圖6A）：含有2個(gè)外顯子（Exon）和1個(gè)內(nèi)含子（Intron），-119至-1為核苷酸為5’端非翻譯區(qū)（5’-UTR），第+1至+705位核苷酸為第一外顯子，+706至+837位核苷酸為內(nèi)含子，+837至+1709位核苷酸為第二外顯子，+1710至+2079位核苷酸為3’端非翻譯區(qū)（3’-UTR）。此外，對(duì)純合突變體ms33-6029中的Ms33基因測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)Ms33突變基因ms33-6029全長(zhǎng)3566bp，通過與MazieTransposableElementDatabase（maizetedb.org/~maize/）進(jìn)行blastn分析發(fā)現(xiàn)，在第一個(gè)外顯子+223處插入了一個(gè)長(zhǎng)為1368bp的轉(zhuǎn)座子（DTA_ZM00216），基因翻譯在+288處即已經(jīng)停止（圖6B）。實(shí)施例3.Ms33基因在野生型B73和突變體ms33-6029中編碼蛋白的序列差異在野生型B73中，Ms33基因的蛋白質(zhì)編碼序列長(zhǎng)1578bp，通過對(duì)該基因cDNA序列（SEQIDNO.2）進(jìn)行模擬翻譯，發(fā)現(xiàn)該基因編碼一個(gè)525個(gè)氨基酸的蛋白，將該蛋白序列與GenBankSwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastx分析，顯示該蛋白含有一個(gè)Lysophospholipidacyltransferases(LPLAT)保守結(jié)構(gòu)域（第314-482位氨基酸，如圖7所示）；在突變體ms33-6029中，由于在Ms33基因序列223位核苷酸的轉(zhuǎn)座子插入（圖6B黑色剪頭標(biāo)注處）導(dǎo)致了第75位氨基酸后發(fā)生改變，編碼蛋白僅含有95個(gè)氨基酸，并且使突變體編碼的蛋白不再具有任何功能結(jié)構(gòu)域（圖7）。這表明Ms33基因在突變體中的序列變異直接導(dǎo)致了翻譯氨基酸的序列變化和翻譯的提前終止，特別是基因的LPLAT結(jié)構(gòu)域被破壞。Ms33基因的功能缺失型突變體ms33-6029表現(xiàn)雄配子的敗育，這證明了具有SEQIDNO.1所述DNA序列的Ms33基因具有控制玉米雄性生育力的功能，當(dāng)SEQIDNO.1、2所示序列發(fā)生一至數(shù)個(gè)堿基替換和\或一至數(shù)個(gè)堿基的插入和\或缺失以及大片段的核苷酸序列插入\缺失\移位\倒位導(dǎo)致SEQIDNO.1的序列結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化時(shí)，將導(dǎo)致玉米雄性生育力的喪失。實(shí)施例4.Ms33基因在B73及突變體中的轉(zhuǎn)錄水平分析分別采集B73各個(gè)發(fā)育時(shí)期雄穗，每個(gè)完整雄穗取一半經(jīng)液氮速凍保存，用于提取雄穗小花的總RNA，剩余雄穗的小花在卡諾固定液（酒精：冰乙酸＝3:1）中固定48小時(shí)，再經(jīng)1%醋酸洋紅（1g洋紅溶于100ml45%醋酸）染色進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)觀察，確定準(zhǔn)確的發(fā)育時(shí)期。選取處于減數(shù)分裂四分體時(shí)期（Quartets，Q）、早期大液泡小孢子期（Early-vacuolatemicrospore，EV）、中期大液泡小孢子期（Mid-vacuolatemicrospore，MV）、晚期大液泡小孢子期（Late-vacuolatemicrosoire，LV）四個(gè)雄穗發(fā)育時(shí)期的B73雄穗的小花總RNA用于Ms33基因的表達(dá)譜分析，另外提取B73減數(shù)分裂期植株的葉片、莖、根的總RNA，用于分析基因在不同組織中的表達(dá)水平。使用實(shí)施例1所述緊密連鎖標(biāo)記EP198、EP605在苗期鑒定純合隱性ms33-6029位點(diǎn)的不育單株和相同遺傳背景下攜帶雜合Ms33/ms33-6029位點(diǎn)的可育植株（圖4），用相同方法分別提取不育株和可育植株的減數(shù)分裂四分體時(shí)期、早期大液泡小孢子期、中期大液泡小孢子期、晚期大液泡小孢子期四個(gè)雄穗發(fā)育時(shí)期的雄穗小花總RNA（所有雄穗均提前經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)觀察，確定準(zhǔn)確的發(fā)育時(shí)期）。每一個(gè)樣本均采取半定量反轉(zhuǎn)錄PCR（Semi-quantitativeReverseTranscriptionPCR，qRT-PCR）進(jìn)行Ms33基因的表達(dá)量檢測(cè)。qRT-PCR以ZmActin基因作為內(nèi)參報(bào)告基因，引物4（5’-GCAGAGATGGTGAAGAAGGC-3’）和引物5（5’-ACACCATCGGCTTTGGGTA-3’）用于特異檢測(cè)Ms33基因和ms33-6029突變基因的表達(dá)水平，引物OGF49（5’-GGCCACAAGCTGCTCAACCT-3’）、OGF50（5’-ATGTGGTTGCCCAGGGACTT-3’）用于檢測(cè)ZmActin基因的表達(dá)。RT-PCR中每個(gè)樣品的Ms33基因和ZmActin基因的PCR反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。一、Ms33基因在B73中的表達(dá)譜分析Ms33基因是一個(gè)雄穗特異表達(dá)基因，且僅在特定的生理時(shí)期（發(fā)育期雄穗）行使功能。qRT-PCR結(jié)果顯示，除雄穗（主要是早期大液泡小孢子期的雄穗）外，在其它組織中均未檢測(cè)到Ms33基因的表達(dá)（圖8）。二、Ms33基因在突變體中的差異表達(dá)檢測(cè)在四分體和早期大液泡小孢子時(shí)期，Ms33基因在ms33-6029突變體中的表達(dá)明顯被抑制，qRT-PCR的結(jié)果如圖9所示：Ms33基因在純合不育的ms33-6029植株中的表達(dá)均顯著低于同時(shí)期攜帶純合Ms33/Ms33位點(diǎn)的可育植株，ms33-6029突變體中Ms33基因的表達(dá)量非常微弱。實(shí)施例5.Ms33基因在玉米、高粱、谷子、水稻、大麥中的同源性分析如前文所述，Ms33基因在玉米中特異調(diào)控雄穗的配子體發(fā)育。當(dāng)其功能被抑制時(shí)將導(dǎo)致玉米雄配子體育性喪失即雄性不育。利用Ms33基因的cDNA序列，通過blastx在genebank獲得了該基因在高粱、谷子、水稻、大麥中的直系同源基因（編號(hào)分別為：XM_002449936.1、XM_004979921、Os11g45400、AK376456）。如圖10所示，Ms33基因在玉米、高粱、谷子、水稻、短柄草的314-482位氨基酸表現(xiàn)出高度保守性，而這一區(qū)域正是LPLAT結(jié)構(gòu)域的位置，在314位以前和482位以后的氨基酸變異較大。據(jù)此可以判斷，Ms33在其它植物中同樣存在，并且在關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域上保持保守性的特點(diǎn)。即該基因?qū)χ参锉３终５男叟渥由Χ跃哂嘘P(guān)鍵作用，是必不可少的，當(dāng)基因發(fā)生序列變異時(shí)會(huì)極大地影響植物的雄配子育性。實(shí)施例6、Ms33基因的啟動(dòng)子克隆使用引物6（5’-ATACTGTGTGCCTGCTGCCTAC-3’）和引物7（5’-CAAGTTGGTGAGATGGAATAGG-3’）的組合能夠從野生型B73中擴(kuò)增出Ms33基因的上游基因組序列1429bp，該序列如SEQIDNO.4所示。在該序列的第1368-1371位核苷酸具有CAAT框（CAATbox），第1371-1375位核苷酸具有TATA框（TATAbox），具有啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄的功能。此外，通過在線順式調(diào)控元件預(yù)測(cè)工具PlantCARE（網(wǎng)址鏈接為http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)該啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除了上述的CAAT框和TATA框外，還具有一系列順式作用元件，如ABRE（+46位）、ARE（+60位）、CAT-Box（+946位）、CRTCA-box（+1117位）、G-box（+48位）、GAG-box（+199、+439位）、GARE-box（+1109、+853位）、GATA-box（+317、+422位）、GATT-box（+674位）、HSE（+211位）、I-box（+317、+347位）、L-box（+1347位）、MRE（+251位）、O2-site（+344位）、skn-1motif（+1219位）、sp1（+536位）和TGACG-motif（+885位）等，分別響應(yīng)于逆境、激素、光、熱等誘導(dǎo)因素，初步證明該啟動(dòng)子序列可以調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。相關(guān)文獻(xiàn)1、Beadle，GW(1932)Genesinmaizeforpollensterility.Genetics，17:413-431。2、Albertsen，MCandPhillips，RL(1981)Developmentalcytologyof13geneticmalesterilelociinmaize.CanJGenetCytol，23:195-208。3、李競(jìng)雄、周洪生、孫榮錦等（1998）玉米雄性不育生物學(xué)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)出版社。4、吳鎖偉、方才臣、鄧聯(lián)武、萬(wàn)向元（2012）玉米隱性核雄性不育基因研究進(jìn)展及其育種應(yīng)用途徑分析，分子植物育種(網(wǎng)絡(luò)版)，10：1001-1011。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3