本發(fā)明涉及一種從微生物發(fā)酵液中分離或純化洛伐他汀或其藥學上可接受的鹽的方法。
背景技術(shù)：
洛伐他汀(Lovastatin)又叫做艾樂汀，其化學名為化學名稱：(S)-2-甲基丁酸-(1S，3S，7S，8S，8aR)-1，2，3，7，8，8a-六氫-3，7-二甲基-8-{2-[(2R，4R)-4-羥基-6氧代-2-四氫，具體結(jié)構(gòu)式如下：
洛伐他汀為第一代他汀類物質(zhì)，現(xiàn)在多被用來作為他汀類活性藥物普伐他汀的前體，因此洛伐他汀的收率和質(zhì)量直接影響著普伐他汀的成本和純度。
現(xiàn)有提取制備洛伐他汀的方法主要是將發(fā)酵液加熱、堿化過濾，然后對濾液進行萃取或?qū)V液進行樹脂交換提取，采用大孔樹脂吸附結(jié)合柱層析的工藝存在操作繁瑣、提取成本高、生產(chǎn)周期長、收率低等問題，逐漸被溶媒萃取的方法所取代。
但是溶媒萃取法也存在著缺陷。PCT專利申請WO 9720834闡述了一種洛伐他汀提取方法，將發(fā)酵液用NaOH調(diào)到堿性，然后用甲苯和乙醇混合溶媒在攪拌下萃取，在萃取液中加入大量的甲苯和珍珠巖，用硝酸酸化，攪拌下加氯仿，壓濾，濃縮，結(jié)晶得粗品再重結(jié)晶。此法使用混合溶媒，回收困難，使用多種溶媒使生產(chǎn)操作變得復雜；同時在提取過程中2次pH調(diào)節(jié)至11以上，一次至pH值2左右，調(diào)節(jié)過于頻繁，并且對于設(shè)備的耐酸和耐堿提出了過高要求，容易腐蝕設(shè)備。
在PCT專利申請WO 0063411提供了一種新方法：用NaOH調(diào)發(fā)酵液至堿性，在低溫下攪拌，離心分離，收集上清用硫酸調(diào)至酸性，加入丁酯和正辛烷的混合溶媒萃取，離心分離，萃取液真空濃縮低溫結(jié)晶。此發(fā)明中仍然使用混合溶媒萃取，回收困難，堿性萃取乳化嚴重，需使用大量的破乳劑，給后面的精制過程帶來了困難；并且將調(diào)節(jié)pH值的次數(shù)降低至2次，但是仍然是強酸和強堿都出現(xiàn)，仍然對于設(shè)備的耐酸和耐堿提出了過高要求，容易腐蝕設(shè)備。
美國專利US 2003215932(A1)闡述的洛伐他汀提取方法是將發(fā)酵液用硫酸酸化并加熱，在高溫下攪拌環(huán)化，然后對發(fā)酵液用甲苯萃取，濾渣用碳酸氫鈉液和無鹽水洗滌，然后進行真空濃縮，低溫結(jié)晶分離，洗滌。在提取工藝的最初就對發(fā)酵液就進行環(huán)化操作，需要加熱的發(fā)酵液體積龐大，幾乎是在整體提取工藝體積最大的階段，并且發(fā)酵液中還含有強氧化性硫酸，需要消耗大量的能源并且容易腐蝕設(shè)備。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種收率高的、節(jié)能、適應大規(guī)模生產(chǎn)的從微生物發(fā)酵液中分離提取洛伐他汀或其藥學上可接受的鹽的方法。
本發(fā)明創(chuàng)造性的在萃取菌渣前，引入吹干菌渣的步驟，發(fā)現(xiàn)該步驟可以顯著的提高洛伐他汀粗品的收率。過濾后的菌渣殘留水、溶于水的一些親水雜質(zhì)和容易揮發(fā)的雜質(zhì)等，這些雜質(zhì)會直接影響后期的萃取和環(huán)化效率，延長環(huán)化和萃取工藝的時間。菌渣吹干過程中，溶于水的一些親水雜質(zhì)和容易揮發(fā)的雜質(zhì)等隨著水蒸氣被移除，另外，吹干后的菌渣重量減少，可以減少后續(xù)萃取中使用有機溶劑和用于洗滌的溶液的用量。
具體的，本發(fā)明從發(fā)酵液中分離或純化洛伐他汀或其藥學上可接受的鹽的方法包括以下步驟：
(1)取洛伐他汀發(fā)酵液，在攪拌狀態(tài)下慢慢加入濃硫酸將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到1.0-5.0；
(2)過濾，菌渣吹干至菌渣含水量為10％-70％；
(3)在菌渣中加入有機溶劑，浸泡，過濾，向濾液中加入濾液體積10％的1.0％-5.0％的NaHCO3溶液，分出水層，保留有機層；
(4)將有機層進行濃縮，濃縮液降溫攪拌，結(jié)晶；洛伐他汀的環(huán)化反應在濃縮時進行；
(5)過濾，并用10-20℃的冷乙酸乙酯洗滌過濾得到的粗品晶體，在40℃-50℃左右烘干粗品晶體得到洛伐他汀粗品。
優(yōu)選的，所述步驟(1)中濃硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至3.0-4.0。
更優(yōu)選的，所述步驟(1)中濃硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至3.5-4.0。
優(yōu)選的，步驟(2)中菌渣吹干使用的是室溫空氣吹干。
優(yōu)選的，所述步驟(3)中有機溶劑為疏水性有機溶劑，選自但是不限于乙酸丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、己酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯、苯甲醇中的一種或者幾種。
優(yōu)選的，所述步驟(3)中有機溶劑的加入量與菌渣的投放比例為，有機溶劑的總投入量相當于菌渣總投入量的1.0-10.0倍(V/W)。
更優(yōu)選的，所述步驟(3)中有機溶劑的加入量與菌渣的投放比例為，有機溶劑的總投入量相當于菌渣總投入量的4.0-6.0倍(V/W)。
最優(yōu)選的，所述步驟(3)中有機溶劑的加入量與菌渣的投放比例為，有機溶劑的總投入量相當于菌渣總投入量的4.5倍(V/W)。
優(yōu)選的，所述步驟(4)中有機層濃縮的溫度控制在40℃-85℃。
優(yōu)選的，所述步驟(4)中有機層濃縮的條件控制為氣壓為-0.080MPa，溫度為55℃，濃縮時間為10小時。
優(yōu)選的，所述步驟(4)中有機層濃縮的條件控制為氣壓為大氣壓時，溫度為85℃，濃縮時間為40小時。
優(yōu)選的，所述步驟(4)中濃縮液降溫攪拌時，攪拌速度為150rpm，攪拌時間為6-8個小時?？刂茢嚢杷俣仍谳^低的范圍，延長攪拌時間，使得晶體生長變慢，得到體積大的粗品晶體，便于下面的過濾步驟。
本發(fā)明從發(fā)酵液中離或純化洛伐他汀或其藥學上可接受的鹽的方法包括以下步驟：
(1)取洛伐他汀發(fā)酵液，在攪拌狀態(tài)下慢慢加入濃硫酸將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到3.5-4.0；
(2)過濾，菌渣吹干至菌渣含水量為40-50％；
(3)在菌渣中加入菌渣重量4.0-6.0倍的乙酸乙酯浸泡5-6小時進行過濾，向濾液中加入濾液體積10％的1％的NaHCO3溶液，濾液靜置后分出水層；
(4)將萃取濾液進行濃縮，濃縮時氣壓為-0.080MPa以上，溫度為55℃，濃縮進行10個小時，濃縮至產(chǎn)品量5-7倍的小體積，接著將濃縮液的降溫攪拌，結(jié)晶；
(5)過濾，并用10-20℃的冷乙酸乙酯洗滌粗品晶體，烘干粗品晶體得到洛伐他汀粗品。
現(xiàn)有的文獻資料公開了發(fā)酵液預處理時，可以加酸或者加堿，加酸時pH值調(diào)節(jié)至1.0-5.0左右，加堿時pH值調(diào)節(jié)至12.0左右。根據(jù)實際生產(chǎn)設(shè)備狀況，發(fā)明人選擇進行加酸處理，并且經(jīng)過反復試驗發(fā)現(xiàn)pH值越低，洛伐他汀溶解增加，但是當pH低于3.5時，洛伐他汀的溶解增加變得緩慢，并且pH值越低對設(shè)備的腐蝕性越大，增加設(shè)備折舊，增大生產(chǎn)成本。因此發(fā)明人選擇將pH值調(diào)節(jié)至3.5-4.0左右，平衡收率與生產(chǎn)成本的關(guān)系。
本發(fā)明涉及的從發(fā)酵液中離或純化洛伐他汀或其藥學上可接受的鹽的方法，在提取初期對發(fā)酵液進行了pH值調(diào)節(jié)，之后的提取步驟皆是在pH值接近中性的條件下進行，整套流程中僅調(diào)節(jié)一次pH值，不僅節(jié)約了酸堿試劑，并且減輕了對設(shè)備的腐蝕。另外，提取過程中使用單一溶媒乙酸乙酯，便于溶媒的回收；同時乙酸乙酯添加僅出現(xiàn)在萃取和洗滌粗品晶體，而菌渣吹干后再添加乙酸乙酯，乙酸乙酯的整體添加量少。
本發(fā)明創(chuàng)造性的在發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH值至酸性時或者萃取時，沒有進行升溫環(huán)化步驟，而是去掉升溫環(huán)化的步驟，縮短了萃取所需的時間。
具體實施方式
以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例1
實驗組1(參照CN 102344446)
發(fā)酵液1L，用5mol/L HCl調(diào)至pH1.5，攪拌沉化1小時，過濾，收集菌渣，向在菌渣中加入0.25L丁酯，在溫度55℃條件下攪拌萃取菌渣3小時，分離，收集萃取液，保溫在30℃，加50ml 0.5mol/LNaOH攪拌洗滌30分鐘，靜置15分鐘去除水相，有機相加入50ml 0.5mol/L HCl，攪拌洗滌30分鐘，靜置15分鐘去除水相，有機相加入50ml去離子水，攪拌洗滌30分鐘，靜置15分鐘去除水相，有機相進行真空濃縮(溫度65-70℃，真空度小于0.08MPa)至體積約30ml，降溫到12℃，保溫3小時，離心分離并干燥得粗品。
實驗組2(參照US5712130)
1L洛伐他汀的發(fā)酵液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3-5，降低溫度至低于20度，加入500ml乙酸丁酯提取4個小時，離心保留有機相，丟棄水相和菌渣。有機相在減壓條件下40度左右濃縮至體積為50ml，在濃縮的同時發(fā)生環(huán)化，濃縮液冷卻至溫度低于20度，靜置數(shù)小時得到結(jié)晶的洛伐他汀，將洛伐他汀重新結(jié)晶。
實驗組3(參照US2003215932A)
在1L發(fā)酵液中加入63.5ml 2N硫酸，pH至2.0，升溫至50-55度，攪拌22小時。
894.1mL甲苯萃取發(fā)酵液，有機相萃取液用157.6mL 5％碳酸氫鈉和78.8mL雙蒸水洗滌，洗滌過的有機相萃取液在40-60度下真空濃縮至23.5mL；濃縮液冷卻至5-8度，攪拌2h，過濾，濾餅用15.3mL預冷至5-10度的甲苯洗滌，濾餅干燥，獲得洛伐他汀。
實驗組4
取1L洛伐他汀發(fā)酵液，在攪拌狀態(tài)下慢慢加入濃硫酸將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到3.5-4.0。
過濾，菌渣吹干至菌渣含水量為50％。
在菌渣中加入菌渣重量4.5倍的乙酸乙酯浸泡5小時進行過濾，過濾完成后，向濾液中加入濾液體積10％的1％的NaHCO3溶液，將濾液靜置1.5小時后分出水層，保留有機相。
將有機相進行濃縮，濃縮時氣壓為-0.080Mpa以上，55℃左右進行10h，濃縮至產(chǎn)品量的5倍小體積，接著將濃縮液的溫度降至10℃，攪拌保溫6小時，攪拌速度為150rpm，結(jié)晶。
過濾，并用15℃的冷乙酸乙酯洗滌粗品晶體，在40℃左右烘干粗濕品得到洛伐他汀粗品。
實驗組5
取10L洛伐他汀發(fā)酵液，在攪拌狀態(tài)下慢慢加入濃硫酸將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到3.5-4.0，
過濾，菌渣吹干至菌渣含水量為50％。
在菌渣中加入菌渣重量5.0倍的乙酸乙酯，升溫至85℃，保溫環(huán)化，環(huán)化完成后，進行過濾，將濾液靜置后分出水層，保留有機相。
將有機相進行濃縮，接著將濃縮液的溫度降至10℃，攪拌保溫6小時，攪拌速度為150rpm，結(jié)晶。
過濾，并用15℃的冷乙酸乙酯洗滌粗品晶體，在40℃右烘干粗濕品得到洛伐他汀粗品。
實驗組6
取1L洛伐他汀發(fā)酵液，在攪拌狀態(tài)下慢慢加入濃硫酸將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到3.5-4.0，
過濾，菌渣吹干至菌渣含水量為50％。
在菌渣中加入菌渣重量5.0倍的乙酸乙酯浸泡5小時進行過濾，并用少量乙酸乙酯洗滌菌渣，過濾完成后，將濾液靜置1小時后分出水層，保留有機相。
將有機相進行濃縮，濃縮時氣壓為-0.080Mpa以上，55℃左右進行10h，濃縮至產(chǎn)品量的5倍小體積，，接著將濃縮液的溫度降至10℃，攪拌保溫6小時，攪拌速度為150rpm，結(jié)晶。
過濾，并用15℃的冷乙酸乙酯洗滌粗品晶體，在40℃左右烘干粗濕品得到洛伐他汀粗品。
實驗1-6的實驗結(jié)果見表1。
表1、實驗1-6洛伐他汀粗品收率列表
結(jié)論：從以上表格粗品洛伐他汀收率和純度的實驗數(shù)據(jù)可以看出，實驗組4的洛伐他汀粗品收率達到了86％，遠高于實驗組1-3、5-6的洛伐他汀粗品收率。實驗組1-3、5-6為對比實施例，其中實驗組6為在實驗組4的基礎(chǔ)上，去掉“向濾液中加入濾液體積10％的1％的NaHCO3溶液”步驟，為說明加入NaHCO3溶液洗滌的有益效果；而實驗組5為在實驗組6的基礎(chǔ)上進一步將濃縮階段的環(huán)化步驟移至萃取同時進行的實驗方案，為說明環(huán)化步驟的位置改變對實驗方案的影響，而實驗組4為本發(fā)明所述方法，因此，本發(fā)明所述方法優(yōu)于對比實施例的方法，大幅度提升了美伐他汀粗品收率。
實施例2
取1L洛伐他汀發(fā)酵液，在攪拌狀態(tài)下慢慢加入濃硫酸將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到3.5-4.0。
過濾，菌渣吹干。
在菌渣中加入菌渣重量5.0倍的乙酸乙酯浸泡5小時進行過濾，過濾完成后，向濾液中加入濾液體積10％的1％的NaHCO3溶液，將濾液靜置1小時后分出水層，保留有機相。
將有機相進行濃縮，濃縮時氣壓為-0.080Mpa以上，55℃左右進行10h，濃縮至產(chǎn)品量的5倍小體積，接著將濃縮液的溫度降至10℃，攪拌保溫6小時，攪拌速度為150rpm，結(jié)晶。
過濾，并用15℃的冷乙酸乙酯洗滌粗品晶體，在40℃左右烘干粗濕品得到洛伐他汀粗品。
吹干菌渣含水量至5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％，90％(未經(jīng)吹干菌渣)，實驗結(jié)果見表2。
表2、菌渣含水量對洛伐他汀提取的影響
結(jié)論：從以上表格可以看出，菌渣吹干，減少菌渣含水量可以降低加入乙酸乙酯的量、萃取時間，并且可以提高收率和純度。吹干菌渣有利于提高提取效率。
菌渣含水量進一步降低至低于50％時，乙酸乙酯加入量和萃取時間仍會繼續(xù)隨著菌渣含水量降低而減少，收率和純度隨著菌渣含水量降低而增加緩慢或者不增加。說明菌渣含水量不高于50％時，進一步降低菌渣含水量僅會減少乙酸乙酯加入量和萃取時間，收率和純度并不會再顯著提升；而含水量越低，需要吹干的時間延長，會增加生產(chǎn)時間，因此發(fā)明人確定將菌渣吹干至菌渣含水量為40-50％為最佳的生產(chǎn)條件。
實施例3
取1L洛伐他汀發(fā)酵液，在攪拌狀態(tài)下慢慢加入濃硫酸將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到3.5。
過濾，菌渣吹干至菌渣含水量40％。
在菌渣中加入菌渣重量4.0倍的乙酸乙酯浸泡5小時進行過濾，過濾完成后，向濾液中加入濾液體積10％的1％的NaHCO3溶液，將濾液靜置1小時后分出水層，保留有機相。
將有機相進行濃縮，濃縮在減壓下55度左右進行10h，接著將濃縮液的溫度降至5℃，攪拌保溫6小時，攪拌速度為150rpm，結(jié)晶。
過濾，并用15℃的冷乙酸乙酯洗滌粗品晶體，在40℃左右烘干粗濕品得到洛伐他汀粗品。
實施例4
取1L洛伐他汀發(fā)酵液，在攪拌狀態(tài)下慢慢加入濃硫酸將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到3.5。
過濾，菌渣吹干至菌渣含水量50％。
在菌渣中加入菌渣重量6.0倍的乙酸乙酯浸泡5小時進行過濾，過濾完成后，向濾液中加入濾液體積10％的1％的NaHCO3溶液，將濾液靜置1小時后分出水層，保留有機相。
將有機相進行濃縮，濃縮在減壓下40度左右進行10h，接著將濃縮液的溫度降至5℃，攪拌保溫6小時，攪拌速度為150rpm，結(jié)晶。
過濾，并用10℃的冷乙酸乙酯洗滌粗品晶體，在50℃左右烘干粗濕品得到洛伐他汀粗品。
實施例5
取1L洛伐他汀發(fā)酵液，在攪拌狀態(tài)下慢慢加入濃硫酸將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到4.0。
過濾，菌渣吹干至菌渣含水量為50％。
在菌渣中加入菌渣重量5.0倍的乙酸乙酯浸泡5小時進行過濾，過濾完成后，向濾液中加入濾液體積10％的1％的NaHCO3溶液，將濾液靜置1.5小時后分出水層，保留有機相。
將有機相進行濃縮，濃縮時氣壓為-0.080Mpa以上，55℃左右進行10h，濃縮至產(chǎn)品量的5倍小體積，，接著將濃縮液的溫度降至10℃，攪拌保溫6小時，攪拌速度為150rpm，結(jié)晶。
過濾，并用15℃的冷乙酸乙酯洗滌粗品晶體，在40℃左右烘干粗濕品得到洛伐他汀粗品。
實施例6
取1L洛伐他汀發(fā)酵液，在攪拌狀態(tài)下慢慢加入濃硫酸將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到3.5-4.0。
過濾，菌渣吹干至菌渣含水量為10％。
在菌渣中加入菌渣重量1.0倍的乙酸丁酯浸泡5小時進行過濾，過濾完成后，向濾液中加入濾液體積10％的5.0％的NaHCO3溶液，將濾液靜置1.5小時后分出水層，保留有機相。
將有機相進行濃縮，濃縮時氣壓為-0.080Mpa以上，55℃左右進行10h，濃縮至產(chǎn)品量的7倍小體積，，接著將濃縮液的溫度降至10℃，攪拌保溫6小時，攪拌速度為150rpm，結(jié)晶。
過濾，并用20℃的冷乙酸丁酯洗滌粗品晶體，在50℃左右烘干粗濕品得到洛伐他汀粗品。
實施例7
取1L洛伐他汀發(fā)酵液，在攪拌狀態(tài)下慢慢加入濃硫酸將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到3.5-4.0。
過濾，菌渣吹干至菌渣含水量為70％。
在菌渣中加入菌渣重量10.0倍的甲苯浸泡5小時進行過濾，過濾完成后，向濾液中加入濾液體積10％的1.0％的NaHCO3溶液，將濾液靜置1.5小時后分出水層，保留有機相。
將有機相進行濃縮，濃縮時氣壓為-0.080Mpa以上，55℃左右進行10h，濃縮至產(chǎn)品量的7倍小體積，，接著將濃縮液的溫度降至10℃，攪拌保溫6小時，攪拌速度為150rpm，結(jié)晶。
過濾，并用20℃的冷甲苯洗滌粗品晶體，在50℃左右烘干粗濕品得到洛伐他汀粗品。
實施例8
取1L洛伐他汀發(fā)酵液，在攪拌狀態(tài)下慢慢加入濃硫酸將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到3.5-4.0。
過濾，菌渣吹干至菌渣含水量為50％。
在菌渣中加入菌渣重量4.5倍的乙酸乙酯浸泡5小時進行過濾，過濾完成后，向濾液中加入濾液體積10％的1％的NaHCO3溶液，將濾液靜置1.5小時后分出水層，保留有機相。
將有機相進行濃縮，濃縮時氣壓為-0.080Mpa以上，55℃左右進行10h，濃縮至產(chǎn)品量的5倍小體積，接著將濃縮液的溫度降至10℃，攪拌保溫6小時，攪拌速度為150rpm，結(jié)晶。
過濾，并用15℃的冷乙酸乙酯洗滌粗品晶體，在40℃左右烘干粗濕品得到洛伐他汀粗品。
將粗品溶解于丙酮，加熱至55℃，并使用活性炭脫色，過濾除去活性炭，降溫至10℃，保溫2小時，結(jié)晶，過濾結(jié)晶液，40-50℃左右烘干，獲得洛伐他汀成品。獲得的洛伐他汀成品收率為82.0％，色譜純度為99.3％。