本發(fā)明屬于寄生蟲DNA的提取方法，特別屬于釘螺線粒體基因組DNA的提取方法。

背景技術(shù)：

釘螺作為日本血吸蟲的唯一中間宿主，分布容易受到水質(zhì)、水溫、氣候等各種因素影響，從而產(chǎn)生地理隔離，使不同地理群體甚至同域分布的群體產(chǎn)生多個種型。因此，釘螺種內(nèi)和種群間遺傳多態(tài)性現(xiàn)狀、種群間基因流強度、種群間遺傳變異與分化成為了防治血吸蟲病工作中的重點。與核基因組相比，線粒體基因組具有其獨特的遺傳特性，如母系遺傳、缺乏重組及進(jìn)化速率快等，故mtDNA對研究種群遺傳變異和分化具有重要意義。

對釘螺線粒體基因組DNA提取時，常用的提取方法有蔗糖密度梯度離心法、堿裂解法、Triton法、高鹽沉淀法和試劑盒等，這些提取方法存在著操作過程復(fù)雜，產(chǎn)率低，對人體有毒害，核DNA污染嚴(yán)重，試劑價格昂貴等缺點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡易高效釘螺線粒體基因組DNA的提取方法。

本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案為：一種簡易高效釘螺線粒體基因組DNA的提取方法，包括以下步驟：

a)研磨工序：

將單只釘螺去除螺殼和消化系統(tǒng)組織，取腹足肌肉組織2-3mg，放入研磨器中，加入50-100μl的勻漿液，上下研磨腹足肌肉組織1-2分鐘，得到含有肌肉組織的勻漿液，將含有肌肉組織的勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，再加入50-100μl的勻漿液，上下研磨腹足肌肉組織，重復(fù)2-3次，研磨至腹足肌肉成5～30μm的顆粒，最后用100μl的勻漿液沖洗研磨器，形成沖洗液，將數(shù)次研磨得到的含有肌肉組織的勻漿液與沖洗液合并，形成研磨好的勻漿液；

b)裂解工序：

將300-400μl研磨好的勻漿液放入400-800W微波爐中，功率選擇高火，加熱6-10分鐘后，冷卻至室溫；形成加熱勻漿液，向加熱勻漿液中加入15-20μl的SDS(終濃度1％)和10-15μl的蛋白酶K(終濃度300～400μg/ml)，混合均勻，升溫至60℃，保溫1h，降溫至37℃，保溫1h；再次升溫至60℃，保溫1h，降溫至37℃，保溫1h；形成裂解的勻漿液；

c)沉淀工序：

將300-400μl裂解的勻漿液中加入300μl的醋酸鉀(PH5.4)，上下輕輕顛倒8～10次，4℃下靜置30-60min，于4℃，14000r/min，離心10-20分鐘min，得到第1上清液；

取500-600μl的第1上清液于離心管中，再加入等體積醋酸鉀溶液，上下顛倒7～8次，4℃下靜置30-60min，于4℃，12000r/min，離心10-20min，得到第2上清液；

d)純化工序：

取900-1000ul的第2上清液于離心管；加入等體積的異丙醇，-20℃冷藏30-60min后，于4℃，14000r/min，離心15min，去上清；加入200-300μl 75％乙醇(體積濃度)進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌2次，將乙醇風(fēng)干后，用40-60μl雙蒸水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所述的勻漿液的pH為8.0，由以下物質(zhì)組成：25mmol/LTris-HCl，30mmol/L EDTANa₂，50mmol/L葡萄糖。

所述的SDS為20％十二烷基硫酸鈉，使用時用水稀釋至所需的濃度。

所述的蛋白酶K為10mg/mL蛋白酶K，使用時用水稀釋至所需的濃度。

所述的醋酸鉀溶液的PH為5.4，由以下的物質(zhì)組成：3mol/L醋酸鉀和2mol/L醋酸。

本發(fā)明具有以下的特點：

研磨工序：由于采用傳統(tǒng)勻漿器破碎法進(jìn)行研磨時存在著勻漿次數(shù)不易控制的問題，故將勻漿液分多次加入，在保證研磨效果的同時，有效減輕因勻漿過度而導(dǎo)致小片段核DNA污染mtDNA的問題。

裂解工序：將研磨好的勻漿液置于微波爐高溫裂解，目的是讓組織均勻分散，也讓細(xì)胞膜在一定程度上發(fā)生破裂，以提高裂解效率。在此基礎(chǔ)上，在蛋白酶K水浴消化過程中設(shè)置了溫度梯度，利用溫度的急劇改變釋放更多的線粒體基因組DNA，使mtDNA的產(chǎn)率得到了明顯提高。

純化工序：應(yīng)用醋酸鉀純化獲得的線粒體基因組DNA，去除了核DNA的污染，避免了酚、氯仿等有機物的毒害作用，也減少了在酚-氯仿抽提過程中造成的線粒體DNA損失，保證了高產(chǎn)率。

本發(fā)明所建立的一種簡易高效釘螺線粒體基因組DNA提取方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，通過高溫裂解、蛋白酶K變溫消化、醋酸鉀沉淀、純化步驟，提高了產(chǎn)率。本發(fā)明主要采用紫外分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳和PCR檢測等對提取的線粒體基因組DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。結(jié)果表明，本發(fā)明所提取的線粒體基因組DNA的純度和濃度已滿足于群體遺傳結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)演化、地理分布和構(gòu)建基因文庫等研究的要求。該方法的建立使提取釘螺等小型貝類線粒體基因組DNA過程更加簡便、高效。

附圖說明

圖1為實施例1提取的線粒體基因組DNA電泳檢測結(jié)果；

在圖中，M：DNA Marker-R(0.5kb-14kb)；A實施例1所制的線粒體基因組DNA；B蔗糖密度梯度離心法所制的線粒體基因組DNA；C高鹽沉淀法所制的線粒體基因組DNA；

圖2為實施例1所制的線粒體進(jìn)行Cox1基因和IT S序列片段擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

在圖中，M：DNA Marker-J 100+50bp；DNA；A、B泳道分別為Cox1基因、ITS基因。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細(xì)的說明。

所述的勻漿液的pH為8.0，由以下物質(zhì)組成：25mmol/LTris-HCl，30mmol/L EDTANa₂，50mmol/L葡萄糖。

所述的SDS為20％十二烷基硫酸鈉。

所述的蛋白酶K為10mg/mL蛋白酶K。

所述的醋酸鉀溶液的PH為5.4，由以下的物質(zhì)組成：3mol/L醋酸鉀和2mol/L醋酸。

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

實施例1：

一種簡易高效釘螺線粒體基因組DNA的提取方法，包括以下步驟：

a)研磨工序：

將單只釘螺去除螺殼和消化系統(tǒng)組織，取腹足肌肉組織2mg，放入研磨器中，加入50μl的勻漿液，上下研磨腹足肌肉組織1-2分鐘，得到含有肌肉組織的勻漿液，將含有肌肉組織的勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，再加入50μl的勻漿液，上下研磨腹足肌肉組織，重復(fù)3次，研磨至腹足肌肉成5～30μm的顆粒，最后用100μl的勻漿液沖洗研磨器，形成沖洗液，將數(shù)次研磨得到的含有肌肉組織的勻漿液與沖洗液合并，形成研磨好的勻漿液；

b)裂解工序：

將300μl研磨好的勻漿液放入400W微波爐中，功率選擇高火，加熱10分鐘后，冷卻至室溫；形成加熱勻漿液，向加熱勻漿液中加入15μl的SDS(終濃度1％)和10μl的蛋白酶K(終濃度300μg/ml)，混合均勻，升溫至60℃，保溫1h，降溫至37℃，保溫1h；再次升溫至60℃，保溫1h，降溫至37℃，保溫1h；形成裂解的勻漿液；

c)沉淀工序：

將300μl裂解的勻漿液中加入300μl的醋酸鉀(PH5.4)，上下輕輕顛倒8次，4℃下靜置30min，于4℃，14000r/min，離心10分鐘min，得到第1上清液；

取550μl的第1上清液于離心管中，再加入等體積醋酸鉀溶液，上下輕輕顛倒7次，4℃下靜置30min，于4℃，12000r/min，離心10-20min，得到第2上清液；

d)純化工序：

取950ul的第2上清液于離心管；加入等體積的異丙醇，-20℃冷藏30min后，于4℃，14000r/min，離心15min，去上清；加入200μl75％乙醇(體積濃度)進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌2次，將乙醇風(fēng)干后，用40μl雙蒸水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2：

一種簡易高效釘螺線粒體基因組DNA的提取方法，包括以下步驟：

a)研磨工序：

將單只釘螺去除螺殼和消化系統(tǒng)組織，取腹足肌肉組織2.5mg，放入研磨器中，加入80μl的勻漿液，上下研磨腹足肌肉組織1-2分鐘，得到含有肌肉組織的勻漿液，將含有肌肉組織的勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，再加入80μl的勻漿液，上下研磨腹足肌肉組織，重復(fù)2次，研磨至腹足肌肉成5～30μm的顆粒，最后用100μl的勻漿液沖洗研磨器，形成沖洗液，將數(shù)次研磨得到的含有肌肉組織的勻漿液與沖洗液合并，形成研磨好的勻漿液；

b)裂解工序：

將340μl研磨好的勻漿液放入400W微波爐中，功率選擇高火，加熱10分鐘后，冷卻至室溫；形成加熱勻漿液，向加熱勻漿液中加入20μl的SDS(終濃度1％)和15μl的蛋白酶K(終濃度400μg/ml)，混合均勻，升溫至60℃，保溫1h，降溫至37℃，保溫1h；再次升溫至60℃，保溫1h，降溫至37℃，保溫1h；形成裂解的勻漿液；

c)沉淀工序：

將350μl裂解的勻漿液中加入300μl的醋酸鉀(PH5.4)，上下輕輕顛倒8次，4℃下靜置30min，于4℃，14000r/min，離心10分鐘min，得到第1上清液；

取550μl的第1上清液于離心管中，再加入等體積醋酸鉀溶液，上下輕輕顛倒7次，4℃下靜置30min，于4℃，12000r/min，離心10-20min，得到第2上清液；

d)純化工序：

取950μl的第2上清液于離心管；加入等體積的異丙醇，-20℃冷藏30min后，于4℃，14000r/min，離心15min，去上清；加入200μl75％乙醇(體積濃度)進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌2次，將乙醇風(fēng)干后，用50μl雙蒸水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例3：

一種簡易高效釘螺線粒體基因組DNA的提取方法，包括以下步驟：

a)研磨工序：

將單只釘螺去除螺殼和消化系統(tǒng)組織，取腹足肌肉組織3mg，放入研磨器中，加入100μl的勻漿液，上下研磨腹足肌肉組織1-2分鐘，得到含有肌肉組織的勻漿液，將含有肌肉組織的勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，再加入100μl的勻漿液，上下研磨腹足肌肉組織，重復(fù)2次，研磨至腹足肌肉成5～30μm的顆粒，最后用100μl的勻漿液沖洗研磨器，形成沖洗液，將數(shù)次研磨得到的含有肌肉組織的勻漿液與沖洗液合并，形成研磨好的勻漿液；

b)裂解工序：

將400μl研磨好的勻漿液放入400W微波爐中，功率選擇高火，加熱10分鐘后，冷卻至室溫；形成加熱勻漿液，向加熱勻漿液中加入20μl的SDS(終濃度1％)和15μl的蛋白酶K(終濃度340μg/ml)，混合均勻，升溫至60℃，保溫1h，降溫至37℃，保溫1h；再次升溫至60℃，保溫1h，降溫至37℃，保溫1h；形成裂解的勻漿液；

c)沉淀工序：

將400μl裂解的勻漿液中加入300μl的醋酸鉀(PH5.4)，上下輕輕顛倒8次，4℃下靜置30min，于4℃，14000r/min，離心10分鐘min，得到第1上清液；

取550μl的第1上清液于離心管中，再加入等體積醋酸鉀溶液，上下輕輕顛倒7次，4℃下靜置30min，于4℃，12000r/min，離心10-20min，得到第2上清液；

d)純化工序：

取950μl的第2上清液于離心管；加入等體積的異丙醇，-20℃冷藏30min后，于4℃，14000r/min，離心15min，去上清；加入200μl75％乙醇(體積濃度)進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌2次，將乙醇風(fēng)干后，用60μl雙蒸水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例4：

紫外分光光度法是目前測定DNA濃度和純度的常用方法，其測定的結(jié)果準(zhǔn)確。當(dāng)?shù)贸鯝260/A280比值處于1.8～2.0之間時，表明mtDNA質(zhì)量較好；當(dāng)小于1.8時，說明有蛋白質(zhì)污染，當(dāng)大于2.0時，表明有RNA污染；

將實施例1所制的DNA與目前兩種常用的提取方法蔗糖密度梯度離心法和高鹽沉淀法進(jìn)行了比較。其中蔗糖密度梯度離心法按照(Tamura K,Aotsuka T.Rapid isolation method of animal mitochondrial DNA by the alkaline lysis procedure[J].Biochemical Genetics,1988,26(11-12):815-819.)提取，高鹽沉淀法按照(鄭潤玲,李家樂,牛東紅.縊蟶線粒體DNA提取方法的比較[J].分子科學(xué)學(xué)報:中英文版,2008,24(5):312-315.)提取線粒體基因組DNA。

所獲得的mtDNA樣品按1:100稀釋，用紫外分光光度儀測定光吸收度值。其結(jié)果如表1所示：

結(jié)果表明三種提取方法的OD值均處在1.8～2.0之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F＝0.008、1.076，P>0.05)；實施例1的產(chǎn)率優(yōu)于蔗糖密度梯度離心法和高鹽沉淀法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F＝24.686、16.428，P<0.05)，

實施例5：

瓊脂糖凝膠電泳法利用溴化乙錠(EB)可嵌入DNA分子堿基對間形成絡(luò)合物，經(jīng)紫外線照射后，通過條帶的亮度來粗略判斷mtDNA濃度和純度；

制備1％瓊脂糖凝膠，取3μl的線粒體基因組DNA樣品與3ul的loading Buffer(30mM EDTA，50％(v/v)Glycerol，0.25％(w/v)Xylene Cyanol FF，0.25％(w/v)Bromophenol Blue)進(jìn)行混合，80V 40min，凝膠成像儀成像并拍照。

其結(jié)果如圖1所示，三種提取方法提取的線粒體DNA條帶大小均約15kb，其中實施例1的提取效果最好，條帶較亮且點樣孔附近無明顯條帶，表明核DNA和蛋白質(zhì)污染較少。

實施例6：

將實施例1所提取的mtDNA Cox1基因和核基因的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增，檢測有無核DNA的污染。

擴(kuò)增Cox1基因引物和ITS序列引物參照已有文獻(xiàn)設(shè)計(表2)，以衡量線粒體DNA擴(kuò)增和核DNA污染情況。PCR反應(yīng)體系包含模板4μl，17μl超純水，25μl Mix(2×Taq PCR MasterMix)，引物F、R(1mmol/L)各2μL。PCR反應(yīng)條件：Cox1 94℃5min；94℃30s，51℃50s，72℃1min，循環(huán)34次；72℃延伸10min；ITS退火溫度為50℃，其他條件與Cox1相同，擴(kuò)增產(chǎn)物行1％瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外光下分析各條帶的亮度。

表2 擴(kuò)增Cox1、ITS基因的引物及序列

線粒體基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，Cox1基因擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜為700bp左右片段，送上海生物工程有限公司測序，將測序結(jié)果經(jīng)GenBank查詢，發(fā)現(xiàn)與湖北釘螺mtDNA Cox1基因同源性在99％，確定為線粒體基因。而ITS無明顯條帶，結(jié)果表明核基因含量較少。