本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種從結(jié)締組織分離的蛋白質(zhì)粗萃物及其方法與用途。

背景技術(shù)：

膠原蛋白是動物體內(nèi)非常重要的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞外空間的重要的結(jié)構(gòu)蛋白；膠原蛋白也是結(jié)締組織的主成分，也存在于肌腱、韌帶、皮膚、眼睛角膜等組織，約占動物體總蛋白質(zhì)量的20％～30％。

膠原蛋白是由三股獨(dú)立的膠原蛋白肽鏈、透過肽鏈上甘氨酸形成氫鍵，形成并維持三股螺旋互相纏繞的結(jié)構(gòu)，稱為原膠原。數(shù)個原膠原橫向堆積后，相互間會發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)而產(chǎn)生共價連接，成為膠原微纖維；數(shù)個膠原微纖維再經(jīng)過相似的反應(yīng)而產(chǎn)生共價鍵合，形成膠原纖維，而膠原纖維便是膠原蛋白進(jìn)行生理作用的基本型態(tài)。

膠原蛋白分為五種型，第一型膠原蛋白主要存在于皮膚、肌腱、器官及骨骼中；第二型膠原蛋白主要存在于軟骨中；第三型膠原蛋白為網(wǎng)紋纖維蛋白(reticulin)的主要成分；第四型膠原蛋白主要構(gòu)成基底膜粘連蛋白(basallaminin)，存在于上皮組織的基底膜中(basementmembrane)；第五型膠原蛋白存在于細(xì)胞表面、頭發(fā)或胎盤中。

膠原蛋白具有極高的經(jīng)濟(jì)價值，可以廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥或美容用途，例如可作為干細(xì)胞(stemcell)培養(yǎng)系統(tǒng)的支撐材料以幫助干細(xì)胞生長、含藥型心血管支架上包覆藥物的材料、燒燙傷病人傷口的敷料、膠原蛋白止血棉片、膠原蛋白膜骨填料、保濕抗老化妝品、口服營養(yǎng)補(bǔ)充品等等；目前市面上所見到的膠原蛋白商品，原料大多都是使用第一型膠原蛋白。

目前膠原蛋白的來源主要是從動物組織萃取得到，市場上常見的膠原蛋白可萃取自豬皮、牛皮、魚皮、魚鱗等等，例如臺灣專利申請twi487711便是以鮪魚魚皮為原料進(jìn)行膠原蛋白的萃取。但源自動物的膠原蛋白可能會引起過敏反應(yīng)，例如對海鮮過敏的人可能就不適合使用萃取自魚皮/魚鱗的膠原蛋白產(chǎn)品。為了降低膠原蛋白導(dǎo)致的過敏現(xiàn)象，美國專利申請us20120284817a1便利用基因工程的方法，以轉(zhuǎn)基因植物合成人類膠原蛋白，但由于植物與哺乳類動物的酶系統(tǒng)并不完全相同，產(chǎn)生的膠原蛋白翻譯后修飾(posttranslationalmodification)的狀態(tài)仍與一般源自哺乳類的膠原蛋白不同。

另外，中國專利申請cn101812457a公開了采用大腸桿菌來表達(dá)人類膠原蛋白片段。然而，細(xì)菌表達(dá)產(chǎn)生的致熱原致使表達(dá)產(chǎn)物難以應(yīng)用于臨床，目的蛋白通常以包涵體形式表達(dá)，致使產(chǎn)物純化困難，另外原核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。為了克服細(xì)菌表達(dá)體系具有內(nèi)毒素、致熱原的安全問題，越來越多的研究者開始利用真核微生物來表達(dá)重組類人膠原蛋白，例如，中國專利cn102020716a公開了采用酵母細(xì)胞來表達(dá)重組類人膠原蛋白。然而，利用真核細(xì)胞表達(dá)的人膠原蛋白仍然存在純化困難、純度不高以及蛋白降解的問題。此外，這些利用真核細(xì)胞表達(dá)的膠原蛋白的氨基酸序列與人體不完全相同，在生物安全性和生物相容性方面也存在缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有的以轉(zhuǎn)基因生物制備膠原蛋白在實(shí)際實(shí)施使用時仍具有多種缺陷，發(fā)明人對其加以改善，并據(jù)此研究得到本發(fā)明。

本發(fā)明提供了一種從結(jié)締組織分離的蛋白質(zhì)粗萃物，所述蛋白質(zhì)粗萃物包括：(i)與seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(ii)與seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(iii)與seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列、與seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列。

在上述蛋白質(zhì)粗萃物中，其中，所述蛋白質(zhì)粗萃物包括：(i)seqidno:1的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(ii)seqidno:2的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(iii)seqidno:1的氨基酸序列、seqidno:2的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列。

在上述蛋白質(zhì)粗萃物中，其中，所述蛋白質(zhì)粗萃物被抗人膠原蛋白抗體特異性識別。

在上述蛋白質(zhì)粗萃物中，其中，所述蛋白質(zhì)粗萃物從非人類結(jié)締組織分離得到。

在上述蛋白質(zhì)粗萃物中，其中，所述蛋白質(zhì)粗萃物從轉(zhuǎn)基因大鼠的結(jié)締組織分離得到，所述轉(zhuǎn)基因大鼠的基因組dna具有編碼人類第一型膠原蛋白的脫氧核醣核酸序列。

在上述蛋白質(zhì)粗萃物中，其中，所述編碼人類第一型膠原蛋白的脫氧核醣核酸序列為seqidno:4或seqidno:5。

本發(fā)明還提供了一種制備含目標(biāo)氨基酸序列的蛋白質(zhì)粗萃物的方法，包括：(a)構(gòu)建含有seqidno:4或seqidno:5的脫氧核醣核酸序列構(gòu)成物；(b)將所述脫氧核醣核酸序列構(gòu)成物轉(zhuǎn)入動物胚胎，再將所述動物胚胎移殖到同品系母性動物中，使所述動物胚胎發(fā)育成成年動物；(c)從所述成年動物的結(jié)締組織分離出含有目標(biāo)氨基酸序列的蛋白質(zhì)粗萃物，其中，所述目標(biāo)氨基酸序列為：(i)與seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(ii)與seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(iii)與seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列、與seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列。

在上述方法中，其中，所述目標(biāo)氨基酸序列為：(i)seqidno:1的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(ii)seqidno:2的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(iii)seqidno:1的氨基酸序列、seqidno:2的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列。

在上述方法中，其中，所述動物為大鼠。

在上述方法中，其中，所述蛋白質(zhì)粗萃物被抗人膠原蛋白抗體特異性識別。

本發(fā)明還提供了一種具有目標(biāo)氨基酸序列的蛋白質(zhì)粗萃物在用于制備人類第一型膠原蛋白中的用途，其中，所述目標(biāo)氨基酸序列為：(i)與seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(ii)與seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(iii)與seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列、與seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列。

在上述用途中，其中，所述目標(biāo)氨基酸序列為：(i)seqidno:1的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(ii)seqidno:2的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(iii)seqidno:1的氨基酸序列、seqidno:2的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列。

在上述用途中，其中，所述蛋白質(zhì)粗萃物被抗人膠原蛋白抗體特異性識別。

在上述用途中，其中，所述蛋白質(zhì)粗萃物從轉(zhuǎn)基因大鼠的結(jié)締組織分離得到，所述轉(zhuǎn)基因大鼠的基因組dna具有編碼人類第一型膠原蛋白的脫氧核醣核酸序列。

在上述用途中，其中，所述編碼人類第一型膠原蛋白的脫氧核醣核酸序列為seqidno:4或seqidno:5。

在上述用途中，其中，所述人類第一型膠原蛋白應(yīng)用于醫(yī)藥材料、美妝保養(yǎng)品、食品添加劑中。

在上述用途中，其中，所述醫(yī)藥材料包括膠原蛋白止血棉、手術(shù)縫合線、傷口敷料、骨填充物、人工血管和軟組織填充劑。

在上述用途中，其中，所述美妝保養(yǎng)品的形式為水劑、乳劑、膏劑、粉劑、美白劑、淡斑劑、袪斑劑或上述任意的組合。

在上述用途中，其中，所述美妝保養(yǎng)品包括膠原蛋白保濕液、膠原蛋白保濕霜和膠原蛋白面膜。

在上述用途中，其中，所述食品添加劑添加于骨骼關(guān)節(jié)保健食品和抗衰老保健食品。

附圖說明

圖1示出了轉(zhuǎn)基因鼠的配種策略一。

圖2示出了轉(zhuǎn)基因鼠的配種策略二。

圖3示出了轉(zhuǎn)基因鼠與野生型大鼠的尾粗萃物。

圖4示出了尾粗萃物的蛋白質(zhì)分析結(jié)果(a)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，(b)蛋白質(zhì)免疫印跡法。

圖5示出了通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測尾粗萃物大鼠乙型肌動蛋白的表達(dá)。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

本發(fā)明提供了一種從非人類結(jié)締組織分離的蛋白質(zhì)粗萃物，其包括(i)與seqidno:1具有91％以上相似度的的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列、(ii)與seqidno:2具有93％以上相似度的的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列或(iii)與seqidno:1具有91％以上相似度的的氨基酸序列、與seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；其中該蛋白質(zhì)粗萃物可被抗人類膠原蛋白抗體特異性識別，且由轉(zhuǎn)基因大鼠的結(jié)締組織分離得到，此轉(zhuǎn)基因大鼠的基因組dna具有編碼人類第一型膠原蛋白的脫氧核醣核酸序列，此編碼人類第一型膠原蛋白的脫氧核醣核酸序列為seqidno:4或seqidno:5。

本發(fā)明也提供一種含目標(biāo)氨基酸序列的蛋白質(zhì)粗萃物的制備方法，包含(a)構(gòu)建含有如seqidno:4或seqidno:5的脫氧核醣核酸序列構(gòu)成物(dnaconstruct)；(b)分別將脫氧核醣核酸序列構(gòu)成物引入一大鼠胚胎，再將大鼠胚胎移殖到同品系母鼠中使其發(fā)育成鼠；(c)由成鼠的結(jié)締組織分離出一含有目標(biāo)氨基酸序列的蛋白質(zhì)粗萃物，其中目標(biāo)氨基酸序列為選自(i)與seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列、(ii)與seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列或(iii)與seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列、與seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列，且制備的蛋白質(zhì)粗萃物可被抗人類膠原蛋白抗體特異性識別。

舉例而言，蛋白質(zhì)粗萃物所包含的目標(biāo)氨基酸包含有(i)seqidno:1及seqidno:3的氨基酸序列、(ii)seqidno:2及seqidno:3的氨基酸序列或(iii)seqidno:1、seqidno:2及seqidno:3的氨基酸序列。

本發(fā)明也提供一種具有目標(biāo)氨基酸序列的蛋白質(zhì)粗萃物用于制備人類第一型膠原蛋白的用途，其中目標(biāo)氨基酸序列為選自(i)與seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列、(ii)與seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列或(iii)與seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列、與seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列，且蛋白質(zhì)粗萃物被抗人類膠原蛋白抗體特異性識別；蛋白質(zhì)粗萃物由轉(zhuǎn)基因大鼠的結(jié)締組織分離得到，且轉(zhuǎn)基因大鼠的基因組dna具有編碼人類第一型膠原蛋白的脫氧核醣核酸序列seqidno:4或seqidno:5。

此外，藉由下述具體實(shí)施例，可進(jìn)一步證明本發(fā)明可實(shí)際應(yīng)用的范圍，但不意欲以任何形式限制本發(fā)明的范圍。

簡言之，本發(fā)明揭露一種源自外源性膠原蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠、含有外源性膠原蛋白粗萃物與大鼠乙型肌動蛋白粗萃物的混合物，且揭示其制備方法與用途；外源性膠原蛋白基因可為人、兔、?；蜇i的膠原蛋白基因；而兔、?；蜇i的膠原蛋白col1a1氨基酸序列與人類膠原蛋白col1a1氨基酸序列具有91％以上的相似度；兔、?；蜇i的膠原蛋白col1a2氨基酸序列與人類膠原蛋白col1a2氨基酸序列具有93％以上的相似度；以下為人類膠原蛋白轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)施例：

實(shí)驗(yàn)一、制備人類膠原蛋白轉(zhuǎn)基因鼠

本實(shí)驗(yàn)利用特異性佳的crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/cas9)基因編輯方法，將人類第一型膠原蛋白基因hcola1或hcola2轉(zhuǎn)入sd大鼠(sprague-dawleyrat)，使大鼠的結(jié)締組織表達(dá)人類第一型膠原蛋白。其流程如下：

(一)制備sgrna(singleguiderna)、cas9表達(dá)rna、col1a1或

col1a2標(biāo)定載體

合成具有識別大鼠膠原蛋白基因col1a1或cal1a2的寡核苷酸(oligodna)，以制備sgrna(singleguiderna)，序列分別為seqidno:8～seqidno:15；將成對的oligodna進(jìn)行退火(annealing)反應(yīng)，條件如下：95℃作用3分鐘、95℃作用30秒、95℃至85℃降溫(降溫速度：每分鐘下降2℃)、85℃至25℃降溫(降溫速度：每秒鐘下降0.1℃)、降溫至4℃。

以限制性內(nèi)切酶(restrictionenzyme)切割質(zhì)粒puc57-t7-sgrna，得到線性(linear)雙鏈核酸，并將此線性雙鏈核酸與上述退火(annealing)所得的產(chǎn)物以核酸連接酶(ligase)接合，以得到重組質(zhì)粒(recombinantplasmid)；將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌(escherichiacoli)，由于重組質(zhì)粒上帶有特殊抗生素基因，故可利用抗生素挑選出帶有重組質(zhì)粒的菌株、放大培養(yǎng)該菌株以擴(kuò)增(amplify)上述重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒以限制性內(nèi)切酶切割，得到線性重組質(zhì)粒。另取cas9蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒(cas9expressingplasmid)，以限制性內(nèi)切酶切割，得到線性cas9蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒。將線性重組質(zhì)粒與線性cas9蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行體外逆轉(zhuǎn)錄并濃縮純化，以獲得用以顯微注射的sgrna與cas9rna。

以大鼠基因組dna(genomicdna)、人cdna(源自人類口腔黏膜細(xì)胞)、大鼠cdna、與含有flagtag/bghpa的質(zhì)粒及cole1_amp+minimal載體為模板，使用引物seqidno:16～seqidno:27進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，pcr)與gibsonassembly，得到的標(biāo)定重組載體cole1_amp+minimalvector_r/hcol1a1targetconstruct攜帶嵌合基因seqidno:6。

使用引物seqidno:28～seqidno:39，以大鼠基因組dna(genomicdna)、人cdna(源自人類口腔黏膜細(xì)胞)、大鼠cdna、含有hatag/bghpa的質(zhì)粒及cole1_amp+minimal載體為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)及gibsonassembly，得到的標(biāo)定重組載體cole1_amp+minimalvector_r/hcol1a2targetconstruct攜帶嵌合基因seqidno:7。

(二)動物原核胚顯微注射(pronuclearmicroinjection)或胚原核電穿孔

轉(zhuǎn)基因(electroporation)

準(zhǔn)備一受精第0.5天的合子(zygote)，以原核顯微注射法(pronuclearmicroinjection)或原核電穿孔轉(zhuǎn)基因法(electroporation)，將(一)所制備的產(chǎn)物，以sgrna10ng、cas9mrna50ng與col1a1(或col1a2)標(biāo)定載體4ng混合后，一起轉(zhuǎn)入合子中，以獲得受精0.5天的轉(zhuǎn)基因合子。

將性成熟(滿七周)未懷孕且發(fā)情的雌鼠，與結(jié)扎公鼠交配，使其進(jìn)入假孕狀態(tài)(pseudopregnant)，交配后隔天檢查母鼠陰道，有栓塞(plug)情形的母鼠定義為0.5天假孕雌鼠。將20-30顆轉(zhuǎn)基因合子注射入0.5天假孕雌鼠的輸卵管中，讓轉(zhuǎn)基因合子可在雌鼠體內(nèi)生長分化。轉(zhuǎn)基因小鼠將于17-21日后出生，且出生后約三周可離乳，轉(zhuǎn)基因小鼠離乳后將取其尾部組織，抽取dna，進(jìn)行基因型分析(genotyping)，以初步選出轉(zhuǎn)基因成功的始代鼠(f0)。hcol1a1轉(zhuǎn)基因鼠的基因型分析以引物seqidno:40～seqidno:43進(jìn)行，且hcol1a2轉(zhuǎn)基因鼠的基因型分析以引物seqidno:44～seqidno:47進(jìn)行；上述基因型分析為公知技術(shù)，在此不再贅述。

實(shí)驗(yàn)二、轉(zhuǎn)基因鼠配種方法(策略一、二)

為獲得具有同型人類膠原蛋白轉(zhuǎn)基因的大鼠(homologousstrain)，使用兩種配種策略以獲得所需的轉(zhuǎn)基因動物，請參照圖1，為配種策略一，敘述如下：以hcol1a1轉(zhuǎn)基因鼠為例，實(shí)驗(yàn)一所得的f0鼠只有一個基因組上的基因被置換(heterologousstrain)，基因型以h1r1/r2r2表示(h:human，r:rat，1:col1a1基因，2:col1a2基因)；為獲得兩基因組都被置換的動物(homologousstrain)，進(jìn)行以下配種流程：將f0(h1r1/r2r2)與野生型大鼠(wildtype，r1r1/r2r2)配種；f0(h1r1/r2r2xwt(r1r1/r2r2)，得到初代鼠，基因型可能為f1(h1r1/r2r2)或f1(r1r1/r2r2)；將f1(h1r1/r2r2)進(jìn)行自我配種[f1(h1r1/r2r2)xf1(h1r1/r2r2)]，可獲得子代f2(h1h1/r2r2)、f2(h1r1/r2r2)與f2(r1r1/r2r2)，挑出子代f2(h1h1/r2r2)進(jìn)行后續(xù)配種；膠原蛋白基因col1a2轉(zhuǎn)基因鼠的配種方式同上，最終挑出子代f2(r1r1/h2h2)進(jìn)行后續(xù)配種。

將col1a1轉(zhuǎn)基因鼠的f2(h1h1/r1r1)與col1a2轉(zhuǎn)基因鼠的f2(r1r1/h2h2)配種，獲得f3(h1r1/h2r2)；將f3(h1r1/h2r2)進(jìn)行自我配種，并挑出子代f4(h1h1/h2h2)，以f4(h1h1/h2h2)進(jìn)行自我配種[f4(h1h1/h2h2)xf4(h1h1/h2h2)]得到的轉(zhuǎn)基因鼠，便會是col1a1以及col1a2皆被置換的轉(zhuǎn)基因鼠。以上轉(zhuǎn)基因鼠的基因型皆以基因型分析(genotyping)而獲得，使用的引物為seqidno:40～seqidno:43(hcol1a1轉(zhuǎn)入)與seqidno:44～seqidno:47(hcol1a2轉(zhuǎn)入)。

獲得同型人類膠原蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠(homologousstrain)的配種策略二請參見圖2，敘述如下：以hcol1a1轉(zhuǎn)基因鼠為例，將實(shí)驗(yàn)一所得的f0(h1r1/r2r2)鼠與野生型大鼠(wildtype，r1r1/r2r2)配種：f0(h1r1/r2r2)xwt(r1r1/r2r2)，得到初代鼠f1(h1r1/r2r2)或f1(r1r1/r2r2)；膠原蛋白基因col1a2轉(zhuǎn)基因鼠的配種方式同上，獲得f1(r1r1/h2r2)或f1(r1r1/r2r2)的子代。

取hcol1a1轉(zhuǎn)基因初代鼠f1(h1r1/r2r2)與hcol1a2轉(zhuǎn)基因初代鼠f1(r1r1/h2r2)進(jìn)行交配，可能獲得基因型為f2(h1r1/h2r2)、f2(h1r1/r2r2)、f2(r1r1/h2r2)與f2(r1r1/r2r2)的子代；以f2(h1r1/h2r2)進(jìn)行交互配種[f2(h1r1/h2r2)xf2(h1r1/h2r2)]，并挑出子代f3(h1h1/h2h2)；再將f3(h1h1/h2h2)進(jìn)行交互配種，[f3(h1h1/h2h2)xf3(h1h1/h2h2)]得到的轉(zhuǎn)基因鼠，便可以獲得子代的col1a1以及col1a2皆被置換的轉(zhuǎn)基因鼠。以上轉(zhuǎn)基因鼠的基因型皆以基因型分析(genotyping)而獲得，使用的引物為seqidno:40～seqidno:43(hcol1a1轉(zhuǎn)入)與seqidno:44～seqidno:47(hcol1a2轉(zhuǎn)入)。

實(shí)驗(yàn)三、大鼠尾部粗萃物的制備

大鼠膠原蛋白的粗萃物，可從大鼠尾巴或皮膚萃取得到，以下是以尾巴為材料，進(jìn)行萃取并分析的結(jié)果：將大鼠犧牲后，自根部剪下其尾巴，保存于-80℃，轉(zhuǎn)基因鼠的尾巴與野生型大鼠的尾巴在外觀上無明顯差異(結(jié)果未顯示)；將尾巴置于冰上解凍至少30分鐘，移除上皮組織、將尾巴粗略切割為六等分，并移除骨頭與肌肉；將肌腱剪碎并浸泡于水中，以1倍pbs(1xphosphate-bufferedsaline)緩沖液清洗后，以70％乙醇浸泡10分鐘；移除非肌腱組織(如血管或肌肉)，將肌腱組織以離心方式沉降，移除70％的乙醇，獲得肌腱初始產(chǎn)物。

將肌腱初始產(chǎn)物稱重，并加入1n醋酸溶液(肌腱初始產(chǎn)物重量與1n醋酸溶液體積比介于1:99～1:9，其中較佳為1:9)，持續(xù)攪拌，于4℃中作用12～48小時；之后，將肌腱初始產(chǎn)物溶液于-80℃處理12小時，最后于-10℃下執(zhí)行凍干過程，作用48小時，以去除醋酸與水分，最終獲得如圖3所示的海綿狀凍干粗萃物(即本申請的粗萃物)，此粗萃物將進(jìn)行進(jìn)一步分析。

實(shí)驗(yàn)四、聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)與蛋白質(zhì)免疫印跡法(western’sblotting)

將粗萃物應(yīng)含有10％蔗糖的0.1m乳酸溶液溶解成濃度為1mg/ml的溶液，并取5μg粗萃物，以公知的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳以及蛋白質(zhì)免疫印跡法進(jìn)行分析，簡述如下：

進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(nativepage)，使蛋白質(zhì)在凝膠中分離，再以含有考馬斯亮藍(lán)(coomassieblue)染料的溶液染色2小時、再以脫色液(destainingsolution)清洗24小時；如圖4的(a)所示，第1～3欄的樣本為轉(zhuǎn)基因鼠尾巴粗萃物，第4～6欄為野生型大鼠尾巴粗萃物，經(jīng)電泳后，兩種大鼠尾粗萃物呈現(xiàn)的模式不同，但可初步推知轉(zhuǎn)基因鼠尾粗萃物中含有大量的某種蛋白質(zhì)，且此蛋白質(zhì)不存在于野生型大鼠尾粗萃物中。

為進(jìn)一步確認(rèn)以非變性凝膠電泳測得的蛋白質(zhì)是什么蛋白質(zhì)，再以蛋白質(zhì)免疫印跡法分析粗萃物：進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(nativepage)后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至nc膜(nitrocellulosemembrane)上，并以特異性識別人類第一型膠原蛋白的抗體(millipore抗體，編號mab3391)識別。如圖4的(b)所示，第1～3欄為轉(zhuǎn)基因鼠尾巴粗萃物，人類第一型膠原蛋白抗體作用后會呈現(xiàn)信號，且信號模式與圖4的(a)可互相對應(yīng)，確認(rèn)轉(zhuǎn)基因鼠尾巴粗萃物中含有大量人類第一型膠原蛋白；然而，圖4中的(b)的第4～6欄，以人類第一型膠原蛋白抗體作用后完全沒有任何信號，確認(rèn)野生型大鼠尾巴粗萃物并不含有人類第一型膠原蛋白。

此外，將大鼠尾巴的粗萃物以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sdspage)分離后，使用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測大鼠乙型肌動蛋白(β-actin)的表達(dá)情形，如圖5所示，不論是轉(zhuǎn)基因鼠或是野生型大鼠，其粗萃物中皆含有大鼠乙型肌動蛋白(β-actin)。

本申請所獲得的粗萃物可再繼續(xù)使用胃蛋白酶(pepsin)或是中性蛋白酶(dispase)處理，以純化出人類膠原蛋白，以進(jìn)一步應(yīng)用于使用膠原蛋白為原料的產(chǎn)品中。

在本申請的一實(shí)施例中，由粗萃物純化的人類膠原蛋白可應(yīng)用于醫(yī)藥材料中，例如膠原蛋白止血棉、可吸收的手術(shù)縫合線、傷口敷料、骨填補(bǔ)物、人工血管、軟組織填充劑(softtissuefiller)等等。

在本申請的一實(shí)施例中，由粗萃物純化的人類膠原蛋白可應(yīng)用于美妝保養(yǎng)品中，其形式包括但不限于水劑、乳劑、膏劑、粉劑、美白劑、淡斑劑、袪斑劑或上述任意的組合，例如膠原蛋白保濕液、膠原蛋白保濕霜、膠原蛋白面膜等等。

在本申請的一實(shí)施例中，由粗萃物純化的人類膠原蛋白應(yīng)用于食品添加物時，可例如添加于骨骼關(guān)節(jié)保健、抗衰老保健等營養(yǎng)保健食品。

由上述的實(shí)施說明可知，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.本申請的粗萃物能進(jìn)一步純化以獲得人類第一型膠原蛋白，應(yīng)用于醫(yī)材或美容用途上，可降低對非人類膠原蛋白過敏的發(fā)生率。

2.本申請的粗萃物源自轉(zhuǎn)基因大鼠，其蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(post-translationalmodification)更近似人類第一型膠原蛋白的天然狀態(tài)。

3.本申請的粗萃物源自于實(shí)驗(yàn)動物，其養(yǎng)殖環(huán)境受到嚴(yán)密監(jiān)控，可以降低原料中含有感染性物質(zhì)的疑慮，并提供質(zhì)量優(yōu)良的膠原蛋白來源。

綜上所述，本發(fā)明的一種從非人類結(jié)締組織分離的蛋白質(zhì)粗萃物及其方法與用途，的確能憑借上述所揭露的實(shí)施例，達(dá)到所預(yù)期的使用功效。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，以上實(shí)施例僅是示例性實(shí)施例，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行多種變化、替換以及改變。