本發(fā)明涉及基因靶向藥物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)EGFR耐藥性突變的方法和組合物。
背景技術(shù)：
表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中重要的增殖和生存相關(guān)的細(xì)胞功能，已被確定為治療多種腫瘤的相關(guān)靶點(diǎn)。EGFR在多種腫瘤中常有體細(xì)胞單核苷酸變異或缺失或表達(dá)變化，這些變異位點(diǎn)常是第一代酪氨酸激酶抑制劑，如吉非替尼或厄洛替尼的靶向位點(diǎn)。
T790M突變是EGFR 20外顯子中的一個(gè)點(diǎn)突變，就是EGFR蛋白的第790氨基酸由T(色氨酸)變成了M(甲硫氨酸)，這個(gè)突變與第一代藥物的失效密切相關(guān)。一項(xiàng)對(duì)出現(xiàn)耐藥性的肺癌患者的研究表明約60％的耐藥性來(lái)自于EGFR的T790M突變，4％同時(shí)有HER2擴(kuò)增和T790M突變，3％同時(shí)有MET擴(kuò)增和T790M突變，18％的患者耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理尚未明確。近30多年來(lái)，癌癥已成為人類第一死因，目前，肺癌、肝癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、宮頸癌及鼻咽癌8個(gè)重點(diǎn)癌癥占到了癌癥死因的80％。若EGFR突變患者出現(xiàn)耐藥性，其治療效果則明顯停滯并且藥物的副作用還會(huì)加速患者的病情惡化，足見(jiàn)EGFR突變的檢測(cè)對(duì)于預(yù)防和治療癌癥患者的重要性。
而現(xiàn)有技術(shù)中大多是對(duì)于T790M突變的檢測(cè)和針對(duì)此突變位進(jìn)行的藥物治療，而對(duì)于其它與EGFR突變引起的耐藥性的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供一種能快速準(zhǔn)確測(cè)量M793K突變的檢 測(cè)EGFR耐藥性突變的方法和組合物。
M793K突變編碼了EGFR蛋白中793位的變化，從野生型中的甲硫氨酸(M)變?yōu)橥蛔凅w中的賴氨酸(K)。在用吉非替尼或厄洛替尼治療前或早期，患者中很少出現(xiàn)這種突變，但是由于該突變消除了對(duì)這些藥物敏感性，攜帶突變的癌細(xì)胞被陽(yáng)性地選擇，導(dǎo)致患者對(duì)進(jìn)一步治療產(chǎn)生頑固性。
第一方面，本發(fā)明提供的一種檢測(cè)EGFR耐藥性突變的組合物包括多個(gè)PCR引物；
所述PCR引物為：
(1)正向引物：5’-CGTTCGGCACGGTGTATAA-3’
反向引物：5’-GCCTCCTTCTGCATGGTATT-3’
或者
(2)正向引物：5’-GGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTT-3’
反向引物：5’-ATAGTCCAGGAGGCAGCCGAA-3’。
也就是PCR引物為(1)和(2)中的任意一組。M793K是指EGFR 20外顯子2378位核苷酸繼發(fā)點(diǎn)突變，所述的兩組包括EGFR cDNA序列核苷酸2378的引物對(duì)能夠擴(kuò)增片斷，它可用于測(cè)序、限制長(zhǎng)度多態(tài)性分析，或者用于確定是否存在2378T->A突變的任何其它技術(shù)，2378T->A突變即EGFR cDNA序列核苷酸2378位上T堿基突變?yōu)锳堿基。
本發(fā)明提供的(1)或(2)組PCR引物在適宜的PCR條件下雜交至編碼突變EGFR多肽的第一多核苷酸，或者它的多核苷酸片斷，其中該引物雜交至在對(duì)應(yīng)于EGFR cDNA堿基2378的位置上包括突變A的有義鏈序列或者反義鏈序列，而且該引物在所述PCR條件下很弱地或者根本不雜交至在2378位上含有野生型T的第二EGFR多核苷酸。
如序列表中第5項(xiàng)表皮生長(zhǎng)因子受體DNA所示，(1)組中的正向引物為第104位至第122位DNA序列，(1)組中的反向引物為第542位至第561位的反向互補(bǔ)序列；(2)組中的正向引物為第130位至第143位DNA序列，(2)組中 的反向引物為第322位至第342位的反向互補(bǔ)序列。M793K突變點(diǎn)在各組中正反引物之間，突變點(diǎn)位于第317位，這樣，通過(guò)PCR擴(kuò)增即可檢測(cè)出該突變。
優(yōu)選地，上述檢測(cè)EGFR耐藥性突變的組合物還包括試劑盒；所述試劑盒包括Taq DNA Polymerase、dNTPs、反應(yīng)緩沖液。Taq DNA Polymerase即TaqDNA聚合酶。
優(yōu)選地，上述檢測(cè)EGFR耐藥性突變的組合物中所述試劑盒中Taq DNA Polymerase的濃度為2x。
優(yōu)選地，上述檢測(cè)EGFR耐藥性突變的組合物中所述引物的終濃度為0.2uM，試劑盒中dNTPs終濃度為0.5uM，緩沖液10xTaq PCR Buffer的終濃度為1x。也就是說(shuō)用于檢測(cè)的引物的終濃度為0.2uM/L。
優(yōu)選地，上述檢測(cè)EGFR耐藥性突變的組合物中所述用于配置引物的終濃度溶液的引物濃度為10uM。也就是說(shuō)引物配置成最終濃度前是在10uM的濃度下進(jìn)行儲(chǔ)存，這樣使得引物在配制成最終濃度能夠更加準(zhǔn)確。
第二方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)EGFR耐藥性突變的方法，包括步驟：
A.模板制備：石蠟包埋組織切片中提取DNA，使用紫外分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行濃度調(diào)整，作為PCR檢測(cè)的模板；
B.反應(yīng)組分配制：分別配制檢測(cè)混合物和陰性對(duì)照品混合物；其中，檢測(cè)混合物按PCR混合液10.5uL、模板DNA溶液2uL，加ddH2O補(bǔ)至50ul配制一管；陰性對(duì)照品混合物按PCR混合液10.5uL，不加DNA模板，加ddH2O補(bǔ)至50ul配制一管；ddH2O即重蒸水；所述PCR混合液即如上所述的包含PCR引物及試劑盒的混合液；
C.擴(kuò)增：分別將檢測(cè)混合物、陰性對(duì)照品混合物放入PCR儀擴(kuò)增，按以下程度進(jìn)行擴(kuò)增：
(1)94℃，2-5min，1cycle；即在94℃下反應(yīng)2-5分鐘使得DNA完全分開(kāi)；
(2)循環(huán)重復(fù)如下步驟30-35次：
94℃ 30S
50-60℃ 30S
72℃ 1-2kb/min；
也就是先94℃下反應(yīng)30秒，再在50-60℃退火30秒，然后在72℃在每分鐘1-2kb的速度進(jìn)行延伸，然后重復(fù)上述步驟，總共循環(huán)重復(fù)30-50次；
(3)72℃，5-10min；
D.結(jié)果判定：擴(kuò)增產(chǎn)物直接點(diǎn)樣電泳，如果檢測(cè)物中擴(kuò)增出片段和理論上設(shè)計(jì)引物時(shí)參照的目的片段大小一致，且陰性對(duì)照物無(wú)條帶，說(shuō)明樣本DNA中含有該突變；如果檢測(cè)物中沒(méi)有擴(kuò)增出片段，且陰性對(duì)照品無(wú)條帶，說(shuō)明檢測(cè)物中不含該突變。
EGFR上新發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)突變M793K，發(fā)明人通過(guò)分析得到出該突變和TKI抗藥性相關(guān)。證據(jù)如下：該點(diǎn)突變的頻率較高，真實(shí)存在；氨基酸改變由M變成K，由非極性氨基酸變成堿性氨基酸，變動(dòng)大；位置重要，是TKI結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，M可和TKI形成氫鍵；臨床實(shí)驗(yàn)中7例病人均表現(xiàn)出TKI治療抗性，因?yàn)闆](méi)有KRAS突變，因此抗性很可能是因?yàn)镋GFR的突變引起的，6例病人未檢測(cè)到已知的T790M和C797S抗性突變，1例病人檢測(cè)到已知的C797S抗性突變，也推測(cè)M793K是一個(gè)抗性突變；TKI治療后，M793K突變的豐度明顯增加；發(fā)生突變后，EGFR與TKI的結(jié)合分值降低；細(xì)胞學(xué)證據(jù)表明，M793K突變后，對(duì)吉非替尼表現(xiàn)出抗性(以自身磷酸化程度作為鑒定指標(biāo))。而本發(fā)明則針對(duì)M793K突變進(jìn)行了檢測(cè)方法的研究，最終目的是早期鑒定頑固性病例以便于能夠啟動(dòng)替代性治療。
綜上所述，利用本發(fā)明提供的組合物和檢測(cè)方法檢測(cè)EGFR耐藥性突變，可以通過(guò)對(duì)癌癥患者的EGFR上新發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)突變M793K進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，從而預(yù)測(cè)出TKI抗藥性，本發(fā)明提供了一種新的檢測(cè)方法或手段，進(jìn)而能夠?qū)崿F(xiàn)分子分型精準(zhǔn)醫(yī)療應(yīng)用保護(hù)，針對(duì)本突變也能夠更加準(zhǔn)確有效地開(kāi)發(fā)對(duì)應(yīng)的靶向藥物。
具體實(shí)施方式
下面將對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，因此只作為示例，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明實(shí)施例共包含2個(gè)PCR反應(yīng)，分別為檢測(cè)混合物1管，陰性對(duì)照檢測(cè)物1管。實(shí)施例具體檢測(cè)操作步驟如下：
1.臨床樣本基因組提?。罕緦?shí)施例是從非小細(xì)胞肺癌患者肺部石蠟包埋組織切片中提取DNA，并對(duì)其進(jìn)行定量，作為PCR檢測(cè)的模板。采用Qiagen公司的QIAamp石蠟包埋組織提取試劑盒(Cat No.56404)。
(1)室溫下平衡所有Buffers。
(2)水浴鍋預(yù)熱到70℃，buffer ATL、buffer AL 70℃溶解沉淀。
(3)用手術(shù)刀整齊地切除組織樣品周邊的多余石蠟。
(4)切下3-8片5-10um厚的組織切片，放入1.5ml的離心管中，加入1ml二甲苯(xylene)，劇烈震蕩10s。
(5)室溫下，20000×g離心2min。
(6)用移液槍移除上清液，注意不要移除任何沉淀。
(7)添加1ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95-100％的乙醇或乙醇水溶液至沉淀中，震蕩儀震蕩混勻。
(8)室溫下，20000×g離心2min。
(9)用移液槍移除上清液，注意不要移除任何沉淀，用細(xì)小槍頭盡量移除所有無(wú)水乙醇。
(10)打開(kāi)管蓋，37℃孵育10min，直到殘余的無(wú)水乙醇全部蒸發(fā)掉。
(11)將沉淀重新懸浮在180ul的buffer ATL中。添加20ul的蛋白酶K，震蕩儀震蕩混勻。
(12)56℃孵育1h，直到樣品被buffer ATL完全溶解。
(13)90℃孵育1h。
(14)瞬時(shí)離心，將蓋子上的液滴離心下來(lái)；離心管中添加2ul RNase A(100mg/ml),室溫孵育2min。
(15)添加200ul的buffer AL，震蕩儀立即充分震蕩混勻。
(16)添加200ul的無(wú)水乙醇，震蕩儀立即充分震蕩混勻。
(17)瞬時(shí)離心，將蓋子上的液滴離心下來(lái)。
(18)將所有的溶解液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，6000×g離心1min，將吸附柱重新放置到新的收集管中。
(19)向吸附柱中添加500ul的buffer AW1，6000×g離心1min；將吸附柱重新放置到新的收集管中。
(20)向吸附柱中添加500ul的buffer AW2，6000×g離心1min，將吸附柱重新放置到新的收集管中；20000×g離心3min。
(21)將吸附柱移至新的1.5ml離心管中，添加50ul的buffer ATE到吸附柱膜的中央。
(22)室溫孵育1min，20000×g離心1min。
2.紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA提取的質(zhì)量及濃度并調(diào)整至50ng/ul。
3.配置PCR反應(yīng)體系
全程4℃操作。各反應(yīng)管組分含量及終濃度如下(每管總體系50ul)：
4.擴(kuò)增
將上述兩管反應(yīng)物放入PCR儀，設(shè)置反應(yīng)程序如下：
(1)94℃ 2-5min
(2)循環(huán)重復(fù)如下步驟30-35次：
94℃ 30S
50-60℃ 30S
72℃ 1-2kb/min
(3)72℃ 5-10min。
5.電泳檢測(cè)結(jié)果
檢測(cè)物中檢測(cè)出的條帶和理論上設(shè)計(jì)引物時(shí)參照的目的片段大小一致，且陰性對(duì)照組未檢測(cè)出條帶，說(shuō)明該樣本中含有EGRF M793K突變。