国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      一種過(guò)氧化氫熒光探針化合物的制備與應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):11106870閱讀:1648來(lái)源:國(guó)知局
      一種過(guò)氧化氫熒光探針化合物的制備與應(yīng)用的制造方法與工藝

      技術(shù)領(lǐng)域

      本發(fā)明涉及一種過(guò)氧化氫熒光探針化合物及其制備與應(yīng)用,屬于熒光探針技術(shù)領(lǐng)域。

      技術(shù)背景

      過(guò)氧化氫是人體內(nèi)活性氧物種中的一種,通過(guò)氧氣的代謝及酶的催化而產(chǎn)生。適量的過(guò)氧化氫對(duì)免疫細(xì)胞的活化,細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有促進(jìn)作用,然而過(guò)量的過(guò)氧化氫可能會(huì)造成許多嚴(yán)重的疾病,例如,阿茲海默癥,帕金森癥,心腦血管疾病以及癌癥等等。因此,識(shí)別以及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的含量具有十分重要的意義。

      目前,作為生物體內(nèi)過(guò)氧化氫的檢測(cè)方法主要有電化學(xué)方法、元素分析以及質(zhì)譜等方法,這些方法的樣品準(zhǔn)備過(guò)程復(fù)雜,檢測(cè)過(guò)程對(duì)樣品的損傷較大,而且不能進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)。與之對(duì)比,作為一種價(jià)格低廉的檢測(cè)手段,熒光探針檢測(cè)法由于其不僅具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)速度快、能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)可視化檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),而且可在生物醫(yī)學(xué)成像方面進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用,近幾年來(lái)備受研究人員的關(guān)注。

      在現(xiàn)有的熒光探針技術(shù)中,過(guò)氧化氫探針的種類較少,選擇性低,檢測(cè)不夠靈敏等問(wèn)題。比如DCFH是檢測(cè)體內(nèi)ROS的探針,但它容易被空氣中的氧氣氧化,容易對(duì)過(guò)氧化氫的檢測(cè)產(chǎn)生干擾,降低靈敏度。另外,由于過(guò)氧化氫存在時(shí)間短,易與其它物質(zhì)反應(yīng)生成新的活性氧物種,因此對(duì)過(guò)氧化氫的檢測(cè)本身就存在一定的難度,設(shè)計(jì)一種響應(yīng)時(shí)間短,靈敏度高,選擇性強(qiáng)的探針具有十分重要的意義。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明提供一種反應(yīng)型過(guò)氧化氫熒光探針化合物,既可以檢測(cè)水中的過(guò)氧化氫,還可以在生物體內(nèi)識(shí)別和檢測(cè)過(guò)氧化氫,而且還可應(yīng)用于深層組織成像。

      本發(fā)明還提供所述反應(yīng)型過(guò)氧化氫熒光探針化合物的制備方法與應(yīng)用。

      本發(fā)明的技術(shù)方案如下:

      一種反應(yīng)型過(guò)氧化氫熒光探針化合物,具有式I所示的結(jié)構(gòu):

      本發(fā)明所述的過(guò)氧化氫熒光探針化合物的制備方法,包括如下步驟:

      1)將2,4-二羥基苯甲醛和環(huán)己烯酮,以咪唑?yàn)榇呋瘎?,四氫呋喃和水為溶劑,在氮?dú)獗Wo(hù)下室溫反應(yīng),得到化合物II;

      (2)上步制得的化合物II溶于丙酮中,加入4-硼酯溴芐,以無(wú)水碳酸鉀為催化劑,在50℃下攪拌過(guò)夜反應(yīng),得到化合物I;

      根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選的,步驟(1)所述2,4-二羥基苯甲醛、環(huán)己烯酮的摩爾比為1:1.1;

      根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選的,步驟(2)所述II、4-硼酯溴芐的摩爾比為1:1.1;

      根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選的,步驟(1)、(2)全程在氮?dú)獗Wo(hù)下進(jìn)行;

      根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選的,步驟(1)反應(yīng)溫度為25℃;

      根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選的,步驟(2)反應(yīng)溫度為50℃;

      更為詳細(xì)的,所述的反應(yīng)型過(guò)氧化氫熒光探針化合物的制備方法,步驟如下:

      (a) 取2,4-二羥基苯甲醛1.106g,咪唑0.816g置于三口燒瓶中,氮?dú)獗Wo(hù),取1.3毫升環(huán)己烯酮加入燒瓶中;另取四氫呋喃6毫升,水6毫升加入燒瓶中,25℃下反應(yīng)72小時(shí),然后加入20毫升1M稀鹽酸,水相用乙酸乙酯萃取,蒸發(fā)溶劑,用體積比為1:6的乙酸乙酯與正己烷的混合溶劑為展開劑,柱層析分離,得到純產(chǎn)物 II 0.46克。

      (b) 將II 0.066g,4-硼酯溴芐0.1g,無(wú)水碳酸鉀0.06g 加入到10mL丙酮中,50℃下回流過(guò)夜,旋干制樣,柱層析分離,用體積比為1:6的乙酸乙酯與正己烷的混合溶劑為展開劑,柱層析分離,得產(chǎn)物I 0.107g。

      本發(fā)明所述的反應(yīng)型過(guò)氧化氫熒光探針化合物的應(yīng)用,可用于測(cè)試細(xì)胞、組織和水中的過(guò)氧化氫含量。

      進(jìn)一步優(yōu)選的,所述熒光探針用于在pH=7.4的乙醇和水體積比1:19的溶液中過(guò)氧化氫的快速檢測(cè)。在5%乙醇溶液中最低可探測(cè)的過(guò)氧化氫濃度為1.46*10-7 mol/L。

      本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,所述熒光探針在pH=7.4的乙醇和水體積比1:19的溶液中,用波長(zhǎng)444nm的光作為激發(fā)波長(zhǎng),可以發(fā)現(xiàn)其沒(méi)有熒光,加入過(guò)氧化氫十五分鐘后檢測(cè),溶液在511nm處熒光迅速增強(qiáng),而其他活性氧物種加入后溶液的熒光沒(méi)有明顯變化,該探針對(duì)過(guò)氧化氫具有很高的選擇性。

      將本發(fā)明的熒光探針化合物加入含有5%乙醇的水溶液中,配成熒光探針化合物濃度為10微摩爾每升的溶液,用PBS緩沖溶液調(diào)節(jié)至pH=7.4,加入不同濃度的過(guò)氧化氫,用波長(zhǎng)444nm的光激發(fā),在波長(zhǎng)511nm處的熒光依次增強(qiáng)。得出工作曲線如圖3所示,通過(guò)測(cè)定待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度,就可以定量的計(jì)算出過(guò)氧化氫的濃度。

      本發(fā)明所述的反應(yīng)型過(guò)氧化氫熒光探針化合物不僅可以用于水中過(guò)氧化氫的檢測(cè),還可以應(yīng)用于組織細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的檢測(cè)和成像。

      將MCF-7細(xì)胞在含有10%牛胚胎血清的1毫升細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時(shí),然后用100微摩爾每升的過(guò)氧化氫溶液處理10分鐘,再用10微摩爾每升的本發(fā)明的熒光探針?lè)跤?0分鐘。細(xì)胞用激發(fā)波長(zhǎng)為444nm的光源激發(fā),在共聚焦顯微鏡下成像

      與現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)相比,本發(fā)明的熒光探針設(shè)計(jì)新穎,選擇性好,且具有良好的水溶性,而不具有生物毒性,在制備方面,均使用常用試劑,合成步驟簡(jiǎn)單。本發(fā)明的優(yōu)良效果如下:

      1、本發(fā)明的熒光探針化合物具有較好的水溶性、生物相容性以及較好的膜穿透性,可用于細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的探測(cè)及成像。

      2、本發(fā)明的熒光探針化合物由于能用于水體中的定量過(guò)氧化氫檢測(cè)且檢測(cè)限較低;

      3、本發(fā)明的熒光探針化合物具有良好的靈敏度和選擇性,測(cè)試樣品前處理簡(jiǎn)單;

      4、本發(fā)明的熒光探針化合物為固體粉末,便于儲(chǔ)存使用,并且合成方法簡(jiǎn)單、收率高、成本低、具有良好的推廣前景;

      5、與現(xiàn)有的技術(shù)相比,本發(fā)明的熒光探針的選擇性高,靈敏度高,檢測(cè)限低,并且在細(xì)胞成像研究對(duì)組織細(xì)胞幾乎無(wú)損傷。

      附圖說(shuō)明

      圖1為本發(fā)明熒光探針的分子結(jié)構(gòu)示意圖。

      圖2為本發(fā)明實(shí)施例1熒光離子探針在含有5%乙醇的水溶液中(pH=7.4),與不同活性氧物種作用后的熒光強(qiáng)度的柱狀圖。

      圖3為本發(fā)明的熒光探針與不同濃度的過(guò)氧化氫的熒光強(qiáng)度工作曲線圖。

      圖4本發(fā)明的熒光探針的細(xì)胞成像圖。

      具體實(shí)施方式

      下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明,但不限于此。實(shí)施例中的各種原料均來(lái)自于市場(chǎng)購(gòu)買。

      實(shí)施例1、探針I(yè)的合成

      (a)取2,4-二羥基苯甲醛1.106g,咪唑0.816g置于三口燒瓶中,氮?dú)獗Wo(hù),取1.3毫升環(huán)己烯酮加入燒瓶中;另取四氫呋喃6毫升,水6毫升加入燒瓶中,25℃下反應(yīng)72小時(shí),然后加入20毫升1M稀鹽酸,水相用乙酸乙酯萃取,蒸發(fā)溶劑,用體積比為1:6的乙酸乙酯和正己烷的混合溶劑為展開劑,柱層析分離,得到純產(chǎn)物 II 0.46克。核磁氫譜:1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm : 1.17-1.20 (t, 6H), 3.38-3.43 (q, J= 14.4,6.8 Hz,4H), 5.14 (s, 2H),

      6.04 (s, 1H), 6.31-6.34 (dd, J = 9.2, 2.0 Hz, 1H), 7.34-7.36(d, J = 8 Hz, 2H), 7.54-7.56(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.74-7.76(d, J = 9.2 Hz, 1H), 10.23 (s, 1H);

      (b)取II 0.066g,4-硼酯溴芐0.1g,無(wú)水碳酸鉀0.06g于10mL丙酮中,50℃下回流過(guò)夜,旋干制樣,柱層析分離,用體積比為1:3的乙酸乙酯/正己烷的混合溶劑為展開劑,柱層析分離得產(chǎn)物I 0.107g。結(jié)構(gòu)如圖1所示。核磁氫譜:1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm : 10.27 (s, 1H), 7.84-7.86 (d, J = 8 Hz, 2H),7.74-7.76(d, J = 9.2 Hz, 1H) 7.46-7.48 (d, J = 8 Hz, 1H), 6.29-6.31 (dd, J = 9.2, 2 Hz 1H), 6.05-6.06 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.36-3.41 (q, J = 14, 7.2 Hz, 4H),1.372(s, 12H), 1.16-1.37(t, 6H)。

      實(shí)施例2、熒光實(shí)驗(yàn)

      取實(shí)施例1制備的熒光探針化合物,溶解到含有5%乙醇的水溶液中,用PBS緩沖溶液調(diào)節(jié)pH=7.4;得熒光探針溶液,備用。

      (1)、取熒光探針溶液,分12組,每組10毫升,其中1組不加活性氧物種,11組分別加入含有CH3COOOH, GSH, H2O2, HOCl, O2?-, ?OH , otBU, TBHP, Vc溶液,使得每組溶液中含有探針化合物的濃度為10μΜ,活性氧物種濃度為200μM,使得活性氧物種與探針化合物的摩爾比為20:1;采用激發(fā)波長(zhǎng)為444nm,熒光光度計(jì)測(cè)試其熒光強(qiáng)度,結(jié)果如圖2所示:本發(fā)明探針溶液本身沒(méi)有熒光,一旦加入過(guò)氧化氫,溶液在511nm熒光迅速增強(qiáng),而其他離子加入后溶液的熒光沒(méi)有變化,說(shuō)明該探針對(duì)過(guò)氧化氫具有很高的選擇性。

      (2)、取熒光探針溶液,分15組,每組10毫升,分別加入不同濃度的過(guò)氧化氫溶液,調(diào)節(jié)到溶液中含有探針化合物的濃度為10μM,過(guò)氧化氫的濃度分別為探針化合物濃度的0、1.5、3、4.5、6、7.5、9、10.5、12、13.5、15、16.5、18、19.5、21倍。采用激發(fā)波長(zhǎng)為444nm,熒光光度計(jì)測(cè)試其熒光強(qiáng)度,結(jié)果如圖3所示:溶液在511nm熒光迅速增強(qiáng),其熒光強(qiáng)度與濃度成線性關(guān)系。根據(jù)測(cè)試計(jì)算,本探針化合物的最低檢測(cè)限為1.46×10-7 mol/L。

      實(shí)施例3、細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

      將MCF-7細(xì)胞在含有10%牛胎兒血清的1毫升細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時(shí),然后用100微摩爾每升的過(guò)氧化氫處理10分鐘,在用10微摩爾每升的本發(fā)明的熒光探針處理30分鐘。細(xì)胞用激發(fā)波長(zhǎng)為437nm的光源激發(fā),在共聚焦顯微鏡下成像,如圖4所示。

      當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 
      網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
      • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1