本發(fā)明涉及生物細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種人源t淋巴細胞的培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥一直是困擾人類的巨大難題。雖然手術(shù)治療、化療、放療等治療方式可以較大改善癌癥患者的生存率，但這些療法對于解救全球上千萬的癌癥患者卻遠遠不夠。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，腫瘤免疫細胞治療已成為癌癥治療領(lǐng)域的第四大療法，它可以彌補傳統(tǒng)療法的弊端，被認為是21世紀腫瘤綜合治療模式中最有發(fā)展前途的治療手段。它是運用生物技術(shù)和生物制劑從患者體內(nèi)分離免疫細胞進行體外培養(yǎng)、激活和擴增后，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，直接殺傷或激發(fā)機體免疫反應(yīng)來殺傷腫瘤細胞，達到治療腫瘤目的。在基因修飾免疫細胞治療領(lǐng)域，car-t療法(嵌合抗原受體t細胞免疫療法)、tcr-t療法(t細胞受體修飾的t細胞療法)已經(jīng)成為全球生物醫(yī)學(xué)研究機構(gòu)和制藥公司爭相“追捧”的明星。

在免疫細胞治療過程中，經(jīng)過免疫磁珠分選和病毒轉(zhuǎn)染后的人源t淋巴細胞十分脆弱，不僅需要營養(yǎng)比例協(xié)調(diào)且豐富的培養(yǎng)基來幫助其維持生長，更需要培養(yǎng)基在能夠促進其高速擴增的同時腫瘤殺傷能力不會減弱?，F(xiàn)有的細胞培養(yǎng)基，例如，optmizer^tmt-cellexpansionsfm、rpmi1640medium，leibovitzmedium，雖然能基本維持抗原特異性t細胞的生長所需營養(yǎng)，但卻存在不能有效促進其增殖，以及培養(yǎng)后腫瘤殺傷能力減弱等問題。

因此，有必要提供一種可以培養(yǎng)和刺激人源t淋巴細胞高效擴增，且又保持腫瘤殺傷能力的培養(yǎng)基。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種人源t淋巴細胞的培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中基因修飾后的抗原特異性t淋巴細胞擴增速度慢、腫瘤殺傷功能弱的問題。

第一方面，本發(fā)明提供了一種人源t淋巴細胞的培養(yǎng)基。用于培養(yǎng)和促進人源t淋巴細胞高效擴增，每1l所述培養(yǎng)基中包括如下含量的各組分：

人ab血清80-120ml，mem維生素溶液7-15ml，n-乙?；?l-半胱氨酸7-12mm，谷氨酰胺或其衍生物1.6-2.5mm，丙酮酸鈉0.8-1.2mm，4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉(hepes鈉鹽)15-25mm，il-74-6μg，il-15或其異二聚體6-9μg，余量為x-vivo基本培養(yǎng)基；其中，所述谷氨酰胺或其衍生物包括谷氨酰胺或l-丙氨酰-l-谷氨酰胺(glutamax-i)。

可選地，所述培養(yǎng)基中，所述il-15或其異二聚體與所述il-7的質(zhì)量比為(1-2.25)：1。進一步可選為(1.2-2.2)：1或(1.5-2.0)：1。更可選為1.5：1。

可選地，每1l所述培養(yǎng)基中包括6-9μg的il-15異二聚體。il-15異二聚體相較于il-15的穩(wěn)定性更好，可以更好地刺激t淋巴細胞的擴增，增強其腫瘤殺傷能力。

進一步可選地，每1l所述培養(yǎng)基中包括7-8μg的il-15異二聚體。

進一步可選地，每1l所述培養(yǎng)基中包括4.5-5.5μg的il-7。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)基配方合理高效，培養(yǎng)基中的人ab血清較常用的胎牛血清更能維持人源t淋巴細胞的生理功能，在細胞殺傷功能上具有更好的腫瘤殺傷功能，結(jié)合使用n-乙酰基-l-半胱氨酸、谷氨酰胺或其衍生物(例如glutamax)、mem維生素等營養(yǎng)劑，能夠提高人源淋巴細胞的活性，改善生長情況，并且能夠提高其擴增數(shù)量，以及輔助提升抗原特異性t淋巴細胞的殺傷活性。該培養(yǎng)基將極大提升回輸病人體內(nèi)的基因修飾淋巴t細胞的活性和功能。其中，hepes可以防止所述培養(yǎng)基ph波動，丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源；l-谷氨酰胺是細胞生長的必須氨基酸，為培養(yǎng)的細胞提供重要的能量來源；其中，glutamax的穩(wěn)定性較高，可以被逐漸裂解釋放l-谷氨酰胺以供細胞利用；mem維生素可以提供細胞生長所需的非必須氨基酸，減少細胞體外抗原蛋白合成的負荷；最重要的是，所述培養(yǎng)基中還添加有特定濃度的細胞因子il-7和il-15二聚體，能夠特異性擴增t淋巴細胞等強效抗癌細胞，誘導(dǎo)t細胞的殺傷活性。

總之，本發(fā)明提供的所述培養(yǎng)基在用于培養(yǎng)人源t淋巴細胞(尤其是抗原特異性t淋巴細胞)時，通過培養(yǎng)基中各組分的協(xié)同作用，使人源t淋巴細胞高效擴增，并保持較高的免疫細胞功能，起到很好的腫瘤特異性殺傷功能，為后續(xù)回輸病人體內(nèi)的基因修飾淋巴t細胞的質(zhì)量提供保障，以便能夠特異殺傷其抗原靶向的腫瘤細胞。

所述x-vivo基本培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，相較于其他無血清培養(yǎng)基(如1640、dmem)而言，更適合于無血清條件下腫瘤浸潤淋巴細胞的增殖，其配方有助于外周血中分離純化的cd3+細胞的增殖。

可選地，所述x-vivo基本培養(yǎng)基包括但不限于x-vivo15、x-vivo10或x-vivo20。

進一步可選地，每1l所述培養(yǎng)基中包括人ab血清90-110ml。

進一步可選地，每1l所述培養(yǎng)基中包括如下含量的各組分：

人ab血清90-110ml，mem維生素溶液8-12ml，n-乙?；?l-半胱氨酸9-11mm，谷氨酰胺或其衍生物1.8-2.2mm，丙酮酸鈉0.9-1.1mm，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes鈉鹽)18-22mm，il-74.5-5.5μg，il-15或其異二聚體7-8μg，余量為x-vivo基本培養(yǎng)基。

進一步可選地，每1l所述培養(yǎng)基中包括l-丙氨酰-l-谷氨酰胺1.8-2.2mm。

更可選地，每1l所述培養(yǎng)基中包括如下含量的各組分：

人ab血清100ml，mem維生素溶液10ml，n-乙?；?l-半胱氨酸10mm，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺2mm，丙酮酸鈉1mm，4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉(hepes)20mm，il-75μg，il-15異二聚體7.5μg，余量為x-vivo基本培養(yǎng)基。

可選地，所述培養(yǎng)基的ph值為7.0-7.2。

在本發(fā)明一實施方式中，每1l所述培養(yǎng)基中還包括如下含量的各組分：疊氮胸苷0.8-1.2μm，利托那韋450-550nm。此種情況下，由于添加了疊氮胸苷、利托那韋，可以抑制hiv病毒的天冬氨酸蛋白酶，阻斷該酶促使產(chǎn)生形態(tài)學(xué)上成熟hiv顆粒所需的聚蛋白，使hiv顆粒因而保持在未成熟的狀態(tài)，使得以基因改造后的hiv病毒載體無復(fù)制活性，較適用于hiv病毒轉(zhuǎn)染的t淋巴細胞。

可選地，每1l所述培養(yǎng)基中還包括如下含量的各組分：疊氮胸苷0.9-1.1μm,1um，利托那韋480-520nm。

更可選地，每1l所述培養(yǎng)基中還包括如下含量的各組分：疊氮胸苷1.0μm,，利托那韋500nm。

具體地，實際應(yīng)用本發(fā)明提供的所述培養(yǎng)基時，可以不限于上述提到的x-vivo基本培養(yǎng)基、人ab血清、n-乙?；?l-半胱氨酸、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉、il-7、il-15或其異二聚體和mem維生素等成分上，還可以在此基礎(chǔ)上添加其他其抑制病毒復(fù)制活性作用的組分，以更好地促進抗原特異性t淋巴細胞的擴增，以及免疫活性的保持。

本發(fā)明提供的所述培養(yǎng)基中，谷氨酰胺或其衍生物可以不限于上述提到的l-谷氨酰胺或l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，根據(jù)需要，其他形式的l-谷氨酰胺衍生物也可以替代采用。

本發(fā)明提供的所述培養(yǎng)基可以用于免疫磁珠分選后的t淋巴細胞的培養(yǎng)，也可以用于經(jīng)病毒(表達特定抗原的病毒)轉(zhuǎn)染后得到抗原特異性t淋巴細胞的擴增培養(yǎng)、腫瘤殺傷實驗、病毒殘留檢測等。

第二方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的培養(yǎng)基的制備方法。

取所述培養(yǎng)基配方的各組分，加x-vivo基本培養(yǎng)基至1l，混合均勻，經(jīng)過濾后得到人源t淋巴細胞的培養(yǎng)基。

本發(fā)明中所述培養(yǎng)基配方中的各組分為gmp級，在將各組分混合后，可以不進行滅菌。

可選地，所述過濾是采用孔徑為0.22μm的濾膜進行。過濾用于除去血清中的沉積物等。

可選地，所述n-乙?；?l-半胱氨酸，谷氨酰胺或其衍生物，丙酮酸鈉，hepes，il-7，il-15或其異二聚體先配制成一定濃度的溶液，然后再混合在一起。

可選地，本發(fā)明提供的所述培養(yǎng)基的制備方法為現(xiàn)配現(xiàn)用。

本發(fā)明第二方面提供的所述培養(yǎng)基的制備方法，制備過程簡單快速。

第三方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的培養(yǎng)基或第二方面的制備方法制得的所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)淋巴細胞中的應(yīng)用。尤其是在免疫細胞治療中的應(yīng)用。具體可以是免疫磁珠分選后的t淋巴細胞的培養(yǎng)，也可以用于經(jīng)病毒(表達特定抗原的病毒)轉(zhuǎn)染后得到抗原特異性t淋巴細胞的擴增培養(yǎng)、腫瘤殺傷實驗、病毒殘留檢測等。

可選地，所述淋巴細胞為人外周血單個核細胞中的淋巴細胞。

可選地，所述應(yīng)用具體為培養(yǎng)抗原特異性t淋巴細胞，可以包括以下步驟：

提供抗原特異性t淋巴細胞；

取上述抗原特異性t淋巴細胞，采用所述人源t淋巴細胞培養(yǎng)基進行高效擴增培養(yǎng)7-10天，在所述高效擴增培養(yǎng)過程中，調(diào)整細胞的濃度為(0.5-1)×10⁶個/ml，得到擴增后的抗原特異性t淋巴細胞。其中，所述擴增后的抗原特異性t淋巴細胞用于回輸?shù)交颊唧w內(nèi)或凍存。

進一步可選地，所述高效擴增培養(yǎng)時的溫度為25-37℃。使所述抗原特異性t淋巴細胞達到穩(wěn)定期。

可選地，所述抗原特異性t淋巴細胞是采用以下方法制備：

(1)取分離出的人外周血單個核細胞(pbmc)，加入x-vivo基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制成第一細胞懸浮液，加入免疫磁珠，室溫孵育1-3小時后，經(jīng)磁性分離，得到磁珠分選后的人源t淋巴細胞；

(2)取上述磁珠分選后的人源t淋巴細胞，加入本發(fā)明第一方面所述的培養(yǎng)基，配制成第二細胞懸浮液，培養(yǎng)1-2天后換液，加入表達特定抗原的病毒，再加入本發(fā)明第一方面所述的培養(yǎng)基，調(diào)整外周血單個核細胞的細胞濃度為(0.5-1)×10⁶個/ml，接種，得到抗原特異性t淋巴細胞；

其中，所述人外周血單個核細胞(pbmc)是采用如下方法分離獲得：

從抽取的患者血液中采集外周血單個核細胞，經(jīng)ficoll離心分離后取中間層細胞，采用生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液(pbs)洗滌，得到pbmc。

進一步可選地，步驟(1)中，所述免疫磁珠與所述pbmc的加入比例(數(shù)量之比)為(2-4):1。

在本發(fā)明一實施例中，所述病毒為腺病毒。

在本發(fā)明另一實施例中，所述病毒為hiv病毒；此時，步驟(2)的所述培養(yǎng)基中還含有疊氮胸苷和利托那韋。

進一步可選地，步驟(2)中，加入的所述病毒的病毒滴度為1×10⁸～5×10⁸tu/ml(其中，tu：transducingunits，傳導(dǎo)單位)。

本申請的有益效果：

本申請?zhí)峁┑乃雠囵B(yǎng)基采用x-vivo作基本培養(yǎng)基，主要添加白介素il-7、il-15或其異二聚體，并輔以人ab血清、mem細胞培養(yǎng)用維生素，并添加n-乙酰基-l-半胱氨酸、谷氨酰胺衍生物、丙酮酸鈉、hepes，通過調(diào)控配方中各組分的含量，構(gòu)成了特定組成的人源t淋巴細胞的培養(yǎng)基。相比與采用市面上的常規(guī)培養(yǎng)養(yǎng)基，本發(fā)明提供的所述培養(yǎng)基能顯著提升抗原特異性t淋巴細胞的擴增速度，擴增速度可以提高2-4倍；并且其腫瘤殺傷能力也可提升1.5-3倍。

此外，經(jīng)本申請所述培養(yǎng)基快速擴增所得到的高活性免疫細胞(即抗原特異性t淋巴細胞)在進行自體移植后對患者機體免疫系統(tǒng)具有增強作用，能夠特異殺傷其抗原靶向的腫瘤細胞。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

圖1為本發(fā)明實施例1提供的培養(yǎng)基與常規(guī)培養(yǎng)基對抗原特異性t淋巴細胞的增殖能力的影響對比；

圖2為本發(fā)明實施例1提供的培養(yǎng)基與常規(guī)培養(yǎng)基對抗原特異性t淋巴細胞的腫瘤殺傷能力的影響對比；

圖3為本發(fā)明實施例1-3提供的培養(yǎng)基與對比實施例1-2提供的培養(yǎng)基對抗原特異性t淋巴細胞的增殖能力的影響對比；

圖4為本發(fā)明實施例1-3提供的培養(yǎng)基與對比實施例1-2提供的培養(yǎng)基對抗原特異性t淋巴細胞的腫瘤殺傷能力的影響對比。

具體實施方式

以下所述是本發(fā)明的可選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明中一些常用的術(shù)語說明如下：n-乙酰-l-半胱氨酸，又稱乙酰半胱氨酸；il-7：白細胞介素-7，interleukin-7；il-15：白細胞介素-15，interleukin-15。

以下為本發(fā)明實施例中所采用的各原料的廠家品牌與貨號：

表1原料表

實施例1

一種培養(yǎng)和促進人源t淋巴細胞高效擴增的培養(yǎng)基，其中，每1l所述培養(yǎng)基中包括如下含量的各組分：

人ab血清100ml；

mem維生素10ml；

n-乙?；?l-半胱氨酸10mm；

l-丙氨酰-l-谷氨酰胺(glutamax)2mm；

丙酮酸鈉1mm；

4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉(hepes鈉鹽)20mm；

il-75μg；

il-15異二聚體7.5μg；

x-vivo基本培養(yǎng)基848ml。

其中，上述培養(yǎng)基是采用如下方法配制得到：將n-乙?；?l-半胱氨酸溶于x-vivo基本培養(yǎng)基中，得到濃度為1m的n-乙?；?l-半胱氨酸溶液；將l-丙氨酰-l-谷氨酰胺(glutamax)溶于x-vivo基本培養(yǎng)基中，得到濃度為0.2m的glutamax溶液；將丙酮酸鈉溶于x-vivo基本培養(yǎng)基中，得到濃度為0.1m的丙酮酸鈉溶液；將4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉(hepes)溶于x-vivo基本培養(yǎng)基中，得到濃度為2m的4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉(hepes)溶液；將il-7溶于x-vivo基本培養(yǎng)基中，得到濃度為5μg/ml(w/v)的il-7溶液；將il-15異二聚體溶于x-vivo基本培養(yǎng)基中，得到濃度為7.5μg/ml(w/v)的il-15異二聚體溶液；mem維生素溶液購買自sigma公司，其濃度為100x。

分別取上述10ml的n-乙酰基-l-半胱氨酸溶液、10ml的glutamax-i溶液、10ml的丙酮酸鈉溶液、10ml的4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉hepes溶液、1ml的il-7溶液、1ml的il-15異二聚體溶液，10ml的mem維生素溶液相混合，加入100ml的人ab血清，將上述各組分混合均勻后，加入x-vivo基本培養(yǎng)基定容至1l，采用孔徑為0.22μm的濾膜進行過濾，得到培養(yǎng)人源t淋巴細胞的培養(yǎng)基(以下統(tǒng)稱“t細胞完全培養(yǎng)基”)。

實施例2

一種培養(yǎng)和促進人源t淋巴細胞高效擴增的培養(yǎng)基，其中，每1l所述培養(yǎng)基中包括如下含量的各組分：

本實施例中所述培養(yǎng)基的配制方法與實施例1的配方方法類似，這里不再描述。

實施例3

一種培養(yǎng)和促進人源t淋巴細胞高效擴增的培養(yǎng)基，其中，每1l所述培養(yǎng)基中包括如下含量的各組分：

本實施例中所述培養(yǎng)基的配制方法與實施例1的配方方法類似，這里不再描述。

實施例4

一種培養(yǎng)和促進人源t淋巴細胞高效擴增的培養(yǎng)基，其中，每1l所述培養(yǎng)基中包括如下含量的各組分：

為突出本發(fā)明的技術(shù)效果，針對上述實施例1設(shè)置以下2個對比實施例：

對比實施例1

一種培養(yǎng)基，每1l所述培養(yǎng)基中包括如下含量的各組分：

對比實施例2

一種培養(yǎng)基，每1l所述培養(yǎng)基中包括如下含量的各組分：

應(yīng)用實施例：

采用實施例1制得的上述培養(yǎng)基用于免疫治療中人源t淋巴細胞的培養(yǎng)，包括以下步驟：

(一)pbmc細胞(人外周血單個核細胞)的分離

1.1抽取病人血液，送樣至血液分離室。

1.2用單采機采集外周血單個核細胞，ficoll離心分離后取中間層細胞；采用磷酸鹽緩沖溶液(pbs，ph＝7.4)洗滌，得到pbmc。

(二)免疫磁珠法分離t淋巴細胞

2.1取上述分離出的人外周血單個核細胞(pbmc)，加入x-vivo基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制成第一細胞懸浮液；

2.2加入cd3免疫磁珠，室溫孵育3小時后，采用磁鐵進行分離，并用pbs洗滌，得到磁珠分選后的cd3陽性t淋巴細胞，其中，所述cd3免疫磁珠與所述pbmc的加入比例為3:1。

(三)病毒轉(zhuǎn)染法制備抗原特異性t淋巴細胞

3.1取上述經(jīng)過免疫磁珠分離法得到的cd3陽性t淋巴細胞，加入本發(fā)明實施例1中的t細胞完全培養(yǎng)基，重懸制成第二細胞懸浮液，培養(yǎng)1天；

3.2在培養(yǎng)的第2天，換液(去除舊培養(yǎng)基，加入實施1中的t細胞完全培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)1天；

3.3在培養(yǎng)的第3天，加入相應(yīng)病毒滴度的病毒，其中，所述病毒為腺病毒，所述病毒的病毒滴度為1×10⁸tu/ml(transducingunits)，采用所述t細胞完全培養(yǎng)基來調(diào)整細胞濃度為1×10⁶個/ml，接種，得到抗原特異性t淋巴細胞；

(四)擴增培養(yǎng)上述抗原特異性t淋巴細胞

4.1第3-4天，取步驟(三)得到的抗原特異性t淋巴細胞，采用所述t細胞完全培養(yǎng)基進行擴增培養(yǎng)，并注意控制細胞濃度為1×10⁶個/ml，在擴增培養(yǎng)過程中觀察細胞形態(tài)、檢測細胞活性；

4.2待擴增培養(yǎng)到第11-13天，收集細胞，即得到擴增后的抗原特異性t淋巴細胞細胞。

所得到的抗原特異性t淋巴細胞進行后續(xù)腫瘤殺傷實驗、細胞增殖實驗、病毒殘留檢測實驗、回輸至患者體內(nèi)等。也可以進行凍存，以在需要時復(fù)蘇后使用。

需要說明的是，上述cd3免疫磁珠，用于純化和篩選cd3+陽性t淋巴細胞，并且具有促進t淋巴細胞活化的功能，可刺激t淋巴細胞增殖。

上述病毒為腺病毒，具有復(fù)制和表達蛋白的性能，在轉(zhuǎn)染t淋巴細胞后，可在t細胞膜表面表達腺病毒載體所攜帶基因的特異性抗原。

效果實施例：

同時為了評估本發(fā)明所描述的上述t細胞完全培養(yǎng)基(實驗組)對抗原特異性t淋巴細胞培養(yǎng)的擴增速度和腫瘤殺傷能力的影響，選用人來源的血液進行外周血單個核細胞分離、cd3免疫磁珠法分離t淋巴細胞、病毒轉(zhuǎn)染法制備抗原特異性t淋巴細胞等步驟，最后將所得的抗原特異性t淋巴細胞做體外細胞培養(yǎng)實驗。同時設(shè)置以下6組對照組，其中，對照組1為optmizet-cellexpansionsfm培養(yǎng)基；對照組2為aim-vmediumcts培養(yǎng)基；對照組3為ham'sf-12medium；對照組4為improvedmem培養(yǎng)基；對照組5為rpmi1640medium；對照組6為leibovitzmedium。其中，對照組5：是向900ml的rpmi1640中添加100ml的胎牛血清(熱滅活胎牛血清-澳大利亞原產(chǎn)；公司：gibco；貨號：10100147；)。

1、評估細胞增殖情況：

將抗原特異性t淋巴細胞細胞按10⁶/ml的濃度接種后，分別采用optmizer^tmt-cellexpansionsfm、aim-vmediumcts、ham'sf-12medium、improvedmem、rpmi1640medium和leibovitzmedium這6種常規(guī)培養(yǎng)基作為對照組(編號分別為對照組1至6)的培養(yǎng)基，以及本發(fā)明實施例1提供的所述t細胞完全培養(yǎng)基作為實驗組的培養(yǎng)基來進行細胞培養(yǎng)，在37℃，5％co2下進行培養(yǎng)5天后，通過cfse流式細胞儀檢測法來檢測細胞增殖情況，結(jié)果如附圖1所示。

2、評估腫瘤殺傷能力的影響：

將抗原特異性t淋巴細胞細胞按10⁶/ml的濃度接種后，分別采用optmizer^tmt-cellexpansionsfm、aim-vmediumcts、ham'sf-12medium、improvedmem、rpmi1640medium和leibovitzmedium這6種常規(guī)培養(yǎng)基作為對照組(編號分別為對照組1至6)的培養(yǎng)基，以及本發(fā)明實施例1提供的所述t細胞完全培養(yǎng)基作為實驗組的培養(yǎng)基，與腫瘤細胞系nalm-6在37℃，5％co2下進行共培養(yǎng)，其中，控制各組的效應(yīng)t細胞與腫瘤細胞系的比例為1:1，分別使用流式抗體cd3(fitc)(fitcanti-humancd3antibody；公司：biolegend；貨號：300406)、cd19(apc)(apcanti-humancd19antibody；公司：biolegend；貨號：302212)來染色，培養(yǎng)16小時后通過流式細胞儀來檢測腫瘤殺傷情況，結(jié)果如附圖2所示。

從圖1可以看出，與對照組的6種常規(guī)培養(yǎng)基相比，采用本發(fā)明提供的所述t細胞完全培養(yǎng)基，可以使抗原特異性t淋巴細胞的增殖速度分別提高97.6％、135.4％、333.5％、206.2％、50.7％和90.3％。即，較常規(guī)培養(yǎng)基而言，在對相同細胞采取相同的培養(yǎng)條件下，本發(fā)明提供的所述t細胞完全培養(yǎng)基可以使抗原特異性t淋巴細胞的增殖速度明顯提高1-3倍。

從圖2可以看出，與對照組的6種常規(guī)培養(yǎng)基相比，采用本發(fā)明提供的所述t細胞完全培養(yǎng)基，可以使抗原特異性t淋巴細胞對與之共培養(yǎng)的腫瘤細胞nalm-6的腫瘤殺傷能力分別提高65.1％、209.8％、201.1％、112.7％、129.2％和91.3％。即，較常規(guī)培養(yǎng)基而言，在相同條件下，本發(fā)明提供的所述t細胞完全培養(yǎng)基可以使抗原特異性t淋巴細胞的腫瘤殺傷活性提高了1-2倍。

此外，采用同樣的方法分別評估本發(fā)明實施例1-4提供的t細胞完全培養(yǎng)基以及上述對比實施例1-2的培養(yǎng)基對抗原特異性t淋巴細胞的增殖情況以及其對腫瘤殺傷能力的影響。細胞增殖情況的結(jié)果如圖3所示，腫瘤殺傷情況的結(jié)果如附圖4所示。其中，與實施例1相比，對比例1沒有采用人ab血清，對比例2沒有使用il-7。

從圖3可以看出，本發(fā)明實施例1-4提供的t細胞完全培養(yǎng)基可以使抗原特異性t淋巴細胞的增殖倍數(shù)分別達到125％、115％、120％、100％，而對比例1-2的細胞增殖倍數(shù)僅分別達到40％、90％。這說明本發(fā)明實施例提供的t細胞完全培養(yǎng)基可以使抗原特異性t淋巴細胞的增殖速度明顯提高。

從圖4可以看出，本發(fā)明實施例1-4提供的t細胞完全培養(yǎng)基可以使抗原特異性t淋巴細胞對與之共培養(yǎng)的腫瘤細胞nalm-6的腫瘤殺傷能力分別達到86％、80％、85％；而對比例1-2的腫瘤殺傷能力僅分別達到57％、60％、75％。以上對比說明本發(fā)明實施例提供的t細胞完全培養(yǎng)基可以使抗原特異性t淋巴細胞的腫瘤殺傷活性顯著提高。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。