本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是TPO基因的saRNA分子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因治療是將正?；蚧蛑委熁?qū)氚屑?xì)胞從而達(dá)到疾病治療目的的一種新型治療手段。近年來全世界范圍內(nèi)開展了許多針對(duì)腫瘤的基因治療方法研究，其中RNA激活(RNA activation，RNAa)是近年來發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的一門新興基因技術(shù)，為一種采用短雙鏈RNA調(diào)控基因表達(dá)的技術(shù)，可激活細(xì)胞的內(nèi)源性基因，從而實(shí)現(xiàn)目的基因表達(dá)上調(diào)的新技術(shù)。RNA激活技術(shù)的開發(fā)為將基因技術(shù)與放射性核素療法相結(jié)合以靶向治療腫瘤提供了極其有前景的選擇。

鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Human sodium iodide symporter,hNIS)和人甲狀腺過氧化物酶(Human thyroidperoxidase，hTPO)主要在甲狀腺組織表達(dá)，在甲狀腺疾病的診斷和治療中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。許多學(xué)者報(bào)道了用不同方法轉(zhuǎn)導(dǎo)hNIS基因介導(dǎo)非甲狀腺腫瘤細(xì)胞碘攝取的體內(nèi)外研究，證實(shí)了轉(zhuǎn)導(dǎo)hNIS基因的瘤細(xì)胞可以提高攝取放射性核素碘(¹³¹I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I)的能力，從而實(shí)現(xiàn)放射性核素治療目的。

影響放射性碘療效的另一個(gè)重要因素是碘在胞內(nèi)的滯留時(shí)間，如果放射性碘在細(xì)胞內(nèi)停留時(shí)間短，其臨床應(yīng)用價(jià)值就會(huì)受到一定的限制。hTPO是甲狀腺激素合成酶系的關(guān)鍵酶，可有效延緩碘從胞內(nèi)流出，它催化碘的氧化、甲狀腺球蛋白(TG)上酪氨酸殘基的碘化和碘化酪氨酸的偶聯(lián)以生成三碘甲腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4)。細(xì)胞內(nèi)的碘經(jīng)hTPO催化后以有機(jī)化碘的形式存在，有效地延緩碘的外流，提高了¹³¹I的抑瘤效果。

通過RNA激活技術(shù)，讓腫瘤細(xì)胞攝取碘使碘在腫瘤細(xì)胞內(nèi)滯留，利用大劑量放射性核素的輻射生物效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞，有望成為放射性核素靶向治療甲狀腺和非甲狀腺腫瘤的新途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供TPO基因的saRNA分子，能有效激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)或不表達(dá)的TPO基因，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞滯留放射性核素¹³¹I的生物學(xué)功效。

本發(fā)明具體的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明公開了TPO基因的saRNA分子，其序列與TPO基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游6000bp和下游1000bp區(qū)域的序列SEQ ID NO:1互補(bǔ)，增加TPO基因的表達(dá)。其中，序列SEQ ID NO:1中第6001到6010個(gè)堿基為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)TSS。

優(yōu)選的，所述saRNA分子序列與TPO基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5500bp和下游800bp區(qū)域的序列SEQ ID NO:2互補(bǔ)。

所述saRNA分子序列為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。優(yōu)選為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

上述saRNA分子用于針對(duì)TPO基因的啟動(dòng)子序列區(qū)域，激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)TPO基因，增加TPO基因的表達(dá)。

本發(fā)明還包括一種用于激活TPO基因的組合物，該組合物包括至少第一條核糖核酸鏈，所述第一條核糖核酸鏈序列為SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中之一，其與TPO基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游6000bp和下游1000bp區(qū)域的序列SEQ ID NO:1互補(bǔ)，增加TPO基因的表達(dá)。

優(yōu)選的，所述組合物還包括第二條核糖核酸鏈，當(dāng)所述第一條核糖核酸鏈序列為SEQ ID NO:3所示，所述第二條核糖核酸鏈序列為SEQ ID NO:4；當(dāng)所述第一條核糖核酸鏈序列為SEQ ID NO:5所示，所述第二條核糖核酸鏈序列為SEQ ID NO:6；當(dāng)?shù)谝缓颂呛怂徭湠橐粋€(gè)序列由SEQ ID NO:7，第二個(gè)核糖核酸鏈為SEQ ID NO:8的序列。

作為一種優(yōu)選的可實(shí)施方式，所述組合物可包含至少一種saRNA分子，其含有一個(gè)核糖核酸的序列，選自序列SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8，其中優(yōu)選為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或?yàn)榕c序列SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中之一具有至少99％，95％，90％，85％，或更少序列同一性的序列。

作為一種優(yōu)選的可實(shí)施方式，所述組合物包括兩個(gè)或多個(gè)的saRNA分子，所述saRNA分子的序列為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，與靶基因TPO的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的不同位置互補(bǔ)。

優(yōu)選的，本發(fā)明中的組合物可以為重組質(zhì)粒，用于在特定組織或在特定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的所述saRNA分子的表達(dá)，誘導(dǎo)型或調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，增加TPO基因的表達(dá)。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體，藥學(xué)上可接受的稀釋劑，藥學(xué)上可接受的賦形劑和藥學(xué)上可接受的佐劑中的至少一種。

另外，本發(fā)明還包括一種增強(qiáng)細(xì)胞中TPO基因表達(dá)的方法，即將所述saRNA分子引入到動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核中。

另外，本發(fā)明還公開了上述saRNA在制備放射性核素靶向治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的TPO基因的saRNA分子，其能有效地激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)或不表達(dá)的TPO基因，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞滯留放射性核素¹³¹I的生物學(xué)功效，為基因技術(shù)與放射性核素療法相結(jié)合以靶向治療腫瘤提供了新方法和新分子靶點(diǎn)，對(duì)開發(fā)腫瘤的靶向治療新策略具有重要意義，具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

圖1：saRNA設(shè)計(jì)示意圖；

圖2：RT-PCR量化hTPO-saRNA介導(dǎo)的HepG2細(xì)胞系hTPO mRNA上調(diào)水平分析圖；

圖3：Western blot顯示hTPO-saRNA介導(dǎo)的Hep肝癌細(xì)胞系hTPO蛋白升高水平圖，其中，圖3-A為Western blot成像圖，圖3-B為Western Blot量化分析圖；

圖4：hNIS-saRNA與hTPO-saRNA轉(zhuǎn)染組與hNIS-saRNA組的肝癌細(xì)胞的攝碘能力。

具體實(shí)施方式

本文所用的術(shù)語“基因”包括，在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中存在時(shí)，有利于生產(chǎn)的基因產(chǎn)物的核酸序列。“基因”可以包含核酸序列編碼的蛋白質(zhì)，不編碼蛋白質(zhì)的序列，包括基因的宿主細(xì)胞是內(nèi)源性的，或者是完全或部分重組(例如，由于啟動(dòng)子的外源多核苷酸，其編碼的引入和編碼序列，或相鄰的內(nèi)源性的編碼序列，導(dǎo)入宿主細(xì)胞)的異源啟動(dòng)子的介紹。例如，術(shù)語“基因”包括核酸，可以由外顯子和內(nèi)含子組成。編碼蛋白質(zhì)的序列，例如，包含于外顯子的序列，該序列在起始密碼子和終止密碼子的開放閱讀框之間?！盎颉痹诒疚闹惺侵敢环N核酸，包括，例如調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子，和本領(lǐng)域中已知的所有其他序列可操作地連接或可操作地相關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，或活化的核酸序列，包括編碼序列或非編碼序列。在本文中，例如，“基因”被用于描述包括調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子和編碼非編碼序列的核酸。由一個(gè)或多個(gè)異源調(diào)節(jié)序列的重組基因的表達(dá)可被控制?！爱愒础敝傅氖莾蓚€(gè)要素，一般都不會(huì)在本質(zhì)上相關(guān)聯(lián)。

術(shù)語“細(xì)胞”是指任何哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，包括人類的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，是指在體內(nèi)的細(xì)胞，例如，在生物體中，或在一個(gè)生物體的器官；或指在體外的細(xì)胞，如，在細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞保持。

saRNA可采取使用化學(xué)合成的方法獲得，如采用Dharmacon公司，Inc。的專有的ACE(R)技術(shù)的方法。

另外，人們也可以使用依賴于模板的合成方法。合成方法也可以進(jìn)行使用改性或非改性的，如本文所公開的天然或非天然的堿基。此外，合成有或沒有本文所公開的改性或非改性的核酸骨架。

另外，saRNA分子可能在宿主細(xì)胞中合成，由現(xiàn)在已知的或涉及到已知的合成saRNA分子在宿主細(xì)胞中的任何方法進(jìn)行。例如，可以表示saRNA分子使用任何合適的啟動(dòng)子的DNA載體。本發(fā)明的重組質(zhì)粒也可包括在特定組織或在特定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的saRNA分子的表達(dá)，誘導(dǎo)型或調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。選擇合適的載體，用于表達(dá)本發(fā)明的saRNA，插入saRNA到載體表達(dá)的核酸序列的方法，提供感興趣的細(xì)胞的重組載體的方法是在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明saRNA分子在表達(dá)的重組核酸載體中，可作為兩個(gè)獨(dú)立互補(bǔ)的RNA分子，或作為一個(gè)與兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)的單個(gè)RNA分子。

一旦合成，本發(fā)明的多核苷酸可能會(huì)立即被使用，或者被存儲(chǔ)以備將來使用。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸被存儲(chǔ)在適當(dāng)?shù)木彌_液中。多種緩沖液是已知在本領(lǐng)域適合用于存儲(chǔ)saRNA的。例如，緩沖液可以由100mM的氯化鉀和30mM HEPES，pH值7.5，和1mM氯化鎂。

在代表性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈多核苷酸在這樣的緩沖液中4℃存儲(chǔ)一年，保留其活性的30％至100％。更優(yōu)選地，存儲(chǔ)在這樣的緩沖液4℃，一年，它們保留其生物活性的80％至100％。為了確保saRNA的穩(wěn)定性，在使用前，它們可能會(huì)以干的形式(如凍干形式)被保留在-20℃，直到他們準(zhǔn)備使用。

在使用前，它們應(yīng)該被重新懸浮，然而，即使是一次再懸浮，例如，在上述的緩沖液，它們應(yīng)保持在-20℃下直至使用。上述緩沖液，在使用前，可被存儲(chǔ)在約4℃下或室溫下進(jìn)行。進(jìn)行轉(zhuǎn)染的有效溫度在本領(lǐng)域中的技術(shù)人員公知的，例如室溫。

方法什么方法？

本發(fā)明提供了增加hTPO基因的表達(dá)，包括引入saRNA分子到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核中，其中saRNA分子中有一個(gè)的hTPO基因的啟動(dòng)子序列的區(qū)域互補(bǔ)的鏈，導(dǎo)致hTPO基因表達(dá)增加的結(jié)果。hTPO基因的表達(dá)或活性的測(cè)量可采用本領(lǐng)域中公知的各種方法中的任何一個(gè)，包括測(cè)量靶基因的核酸的轉(zhuǎn)錄水平，靶基因的mRNA表達(dá)水平，靶基因的蛋白質(zhì)水平。

本發(fā)明是適用于整個(gè)范圍廣泛的哺乳動(dòng)物，包括但不限于人類。哺乳動(dòng)物如牛，馬，山羊，豬，羊，犬科動(dòng)物，嚙齒動(dòng)物，如倉鼠，小鼠和大鼠，和靈長(zhǎng)類動(dòng)物，大猩猩，黑猩猩和人。

轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中也可以使用，例如，哺乳動(dòng)物的嵌合基因序列。

本發(fā)明可以有利地使用具有不同類型的細(xì)胞，包括生殖細(xì)胞系、體細(xì)胞、干細(xì)胞或分化后的細(xì)胞。例如，細(xì)胞類型可以是胚細(xì)胞，卵母細(xì)胞，精子細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，血細(xì)胞，巨核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞，白細(xì)胞，粒細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞，肝細(xì)胞和內(nèi)分泌或外分泌腺細(xì)胞。

從閱讀了本文中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本領(lǐng)域中可以得出結(jié)論，本發(fā)明的分子和方法可應(yīng)用的現(xiàn)在已知的任何方法使saRNA穿過細(xì)胞膜和/或核膜，將是有益于本發(fā)明。

這些方法包括但不限于任何方式如轉(zhuǎn)染，例如，采用DEAE-葡聚糖，磷酸鈣，陽離子脂質(zhì)/脂質(zhì)體，膠束，操縱壓力，顯微注射，電穿孔，免疫穿孔，或使用載體，如病毒(如RNA病毒)、質(zhì)粒，細(xì)胞融合，和耦合的多核苷酸的特定共軛物或配體，如抗體、抗原、受體，被動(dòng)引進(jìn)saRNA，促進(jìn)其吸收。

本發(fā)明的saRNA可以用在一組不同的應(yīng)用程序的激活的靶基因，包括但不限于基礎(chǔ)研究，藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，診斷和治療。本申請(qǐng)中的靶核酸序列的確定和激活(例如，增加表達(dá))用于驗(yàn)證基因產(chǎn)物是否是藥物發(fā)現(xiàn)或開發(fā)的一個(gè)目標(biāo)。例如，細(xì)胞接觸一個(gè)針對(duì)特定的目標(biāo)的調(diào)節(jié)序列的saRNA，該信元被保持的條件下，使甲基化的目標(biāo)DNA和/或甲基化的核蛋白質(zhì)，例如一個(gè)或多個(gè)組蛋白，導(dǎo)致活性下降或一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)增加的程度，例如轉(zhuǎn)錄或翻譯的基因以及與這樣的活動(dòng)增加的效果，然后進(jìn)行評(píng)估，并判斷。如果活性增加，則核酸序列將是一種藥物發(fā)現(xiàn)或發(fā)展目標(biāo)。以這種方式，相關(guān)表型理想的saRNA在適當(dāng)?shù)那闆r下可以進(jìn)行毒性和藥代動(dòng)力學(xué)研究和開發(fā)治療制劑。

另外，本發(fā)明可以被用于在應(yīng)用活動(dòng)中，例如，預(yù)防，診斷和治療。對(duì)于這些應(yīng)用，一個(gè)體具有一個(gè)特定的靶核酸通過操縱調(diào)制疾病或病癥，經(jīng)saRNA處理的結(jié)果可能是改善，緩和，預(yù)防，和/或診斷的一個(gè)特定的疾病或紊亂。在代表性的實(shí)施例中，saRNA帶或不帶稀釋劑的藥學(xué)上可接受的載體與藥學(xué)上可接受的方式給藥。

適于治療用本發(fā)明的方法的涉及saRNAs的適應(yīng)癥包括但不限于，甲狀腺低分化和未分化腫瘤，非甲狀腺腫瘤。

本發(fā)明不應(yīng)該被解釋為僅限于具有上述疾病的患者的治療。相反，本發(fā)明應(yīng)被理解為包括或hTPO基因的表達(dá)增加的狀況或疾病的患者的治療，將受益于本發(fā)明的方法。

在一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的顯著改善療效的指標(biāo)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通醫(yī)護(hù)人員(例如，臨床醫(yī)生)根據(jù)各種因素來調(diào)整給藥方案和劑量，例如，依賴于病人的嚴(yán)重程度等因素，以對(duì)患者疾病提供最佳的給藥的化合物等。

藥物制劑

本發(fā)明提供的是上述的saRNA分子的藥物制劑。

通過本領(lǐng)域常見各種方法，saRNA化合物可制備出用于治療給藥的各種劑型。

更具體地，本發(fā)明的化合物可配制成藥物組合物與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體，稀釋劑，賦形劑和/或佐劑組合，并且可以配制成固體，半固體，液體或氣體形式的制劑，如片劑，膠囊，粉劑，顆粒劑，軟膏劑，溶液劑，栓劑，注射劑，吸入劑和氣溶膠，在無菌小瓶或注射器。

用于透皮給藥制劑，該化合物優(yōu)選配制沒有檢測(cè)到DMSO中，或與載體除了DMSO。

該制劑可被設(shè)計(jì)用于施用于受試者或患者需要其通過許多不同的給藥方式，包括口服，口腔，直腸，腸胃外，腹膜內(nèi)，皮內(nèi)，氣管內(nèi)等；給藥可以是全身性或局部性的配方治療，例如，局部輸送到腫瘤中的內(nèi)部。

此外，藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑，等滲調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定劑，潤(rùn)濕劑和類似物，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。

就本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，制備各種劑型的實(shí)際方法是已知的，或?qū)⑹秋@而易見的，參見，Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,17th edition,1985；Remington:The Science and Practice ofPharmacy,A.R.Gennaro,(2000)Lippincott,Williams&Wilkins。在任何情況下，給藥含有一定量的組合物或制劑，足以使受治療者達(dá)到理想效果狀態(tài)。在說明書中關(guān)于方案的解釋說明，不僅僅是要求一個(gè)最大的保護(hù)范圍，還要考慮的是在創(chuàng)造性的答復(fù)中，哪些特征會(huì)提高創(chuàng)造性，就要適當(dāng)?shù)倪M(jìn)行設(shè)置，如果都是常規(guī)的助劑和方法，一旦RNA分子本身沒有創(chuàng)造性，藥劑也沒有創(chuàng)造性了

在藥物劑型中，本發(fā)明的主題saRNA分子可能被它們的藥學(xué)上可接受的鹽的形式給藥，或者它們也可以單獨(dú)使用，或在適當(dāng)?shù)年P(guān)聯(lián)，以及組合，與其它藥用活性化合物。

下列方法和賦形劑是僅僅是示例性的，決不是限制性的。

常規(guī)藥學(xué)上可接受的給藥途徑，包括鼻內(nèi)，肺內(nèi)肌內(nèi)，氣管內(nèi)，瘤內(nèi)，皮下，皮內(nèi)，外敷，靜脈注射，直腸，鼻腔，口腔及其他腸外給藥途徑。給藥途徑可能被合并，如果需要的話可調(diào)整，這取決于治療程序和/或所需的效果。該組合物可以以單一劑量或多次劑量給藥。

根據(jù)主體和治療條件和給藥途徑，saRNA分子可采用合適的劑量范圍給藥，1μg至10000μg或10000μg/公斤體重每天。在某些實(shí)施例中，反復(fù)進(jìn)行給藥，直至達(dá)到所期望的效果的治療給藥。

使用本發(fā)明的化合物的組合療法

在本發(fā)明方法中使用，本發(fā)明所述saRNA分子與其他藥物如化療藥物聯(lián)合給藥，以實(shí)現(xiàn)治療目的。或本發(fā)明化合物可用于增加另一種化學(xué)品的有效性，如一種藥物，或在另一種化學(xué)物質(zhì)的量的減少。

在聯(lián)合治療中使用的化學(xué)治療劑包括，但不限于，柔紅霉素，放線菌素D，多柔比星，表柔比星，伊達(dá)比星，依索比星，博來霉素，馬磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，阿糖胞苷，卡莫司汀，白消安，絲裂霉素C，放線菌素D，光輝霉素，強(qiáng)的松，羥孕酮，睪酮，他莫昔芬(tamoxifen)，達(dá)卡巴嗪，丙卡巴肼，六甲基蜜胺，五甲密胺，米托蒽醌，安吖啶，苯丁酸氮芥，氮芥，苯丙氨酸氮芥，環(huán)磷酰胺，6-巰基嘌呤，6-硫鳥嘌呤，阿糖胞苷，5-氮胞苷，脫氧柯福霉素，羥基脲，5-氟尿嘧啶(5-FU)，5-氟脫氧尿苷(5-FUDR)，甲氨蝶呤(MTX)，秋水仙素，紫杉醇，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，鬼臼乙叉甙(VP-16)，三甲曲，伊立替康，拓?fù)涮婵?，吉西他濱，替尼泊苷，順鉑和己烯雌酚(DES)。

以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。

實(shí)施例1：saRNA的制備

根據(jù)Li等總結(jié)的RNAa原則及提供的設(shè)計(jì)軟件，針對(duì)hTPO mRNA設(shè)計(jì)合成saRNA，具體設(shè)計(jì)步驟如下：

1.NCBI檢索hTPO基因特征如下：

(1)human TPO位于染色體的位置：Chromosome 2：1413461..1542727，

(2)Accession number:NG_011581

(3)Length：129267bp

(4)UCSC檢索TSS上游6000bp下游1000基因序列如SEQ ID NO:1所示，其中，序列SEQ ID NO:1中第6001到6010個(gè)堿基為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)TSS。

根據(jù)saRNA設(shè)計(jì)原則，在TSS上游6000bp，下游1000bp范圍內(nèi)共設(shè)計(jì)合成了6個(gè)saRNA序列[saRNA-758(sa-758),saRNA-3073(sa-3073),saRNA-3860(sa-3860),saRNA-4576(sa-4576),saRNA-5198(sa-5198),saRNA-5640(sa-5640)]。并進(jìn)行BLAST同源性分析，確認(rèn)與hTPO以外的人已知基因序列無同源性。此外，另外設(shè)計(jì)合成了2個(gè)與目的基因無同源性的陰性對(duì)照dsRNA。合成各dsRNA序列見表1。每個(gè)saRNA在無菌無RNA酶的水中重懸，稀釋到合適的工作濃度(μumol/L)，并儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

表1靶向hTPO的saRNA oligomer序列

實(shí)施例2 saRNA對(duì)hTPO表達(dá)的影響

肝癌細(xì)胞HepG2用含10％胎牛血清DMEM，5％CO₂、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，2×10⁵接種于六孔板培養(yǎng)過夜。次日以上dsRNAs和dscontrol以50nM的終濃度，通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，轉(zhuǎn)染后72h，以RT-PCR技術(shù)半定量分析各組hTPO mRNA的表達(dá)量，分析RNAa對(duì)HTPO表達(dá)上調(diào)程度。

免疫印跡分析

采用PBS緩沖液清洗細(xì)胞，RIPA蛋白裂解液冰上裂解數(shù)分鐘后12,000rpm/min離心15min收集上清；BCA法檢測(cè)蛋白濃度。10％SDS-PAGE凝膠電泳約2h后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(polyvinylidene difluoride membranes)。4℃封閉過夜后，于含hTPO一抗(SantaCruz Biotechnology，INC)的PBS中4℃孵育過夜。然后將含hTPO蛋白的濾紙與辣根過氧化物酶連接的驢抗兔IgG(Immunology Consultants Laboraory，Inc)孵育1h后，熒光檢測(cè)試劑增強(qiáng)發(fā)光，Odyssey圖像分析系統(tǒng)(Gene Company Limited)下顯影和拍照。

上述操作發(fā)現(xiàn)，3個(gè)saRNA序列均可上調(diào)hTPO mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)，其中saRNA3073對(duì)HepG2細(xì)胞系hTPO mRNA表達(dá)水平上調(diào)最明顯。對(duì)RNAa效果進(jìn)行量化分析，顯示saRNA3073轉(zhuǎn)染后72h HepG2細(xì)胞系hTPO mRNA表達(dá)水平上調(diào)了2.12±0.88倍(圖2)。在HepG2細(xì)胞系6個(gè)saRNA序列轉(zhuǎn)染72h后，Western blot結(jié)果顯示，hTPO蛋白表達(dá)水平均不同程度升高，其中saRNA3073組升高最明顯，通過與內(nèi)參基因GAPDH蛋白比較的光密度量化分析，結(jié)果顯示，saRNA3073介導(dǎo)的細(xì)胞系顯示hTPO蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組分別升高了2.27±0.35倍(圖3)。

實(shí)施例3放射性核素?cái)z取實(shí)驗(yàn)

用hNIS-saRNA和/或hTPO-saRNA(saRNA-3073)序列分別轉(zhuǎn)染兩個(gè)HepG2細(xì)胞后，加入含有Na¹²⁵I溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)的各組細(xì)胞內(nèi)的放射性計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示(圖4)，聯(lián)合轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)放射性計(jì)數(shù)高于單獨(dú)hNIS-saRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P＜0.01)，在30min時(shí)，聯(lián)合轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)放射性計(jì)數(shù)是hNIS-saRNA轉(zhuǎn)染組的3.03倍。

上述實(shí)施方式旨在舉例說明本發(fā)明可為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)或使用，對(duì)上述實(shí)施方式進(jìn)行修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，故本發(fā)明包括但不限于上述實(shí)施方式，任何符合本權(quán)利要求書或說明書描述，符合與本文所公開的原理和新穎性、創(chuàng)造性特點(diǎn)的方法、工藝、產(chǎn)品，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。