本發(fā)明屬于脊柱轉(zhuǎn)移性腫瘤
技術領域：
，尤其涉及一種聚甲基丙烯酸甲酯對脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞影響的測試方法。
背景技術：
：目前，脊柱轉(zhuǎn)移性腫瘤的后果包括病理骨折、脊髓受壓，貧血，血鈣過多。肺癌、乳腺癌、腎細胞癌、淋巴瘤、甲狀腺和前列腺癌易轉(zhuǎn)移到脊柱。其中乳腺癌特別容易轉(zhuǎn)移到脊柱，發(fā)現(xiàn)其大約占骨轉(zhuǎn)移的2/3。這些脊柱病變約三分之一有癥狀，造成嚴重的疼痛，神經(jīng)受損，機械性的不穩(wěn)定，并最終導致殘疾和生活質(zhì)量嚴重惡化。然而，治療有癥狀的脊柱轉(zhuǎn)移仍多選擇姑息療法，治療的目標包括恢復和保護神經(jīng)功能，維持脊柱穩(wěn)定，緩解疼痛，以實現(xiàn)更好的生活質(zhì)量?，F(xiàn)在脊柱轉(zhuǎn)移性腫瘤患者作為手術適應癥是有爭議的，因為缺乏這方面的文獻證據(jù)作為基礎。目前，人們普遍認為積極的手術切除可能適合至少3個月預期生存患者表現(xiàn)為進行性神經(jīng)壓迫，脊柱不穩(wěn)定，但其也會為患者進一步帶來手術創(chuàng)傷，新的外科技術微創(chuàng)手術等顯示效果實現(xiàn)神經(jīng)改善和緩解疼痛，減少失血，手術時間、并發(fā)癥發(fā)生率。椎體成形術是一經(jīng)皮的微創(chuàng)手術，椎體成形術在熒光或CT引導下將PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯polymethylmethacrylate，PMMA)直接注入椎體內(nèi)并在椎體內(nèi)固化，固化后的骨水泥不僅可以從內(nèi)部穩(wěn)定病理性壓縮骨折、恢復椎體高度、防止進一步壓縮骨折和糾正脊柱后凸的畸形，還可以限制腫瘤的生長范圍和擴散空間。鎮(zhèn)痛屬性被認為除了機械穩(wěn)定外第二重要的功能，可能與骨水泥對神經(jīng)末梢疼痛的熱效應和抗腫瘤細胞毒性效應有關。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種聚甲基丙烯酸甲酯對脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞影響的測試方法，旨在評估PMMA對原代培養(yǎng)腫瘤細胞增殖過程中的殺滅作用以及PMMA在體外對腫瘤細胞可能的細胞毒性影響作用機制。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種聚甲基丙烯酸甲酯對脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞影響的測試方法，所述聚甲基丙烯酸甲酯對脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞影響的測試方法將不同階段的PMMA骨水泥處理原代培養(yǎng)脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞24h；測量骨水泥內(nèi)部以及表面溫度，并分別觀察拉絲期骨水泥所釋放的熱量對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響；采用流式細胞術測量細胞凋亡和細胞周期。PMMA對Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8、Fas和PARP在與細胞凋亡的關系；cyclinD1，P21andP27與細胞周期的關系是由SYBRGreenⅠ熒光定量PCR法和westernblot檢測的。。進一步，所述聚甲基丙烯酸甲酯對脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞影響的測試方法包括以下步驟：步驟一，腫瘤組織收集；步驟二，將臨床手術/活檢所取腫瘤標本置于含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液的已消毒培養(yǎng)皿中，帶回實驗室處理；步驟三，骨水泥的調(diào)和與作用方式，使用盤形骨水泥樣本進行細胞實驗；將骨水泥聚合粉體和液體單體倒入已消毒的不銹鋼碗中，并不斷攪拌使之均勻，攪拌30s～60s逐漸粘稠后吸入骨水泥注射器內(nèi)后轉(zhuǎn)移到模具中，在19℃的室內(nèi)，將拉絲期或者完成聚合階段的骨水泥從模具中取出，轉(zhuǎn)移到24孔的細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，將聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥加入脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞后24小時進行下一步檢測；步驟四，分別采用骨水泥以及拉絲期骨水泥與腫瘤細胞共培養(yǎng)的方式，分別觀察三個不同聚合階段，特別是拉絲期所釋放的熱量對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響；分別取1d,2d,3d三個不同聚合時間點測量細胞增殖；將0.2，0.3,0.4，0.5ml拉絲期骨水泥分別與1X106/孔腫瘤細胞共培養(yǎng)，采用AnnexinV/PI測量細胞凋亡，觀察凋亡率是否與骨水泥量呈劑量相關性；步驟五，將骨水泥混合后于室溫注入0.5ml于6孔板中后，待骨水泥進入拉絲期后置于37℃溫水水浴箱中，以模擬椎體成型術中聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥被注入人體后的體溫環(huán)境；而后取工業(yè)水銀溫度計，將水銀頭放入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥中測骨水泥內(nèi)部溫度的變化，并以皮溫計測骨水泥表面溫度變化，每0.5min記錄一次，至溫度回落直40℃為止；重復4次；步驟六，將拉絲期骨水泥這注入模具中，制備成圓盤形的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥樣品，砂紙打磨拋光，用去離子水中超聲清洗5min，吹干后常規(guī)消毒；再將骨水泥樣品完全浸入10％胎牛血清中培養(yǎng)，放置在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中浸泡72小時，后將浸出液取出凍存于-85℃冰箱中備用，樣品表面積與培養(yǎng)液體積比例為1:1.3；腫瘤細胞被一式三份按1×106的密度植入在96孔板里，每孔加入100μl浸出液，取1d，2d，3d三個時間點進行MTT測試；步驟七，取對數(shù)生長期的原代轉(zhuǎn)移瘤細胞以1X106個/孔接種于六孔板中，24H后將處于拉絲期0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml骨水泥加入到每孔細胞中，并將骨水泥分別以拉絲期和冷卻凝固期按上述方法放置于細胞中，同時設陰性對照組，第48小時，用0.25％胰酶分別消化骨水泥實驗組以及對照組轉(zhuǎn)移瘤細胞，制成單細胞懸液，取1ml轉(zhuǎn)移瘤細胞，l000r/min4℃離心5min，吸取并棄上清液，重復2次該步驟，隨后緩緩注入1ml預冷的PBS，加以震蕩使細胞懸浮，然后l000r/min4℃離心5min，并棄上清液，將經(jīng)上述處理過后細胞重懸于200μl結(jié)合緩沖液，并加入10μlAnnexinV—FITC和5μlPI，輕輕將以上物質(zhì)混勻，避光條件下室溫反應15min，加入300μl結(jié)合緩沖液，即刻使用流式細胞儀進行檢測；光源488nm氬離子激光器，當FITC受激發(fā)后會發(fā)出綠色的熒光，PI會發(fā)出紅色的熒光；步驟八，將培養(yǎng)的對數(shù)生長期轉(zhuǎn)移瘤細胞消化接種到六孔板內(nèi)，24h后按上述方法將PMMA作用于轉(zhuǎn)移瘤細胞，同時設立陰性對照組，48小時后將漂浮以及貼壁轉(zhuǎn)移瘤細胞一同用0.25％胰酶消化收集，用PBS輕緩的洗滌細胞2次，收集細胞并使用PBS調(diào)整細胞濃度至1×106/ml，加入70％乙醇至細胞中制備成單細胞懸液，4℃固定過夜；加入染色緩沖液37℃水浴30min；再加入PI染色混勻，4℃避光30min；用流式細胞儀檢測，記錄激發(fā)波長488nm處紅色熒光，重復4次；步驟九，RNA提取以及real-time定量PCR實驗；引物合成：PCR引物序列是以NCBI所提供的每種基因的NM編號，通過生物軟件設計，再利用DNA生物合成儀制成；提取總RNA步驟；紫外分光光度計測提取RNA的純度和濃度：步驟十，冰上提取細胞總蛋白，蛋白濃度測定，免疫印跡反應。進一步，到實驗室后于無菌操作臺內(nèi)迅速移入含雙抗內(nèi)含青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml的PBS液中洗滌2～3次，用組織剪剔除脂肪組織、壞死組織和血塊，用PBS液沖洗2～3次后放入10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液浸泡，使用眼科剪剪碎為近似1mm3大小的塊狀，使用0.125％胰酶消化分解切碎的樣本，通過無菌200目篩網(wǎng)過濾器過濾后將濾網(wǎng)表面的組織收集到一新50ml離心管內(nèi)，用離心機1200rpm×5分鐘分離細胞，清洗三次后1640培養(yǎng)液重懸而后加入10％的胎牛血清5×105細胞/毫升，最后腫瘤細胞在5％CO237℃的環(huán)境下孵育培養(yǎng)。進一步，MTT測試包括：添加50μl的MTT到每個孔，然后培養(yǎng)皿在37℃培養(yǎng)4h。吸取上清液后，加入150μl二甲亞砜并混合，用全自動多功能酶標儀在波長492nm測吸光度。進一步，提取總RNA步驟包括：將對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)移瘤細胞消化并接種到六孔板，次日，將骨水泥以不同時期形式加入轉(zhuǎn)移瘤細胞中作用，并同時設陰性對照組；24h后，從處理后的腫瘤細胞中按RNAislPLUSKIT提取說明書提取總RNA：備好氯仿和異丙醇，向細胞中注入1ml的BiozolReagent裂解樣品：因為脊柱腫瘤細胞是貼壁細胞，吸干凈培養(yǎng)基，隨后往培養(yǎng)瓶內(nèi)注入BiozolReagent，槍頭反復吸取混勻細胞，隨后移入1.5ml離心管中；裂解液置于室溫下2～3min，加入0.5ml氯仿，蓋好蓋后劇烈振動15s；在4℃下12000g高速離心3min，溶液分層為酚氯仿，中間相和水相，RNA位于水相轉(zhuǎn)移不超過80％上清液于新的離心管中，加入0.5倍的異丙醇，在室溫下以最大速度渦旋15s；將小于700μl的混合液轉(zhuǎn)移至ezBindRNA柱中，將會形成沉淀，將沉淀一起轉(zhuǎn)移到RNA柱內(nèi)，室溫下10000g離心30～60s，舍棄廢液后重新用收集管重復上一步驟將剩余樣品過柱，離心，棄廢液最后丟棄收集管；將RNA柱放入一新的2ml收集管內(nèi)，加入300μlBufferRB，按上述條件離心棄廢液；將柱子放在收集管中，加入400μlBufferRB，離心棄廢液；將柱子放在收集管中，加入600μlRNAwashbuffer，離心棄廢液；再次重復上述步驟一次；隨后13000g高速空離心2分鐘；最后洗脫RNA，即將柱子轉(zhuǎn)移到新的1.5ml收集管內(nèi)，加入30～50μlDEPC-TRENTEDddH2O，放置2分鐘，10000g高速離心1min。進一步，紫外分光光度計測提取RNA的純度和濃度包括：1)開機預熱10分鐘；2)基線校正：用重蒸水加入比色杯中洗滌，用吸水紙吸干水分，加入TE緩沖液后放入儀器后進行基線校正；3)取2μl提取出的RNA，加入68μlDEPC水稀釋，共70μl進行測量；4)采用合格的RNA標本，按TAKARA說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。進一步，于冰上提取細胞總蛋白具體包括：棄轉(zhuǎn)移瘤細胞培養(yǎng)基，PBS洗2次，吸干PBS后再加入2mlPBS，使用細胞刮輕緩刮取細胞，重復一次將刮取下的細胞轉(zhuǎn)移至10ml玻璃離心管內(nèi)，離心1000rpm5分鐘棄上清后加1mlPBS，吹勻后轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管內(nèi)，4000rpm2分鐘再棄上清，加入含PMSF蛋白酶抑制劑、RIPA磷酸酶抑制劑的細胞裂解液120μl，冰上反復吹打2分鐘冰上靜置30分鐘，振蕩一次/5min，12000rpm，4℃低溫離心15分鐘，吸取上清置入另一1.5mlEP管，并放冰上，取部分做pro濃度測定、煮沸變性：上樣緩沖液為4：1，-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。進一步，蛋白濃度測定方法包括：應用BCA蛋白濃度測定試劑盒，并按照濃度測定試劑說明書中所注明步驟操作：按A:B＝50:1配制BCA工作液配制25mg/ml的蛋白標準溶液，取25mg/ml的蛋白標準溶液，稀釋至終濃度為0.5mg/ml稀釋標準品，每一種蛋白梯度和樣品做2個復孔；將標準品按0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，12μl，16μl，20μl加到96孔板視為標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20μl，加適當體積樣品到96孔板的視為樣品孔中，加標準品稀釋液到20μl，各孔加入200μlBCA工作液，37℃孵箱內(nèi)放置30分鐘；取出于室溫中冷卻到室溫，使用之前預熱好的酶標儀測定57Onm時的吸光度。進一步，免疫印跡反應具體包括：1)首先安裝好電泳儀的玻璃板，根據(jù)不同目的蛋白分子量大小來配制8％～12％不同濃度的SDS-PAGE分離膠，灌注并加水液封，放置在室溫中30min-60min以上；2)濃縮膠灌制：等待分離膠凝固后，倒去膠面上層水，用濾紙吸干分離膠表面的水份；沿膠槽邊緣迅速注入濃縮膠，然后沿水平方向輕輕插入梳子后放15分鐘；3)當濃縮膠完全聚合后就可以將梳子取出，再用蒸餾水對準樣品孔進行沖洗，再把玻璃板固定在電泳儀的電泳槽中，注入電泳緩沖液；4)以BCA法制備的變性的蛋白樣品取出，按預定順序加樣，從兩邊分別向加樣孔注入30μl緩沖液；5)電泳：以恒壓模式電泳，以80V的電壓預電泳30分鐘，當上樣緩沖液至兩種膠的交界線處時，將電壓調(diào)到100V繼續(xù)電泳；電泳直至膠條中蛋白Marker的各條帶都被徹底的分離時即終止電泳，約120分鐘；6)切膠；7)轉(zhuǎn)膜：在電泳結(jié)束前將轉(zhuǎn)膜緩沖液準備好，標記PVDF膜后將纖維墊片、濾紙、硝酸纖維素濾膜等一起浸入電轉(zhuǎn)緩沖液中做平衡準備，待電泳結(jié)束取出凝膠，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10分鐘；8)按照順序安裝轉(zhuǎn)移裝置：底上墊一張海綿墊-三層濾紙-凝膠條-PVDF膜-三層濾紙-海綿墊片，將各層不留氣泡的完全對齊，由下而上順序固定在夾層盒。再將夾子放進電轉(zhuǎn)槽中，并將夾的黑面與槽子黑面相對，白面與槽紅面相對。槽放入加入冰塊的盒中，根據(jù)目標蛋白分子量定轉(zhuǎn)膜時間，轉(zhuǎn)膜完畢后膠條用考馬斯亮藍染色，用于判斷目標蛋白的轉(zhuǎn)膜效率；9)TBST配制及封閉：250μlTween20加入→500mlPBS，將膜用5％的脫脂奶粉在搖床上封閉1h，再用TBST漂洗1次；10)一抗孵育：加入稀釋的一抗，室溫下振蕩lh，4℃冰箱過夜孵育。TBST洗2次以上，每次10min，加入以5％脫脂奶粉的TBST溶液按1:1000稀釋HRP標記的羊抗兔二抗，室溫條件下?lián)u床振蕩孵育2h，取出二抗，37℃孵化1小時。再在脫色搖床上搖動，用TBST漂洗3次以上，每次5min；11)化學發(fā)光、圖像采集：配制ECLPlus試劑發(fā)光反應液，振蕩使之混合均勻，將膜緩沖液中取出，貼角用濾紙貼角吸干殘余緩沖液，固定在片盒中，滴加發(fā)光反應液，chemiDocXRS+成像系統(tǒng)進行圖像采集。本發(fā)明提供的聚甲基丙烯酸甲酯對脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞影響的測試方法，擬通過體外PMMA處理原代培養(yǎng)椎體轉(zhuǎn)移瘤細胞，以Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8、Fas等凋亡基因為切入點，采用realtime-PCR、Westernblot及流式細胞儀等檢測腫瘤細胞凋亡率變化及可能的凋亡途徑，闡明其對腫瘤細胞的影響的分子機制。同時對臨床行PVP的患者進行隨訪，記錄患者術后及長期的疼痛緩解與生活質(zhì)量，為PMMA治療脊柱轉(zhuǎn)移瘤的研究找到新的突破口和切入點；第一次運用經(jīng)皮椎體成型術(Percutaneousvertebroplasty，PVP)是用于治療頸椎血管瘤。隨著經(jīng)皮注射方式和骨水泥的改進，迅速推廣運用于治療原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性脊柱疾病。有限的侵襲性和快速改善疼痛使它吸引不同的臨床醫(yī)生和患者。PMMA由粉劑的聚合物和液態(tài)的單體兩部分組成。PMMA單體與聚合物攪拌時會因聚合反應而產(chǎn)熱。聚合后按按不同的物理狀態(tài)分為稀薄期、拉絲期和固化期3個階段，初期攪拌骨水泥時呈不產(chǎn)熱液體狀，可自由流動；隨后逐漸變得粘稠糊狀，仍然有一定的液態(tài)性質(zhì)；最后骨水泥行程牙膏狀直至硬化為堅固的固態(tài)物體。在逐漸硬化的過程中骨水泥會釋放熱量，溫度急劇增高。由此注入骨水泥不僅能夠鞏固和穩(wěn)定被腫瘤細胞破壞的椎體，由于化學毒性和熱效應它還提供了一些局部的抗腫瘤效果。本發(fā)明的目的是評估PMMA對原代培養(yǎng)腫瘤細胞的增值和死亡的作用以及調(diào)查PMMA在體外對腫瘤細胞可能的細胞毒性機制；首次了解體外PMMA對原代培養(yǎng)脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞作用的分子機制，提供了一個隊凋亡分子元素表達的綜合研究，F(xiàn)as，Bcl-2/Bax，Caspase-3，9和細胞周期分子因素cyclineD1，P21和P27，從而為經(jīng)皮椎體成型術注入骨水泥PMMA可用于脊柱轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療提供了一個理論基礎。與對照組相比，使用PMMA刺激后的細胞生長更加顯著的緩慢。此外雖然冷卻期的PMMA治療組與對照組的凋亡率區(qū)別不大，但PMMA組細胞凋亡率明顯高于對照組。冷卻后PMMA組、拉絲期PMMA組、對照組的凋亡率分別為(28.57±8.31)％、(41.87±7.35)％、(4.08±1.09)％，各組凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)；相應的G0/G1期細胞比率為(50.91±6.23)％、(77.04±8.61)％和(38.89±9.27)％，PMMA兩組G0/G1期細胞也顯著衰減；此外，PMMA刺激的原代培養(yǎng)細胞中，分子標記的細胞凋亡，包括Fascaspase-3caspase-9激活，Bcl-2/Bax失調(diào)。此外，我們評估細胞周期有關基因周期蛋白cyclinD1，P21andP27。結(jié)果表明在PMMA治療組中cyclinD1更低水平的表達，而P21升高(P<0.05)。；PMMA骨水泥能夠明顯誘導轉(zhuǎn)移瘤細胞凋亡和阻止細胞在G0/G1期，它為注入骨水泥治療脊椎轉(zhuǎn)移瘤提供了實驗證據(jù)。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例提供的聚甲基丙烯酸甲酯對脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞影響的測試方法流程圖。圖2是本發(fā)明實施例提供的分析PMMA治療對細胞生長和生存能力的影響作用示意圖。圖3是本發(fā)明實施例提供的流式細胞儀檢測不同劑量骨水泥誘導的脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞凋亡示意圖；圖4是本發(fā)明實施例提供的流式細胞儀檢測骨水泥誘導的脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞凋亡示意圖；圖5是本發(fā)明實施例提供的流式細胞儀檢測骨水泥誘導的脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞周期作用示意圖；圖6是本發(fā)明實施例提供的通過real-timePCR測PMMA對caspase-3，9，Bcl-2，Bax和Fas蛋白的表達影響示意圖。圖7是本發(fā)明實施例提供的PMMA改變脊柱轉(zhuǎn)移性細胞的細胞周期相關基因，通過real-timePCR測PMMA對cyclinD1，P21和P2的表達影響示意圖。圖中：A.westernblot測PMMA對caspase-3，9，Bcl-2，Bax和Fas蛋白的表達影響；B.westernblot測PMMA對cyclinD1，P21和P27表達的影響。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。如圖1所示，本發(fā)明實施例的聚甲基丙烯酸甲酯對脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞影響的測試方法包括以下步驟：S101：通過體外PMMA處理原代培養(yǎng)椎體轉(zhuǎn)移瘤細胞，以Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8、Fas等凋亡基因為切入點；S102：采用realtime-PCR、Westernblot及流式細胞儀等檢測腫瘤細胞凋亡率變化及可能的凋亡途徑，闡明其對腫瘤細胞的影響的分子機制；S103：同時對臨床行PVP的患者進行隨訪，記錄患者術后及長期的疼痛緩解與生活質(zhì)量，為PMMA治療脊柱轉(zhuǎn)移瘤的研究找到新的突破口和切入點。下面結(jié)合實驗對本發(fā)明的應用原理作進一步的描述。1材料和方法1.1設計：實驗性研究時間及地點：開展實驗的具體時間(2012年8月/2015年1月)、地點(重慶醫(yī)科大學，骨外科)。1.2材料1.2.1主要試劑及儀器PMMA(天津市合成材料產(chǎn)業(yè)研究所)、1640培養(yǎng)液(Hyclone公司)、胎牛血清(Hyclone公司)AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(杭州碧云天生物技術研究所)、EzgenebiozolRNAKit(大連寶生物工程有限公司)、PCR引物合成TaKaRa(大連寶生物)、CDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)、SYBRGreenReal-timePCR(Biomiga公司)、兔抗人cyclinD1抗體(1:500,Abcam,UK)、兔抗人P21抗體(1:500,Abcam,UK)、兔抗人P27抗體(1:500,Abcam,UK)兔抗人Fas抗體(1:1000,CellSignaling,USA)、兔抗人caspase-3抗體(1:1000,CellSignaling,USA)、兔抗人caspase-9抗體(1:1000,CellSignaling,USA)、兔抗人Bcl-2抗體(1:1000,CellSignaling,USA)、兔抗人Bax抗體(1:1000,CellSignaling,USA)、β-actinantibody(1:8000,Beyotime,China)1.2.2主要儀器旋渦混合器、一次性水銀溫度計、BDFACSvantageSE流式細胞儀、倒置相差顯微、CFX96實時定量PCR儀、電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、電泳儀、低溫離心機機、臺式高速離心機、721分光光度計、恒溫水浴箱、凝膠掃描系統(tǒng)、普通光學顯微鏡、超凈工作臺、超低溫(-80℃)冰箱、電子天平、微量移液器、電泳槽。1.3方法1.3.1腫瘤組織收集腫瘤組織在行椎體成型術時分別從7位患者(3男性和4為女性，平均年齡在55.86±12.83歲收集，其中3為女性為原發(fā)性乳腺癌，1位女性為原發(fā)性腎癌，2位男性為原發(fā)性肺癌和1位男性患者人原發(fā)性膀胱癌。所有組織捐助者均簽署了書面知情同意書并在手術之前得到重慶醫(yī)科大學當?shù)貍惱砦瘑T會的批準。此外，脊椎活檢是在為疑似為腫瘤做確診的過程中活檢取出的，所剩的轉(zhuǎn)移瘤組織也是用于實驗室研究。1.3.2取材及培養(yǎng)：在手術室將臨床手術/活檢所取腫瘤標本(經(jīng)病理學檢查確認為腫瘤組織)置于含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液的已消毒培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿四周事先鋪好冰塊)，帶回實驗室，到實驗室后于無菌操作臺內(nèi)迅速移入含雙抗(內(nèi)含青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml)的PBS液中洗滌2～3次，用組織剪剔除脂肪組織、壞死組織和血塊，用PBS液沖洗2～3次后放入10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液浸泡，使用眼科剪剪碎為近似1mm3大小的塊狀，使用0.125％胰酶((Sigma，USA)消化分解切碎的樣本，通過無菌200目篩網(wǎng)過濾器過濾后將濾網(wǎng)表面的組織收集到一新50ml離心管內(nèi)，用離心機1200rpm×5分鐘分離細胞，清洗三次后1640培養(yǎng)液((Hyclone，美國)重懸而后加入10％的胎牛血清(Gibco，美國)5×105細胞/毫升，最后腫瘤細胞在5％CO237℃的環(huán)境下孵育培養(yǎng)。1.3.3骨水泥的調(diào)和與作用方式PMMA主要特征如下:聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥由聚合粉劑和單體液體兩部分組成。聚合粉劑是無揮發(fā)氣味的白色粉狀物。液體是一種易揮發(fā)的親脂性且具有細胞毒性的甲基丙烯酸甲酯單體。其單體和其他化學成分有細胞毒性，能誘導溶骨性感染、低血壓反應、接觸性發(fā)炎、遲發(fā)性感染等并發(fā)癥。使用盤形骨水泥樣本(直徑5mm，高25mm，約0.5ml)來進行細胞實驗。將骨水泥聚合粉體和液體單體倒入已消毒的不銹鋼碗中，并不斷攪拌使之均勻，攪拌30s～60s逐漸粘稠后吸入骨水泥注射器內(nèi)后轉(zhuǎn)移到模具中，在19℃的室內(nèi)，將拉絲期(～10min)或者完成聚合階段(冷卻期，～30min)的骨水泥從模具中取出，轉(zhuǎn)移到24孔的細胞培養(yǎng)皿內(nèi)。除了MTT測試外，將PMMA骨水泥按上述方式加入脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞后24小時進行下一步檢測。1.3.4細胞分組本發(fā)明分別采用骨水泥浸出液以及拉絲期骨水泥與腫瘤細胞共培養(yǎng)的方式，分別觀察三個不同聚合階段，特別是拉絲期所釋放的熱量對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響。聚合液參照ISO標準制作，分別取1d,2d,3d三個時間點測量細胞增殖；將0.2，0.3,0.4，0.5ml拉絲期骨水泥分別與1X106/孔腫瘤細胞共培養(yǎng)，采用AnnexinV/PI測量細胞凋亡，觀察凋亡率是否與骨水泥量呈劑量相關性。最后一部分中為了探討骨水泥對腫瘤細胞作用的相關機制，分別用拉絲期、冷卻期以及同體積形狀的玻璃柱共培養(yǎng)細胞，檢測了相關細胞凋亡、周期的靶點。1.3.5PMMA聚合反應溫度測定將骨水泥混合后于室溫注入0.5ml于6孔板中后，待骨水泥進入拉絲期后置于37℃溫水水浴箱中，以模擬椎體成型術中PMMA被注入人體后的體溫環(huán)境。而后取工業(yè)水銀溫度計，將水銀頭放入PMMA中測骨水泥內(nèi)部溫度的變化，并以皮溫計測骨水泥表面溫度變化，每0.5min記錄一次，至溫度回落直40℃為止；重復4次。1.3.6利用MTT測定細胞生存能力為了觀察冷卻后骨水泥所釋放出的單體對轉(zhuǎn)移瘤細胞的影響，采取MTT(methylthiazolyltetrazolium)(Beyotime，中國)測定骨水泥樣品浸出液對細胞的細胞增殖作用。浸出液制備參照ISO10993-12:2007，將拉絲期骨水泥這注入模具中，制備成圓盤形的PMMA水泥樣品(10毫米直徑,2毫米高度)，而后同一人使用200～800(#)砂紙打磨拋光，而后用去離子水中超聲清洗5min，吹干后常規(guī)消毒。再將骨水泥樣品完全浸入10％胎牛血清中培養(yǎng)，放置在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中浸泡72小時，后將浸出液取出凍存于-85℃冰箱中備用，樣品表面積與培養(yǎng)液體積比例為1:1.3。腫瘤細胞被一式三份按1×106的密度植入在96孔板里，每孔加入100μl浸出液，取1d，2d，3d三個時間點進行MTT測試，簡述如下：添加50μl的MTT到每個孔，然后培養(yǎng)皿在37℃培養(yǎng)4h。吸取上清液后，加入150μl二甲亞砜并混合，用全自動多功能酶標儀(美國BD)在波長492nm測吸光度。1.3.7AnnexinV/PI染色分析細胞凋亡步驟:取對數(shù)生長期的原代轉(zhuǎn)移瘤細胞以1X106個/孔接種于六孔板中，24H后將處于拉絲期0.2、0.3、0.4、0.5、0.6(ml)骨水泥加入到每孔細胞中，并將適量骨水泥分別以拉絲期和冷卻凝固期按上述方法放置于細胞中，同時設陰性對照組，第48小時，用0.25％胰酶分別消化骨水泥實驗組以及對照組轉(zhuǎn)移瘤細胞，制成單細胞懸液(細胞數(shù)為1～5×106個/m1)，取1ml轉(zhuǎn)移瘤細胞，l000r/min4℃離心5min，吸取并棄上清液，重復2次該步驟，隨后緩緩注入1ml預冷的PBS，輕輕加以震蕩使細胞懸浮，然后l000r/min4℃離心5min，并棄上清液，將經(jīng)上述處理過后細胞重懸于200μl結(jié)合緩沖液，并加入10μlAnnexinV—FITC和5μlPI，輕輕將以上物質(zhì)混勻，避光條件下室溫反應15min，加入300μl結(jié)合緩沖液，即刻使用流式細胞儀進行檢測。光源488nm氬離子激光器，當FITC受激發(fā)后會發(fā)出綠色的熒光，PI會發(fā)出紅色的熒光。實驗結(jié)果經(jīng)電腦分析處理后繪制為四方格圖，其右上、下方格各分部代表晚期及早期凋亡細胞百分率。1.3.8通過流式細胞術觀察細胞周期實驗將培養(yǎng)的對數(shù)生長期轉(zhuǎn)移瘤細胞消化接種到六孔板內(nèi)，24h后按上述方法將PMMA作用于轉(zhuǎn)移瘤細胞，同時設立陰性對照組，48小時后將漂浮以及貼壁轉(zhuǎn)移瘤細胞一同用0.25％胰酶消化收集，用PBS輕緩的洗滌細胞2次(離心：800rpm5min)，收集細胞并使用PBS調(diào)整細胞濃度至1×106/ml，加入70％乙醇至細胞中制備成單細胞懸液，4℃固定過夜；加入染色緩沖液(PBS包含1mg/mLPI和10mg/mLRNaseA)37℃水浴30min；再加入PI染色混勻，4℃避光30min；用流式細胞儀檢測(BD,USA)，記錄激發(fā)波長488nm處紅色熒光，重復4次。1.3.9RNA提取以及real-time定量PCR實驗(1)引物合成：PCR引物序列是以NCBI所提供的每種基因的NM編號，通過生物軟件設計，再請Takara公司利用DNA生物合成儀制成。見表1表1目標基因和相應的序列(2)提取總RNA步驟：將對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)移瘤細胞消化并接種到六孔板，次日，按上述方式將骨水泥以不同時期形式加入轉(zhuǎn)移瘤細胞中作用，并同時設陰性對照組；24h后，從處理后的腫瘤細胞中按RNAislPLUSKIT(Takara，日本)提取說明書提取總RNA：事先備好氯仿和異丙醇，向細胞中注入1ml的BiozolReagent裂解樣品：因為脊柱腫瘤細胞是貼壁細胞，所以盡可能吸干凈培養(yǎng)基，隨后往培養(yǎng)瓶內(nèi)注入BiozolReagent，槍頭反復吸取混勻細胞，隨后移入1.5ml離心管中；裂解液置于室溫下2～3min，加入0.5ml氯仿，蓋好蓋后劇烈振動15s；在4℃下12000g高速離心3min，溶液分層為酚氯仿，中間相和水相，RNA位于水相轉(zhuǎn)移不超過80％上清液于新的離心管中，加入0.5倍的異丙醇，在室溫下以最大速度渦旋15s；將小于700μl的混合液轉(zhuǎn)移至ezBindRNA柱中，在第五步將會形成沉淀，將沉淀一起轉(zhuǎn)移到RNA柱內(nèi)，室溫下10000g離心30～60s，舍棄廢液后重新用收集管重復上一步驟將剩余樣品過柱，離心，棄廢液最后丟棄收集管；將RNA柱放入一新的2ml收集管內(nèi)，加入300μlBufferRB，按上述條件離心棄廢液；將柱子放在收集管中，加入400μlBufferRB，按上述方法離心棄廢液；將柱子放在收集管中，加入600μlRNAwashbuffer，按上述方法離心棄廢液；再次重復上述步驟一次；隨后13000g高速空離心2分鐘；最后洗脫RNA，即將柱子轉(zhuǎn)移到新的1.5ml收集管內(nèi)，加入30～50μlDEPC-TRENTEDddH2O，放置2分鐘，10000g高速離心1min。(3)紫外分光光度計測提取RNA的純度和濃度：1)開機預熱10分鐘；2)基線校正：用重蒸水加入比色杯中洗滌，用吸水紙吸干水分，加入TE緩沖液后放入儀器后進行基線校正；3)取2μl提取出的RNA，加入68μlDEPC水稀釋，共70μl進行測量。(4)采用合格的RNA標本，按TAKARA說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：1)去除基因組中DNA：為了準確地量分析基因，首先應去除基因組DNA。按說明書中反應液的配制：反應條件：42℃×2分鐘2)反轉(zhuǎn)錄反應：需在冰上配制反應液：按說明書中配制反應體系20μl反應條件：37℃15分鐘，再85℃5秒，如果需長時間保存，則于—20℃保存。所有cDNA工作液按如下realtime-PCR(ABIPrism7500)反應體系分別配制：cyclinD1，P21，P27，F(xiàn)as，caspase-3，caspase-9，Bcl-2，BaxandGAPDH由Takara合成，72℃45s，進行40個循環(huán)。電腦系統(tǒng)會在反應結(jié)束時自動繪制標準曲線，由軟件按△△C(T)法自動計算待測樣品中目的基因的準確含量。1.3.10細胞溶解產(chǎn)物和免疫印跡(Westernblotting)實驗原理：蛋白質(zhì)等生物大分子具有不同的電荷和分子量。用陰離子去污劑SDS作用于蛋白質(zhì)中和它們分子上的電荷，然后不同的蛋白質(zhì)在聚丙烯酞胺電泳時將會按其分子量大小來分布，所以電泳遷移率僅僅依賴于蛋白質(zhì)不同的分子量。westemBlot的實驗方法是使用獲得的蛋白質(zhì)樣品，通過SDS一PAGE(聚丙烯酞胺凝膠)電泳，以此分離不同分子量的蛋白質(zhì)。然后利用轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上分離到的Pro轉(zhuǎn)印至固相支持物上，用一抗與轉(zhuǎn)印后膜((PVDF膜))上的靶蛋白特異性結(jié)合，再結(jié)合經(jīng)酶/同位素標耦聯(lián)的二抗，最后讓底物顯色/放射自顯影來檢測經(jīng)電泳分離出的特異性目的基因所表達出的蛋白成分。(1)于冰上提取細胞總蛋白棄轉(zhuǎn)移瘤細胞培養(yǎng)基，PBS洗2次，吸干PBS后再加入2mlPBS，使用細胞刮輕緩刮取細胞，重復一次將刮取下的細胞轉(zhuǎn)移至10ml玻璃離心管內(nèi)，離心1000rpm5分鐘棄上清后加1mlPBS，吹勻后轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管內(nèi)，4000rpm2分鐘再棄上清，加入含PMSF(蛋白酶抑制劑)、RIPA(磷酸酶抑制劑)的細胞裂解液120μl，冰上反復吹打2分鐘冰上靜置30分鐘，振蕩一次/5min，12000rpm，4℃低溫離心15分鐘，吸取上清置入另一1.5mlEP管，并放冰上，取部分做pro濃度測定、煮沸變性：上樣緩沖液為4：1，-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?2)蛋白濃度測定：應用BCA蛋白濃度測定試劑盒，并按照濃度測定試劑說明書中所注明步驟操作：按A:B＝50:1配制BCA工作液配制25mg/ml的蛋白標準溶液，取適量25mg/ml的蛋白標準溶液，稀釋至終濃度為0.5mg/ml稀釋標準品，每一種蛋白梯度和樣品做2個復孔。將標準品按0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，12μl，16μl，20μl加到96孔板視為標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20μl，加適當體積樣品到96孔板的視為樣品孔中，加標準品稀釋液到20μl，各孔加入200μlBCA工作液，37℃孵箱內(nèi)放置30分鐘。取出于室溫中冷卻到室溫，使用之前預熱好的酶標儀測定57Onm時的吸光度(OD值)。計算機軟件將會自動生成pro濃度標準曲線和待測蛋白樣品的濃度。(3)免疫印跡反應1)首先安裝好電泳儀的玻璃板。根據(jù)不同目的蛋白分子量大小來配制8％～12％不同濃度的SDS-PAGE分離膠。灌注并加水液封。為了保證分離膠可以完全聚合，需將其放置在室溫中30min-60min以上。2)濃縮膠灌制：等待分離膠凝固后，倒去膠面上層水，用濾紙吸干分離膠表面的水份。沿膠槽邊緣迅速注入濃縮膠。然后沿水平方向輕輕插入梳子后放15分鐘，以預防氣泡進入膠層影響后續(xù)進程。3)當濃縮膠完全聚合后就可以將梳子取出，再用蒸餾水對準樣品孔進行沖洗，再把玻璃板固定在電泳儀的電泳槽中，注入電泳緩沖液。4)將事先以BCA法制備的變性的蛋白樣品取出，按預定順序加樣，從兩邊分別向加樣孔注入30μl緩沖液，防止邊緣效應。5)電泳：以恒壓模式電泳，首先以80V的電壓預電泳30分鐘，當上樣緩沖液至兩種膠的交界線處時，將電壓調(diào)到100V繼續(xù)電泳；電泳直至膠條中蛋白Marker的各條帶都被徹底的分離時即終止電泳，約120分鐘。6)切膠。7)轉(zhuǎn)膜：在電泳結(jié)束前將轉(zhuǎn)膜緩沖液準備好，標記PVDF膜(按凝膠大小準備硝酸纖維素濾膜)后將纖維墊片、濾紙、硝酸纖維素濾膜等一起浸入電轉(zhuǎn)緩沖液中做平衡準備。待電泳結(jié)束取出凝膠，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10分鐘。8)按照順序安裝轉(zhuǎn)移裝置：底上墊一張海綿墊-三層濾紙-凝膠條-PVDF膜-三層濾紙-海綿墊片，將各層不留氣泡的完全對齊，由下而上順序固定在夾層盒。再將夾子放進電轉(zhuǎn)槽中，并將夾的黑面與槽子黑面相對，白面與槽紅面相對。槽放入加入冰塊的盒中，根據(jù)目標蛋白分子量定轉(zhuǎn)膜時間。轉(zhuǎn)膜完畢后膠條用考馬斯亮藍染色，用于判斷目標蛋白的轉(zhuǎn)膜效率。9)TBST配制及封閉：250μlTween20加入→500mlPBS。將膜用5％的脫脂奶粉在搖床上封閉1h，再用TBST漂洗1次。10)一抗孵育：加入適當稀釋的一抗(cyclinD1，P21andP27(1:500，Abcam，UK)，F(xiàn)as，caspase-3andcaspase-9，Bcl-2andBax(1:1000，CellSignaling，USA)，andβ-actinantibody(1:8000，Beyotime，China))，室溫下振蕩lh，4℃冰箱過夜孵育。TBST洗2次以上，每次10min。加入以5％脫脂奶粉的TBST溶液按1:1000稀釋HRP標記的羊抗兔二抗，室溫條件下?lián)u床振蕩孵育2h。取出二抗，37℃孵化1小時。再在脫色搖床上搖動，用TBST漂洗3次以上，每次5min。11)化學發(fā)光、圖像采集：配制ECLPlus試劑(Beyotime，中國)發(fā)光反應液，振蕩使之混合均勻。將膜緩沖液中取出，貼角用濾紙貼角吸干殘余緩沖液，固定在片盒中，滴加發(fā)光反應液，chemiDocXRS+成像系統(tǒng)(美國，BD)進行圖像采集。1.4統(tǒng)計學分析所有測量均重復進行了三次。結(jié)果表示為平均值±標準偏差(SD)。組間差異分析了單向方差分析(方差分析)與不同組Tukey’s的效果測試。P<0.05被認為是統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計學處理均由第一作者完成，采用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗，樣本間率比較采用x2檢驗，結(jié)果中定量數(shù)據(jù)用x±s表示，P＜0.05為有顯著性差異。2結(jié)果2.1PMMA骨水泥內(nèi)部及表面溫度變化趨勢骨水泥聚合后溫度約在15～17min達峰值，PMMA內(nèi)部溫度最高在92.3±1.5℃；表面最高溫度可達63.2±1.1℃。內(nèi)部溫度在50℃以上有540.2±59.1s，外部溫度在50℃以上210.2±30.9s。2.2PMMA骨水泥對細胞細胞增殖能力的影響為了研究不同劑量PMMA骨水泥對1.5×106腫瘤細胞的關系，按上述方法將0.2～0.6ml骨水泥處理腫瘤細胞24小時后，分別置于倒置顯微鏡下觀察腫瘤細胞生長狀態(tài)正常存活的轉(zhuǎn)移瘤細胞生長增殖旺盛分布密集，平行極性排列連接成片，細胞清晰，細胞呈多邊形，胞體飽滿，貼壁生長。隨著注入PMMA劑量增大，活細胞數(shù)量逐漸減少，細胞間隔增寬，細胞變圓，胞體縮小，漂浮于培養(yǎng)液中。利用MTT測定PMMA對原代培養(yǎng)轉(zhuǎn)移瘤的細胞生長的影響。結(jié)果表明，3天內(nèi)伴隨時間的延長，同一劑量的PMMA刺激濃度情況下抑制率明顯增高，并且細胞生長明顯比對照組緩慢(P<0.05)。圖2。通過形態(tài)觀察以及MTT測試，由此可見骨水泥浸出液對腫瘤細胞具有明顯抑制增殖的作用。2.3PMMA對原代培養(yǎng)椎體轉(zhuǎn)移瘤細胞凋亡的影響并采用AnnexinV-FITC/PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡率。注入拉絲期PMMA0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，其凋亡率分析的結(jié)果分別為拉絲期(5.12±1.01)％、(9.84±2.13)％、(23.04±4.72)％、(41.87±7.35)％、(94.18±11.27)％，各組間差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結(jié)果表明腫瘤細胞的凋亡與骨水泥的注射量呈劑量依賴關系，可能的機理是隨著劑量的增加，骨水泥聚合產(chǎn)生的熱量時間更長，釋放的單體量增高，誘導更多細胞凋亡，詳見圖3。為了研究PMMA骨水泥對椎體轉(zhuǎn)移瘤細胞的凋亡作用，按上述方法將不同時期的PMMA骨水泥分別處理細胞24小時。采用AnnexinV-FITC/PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡率，其冷卻后PMMA組、拉絲期PMMA組、對照組的凋亡率分析的結(jié)果分別為(28.57±8.31)％、(41.87±7.35)％、(4.08±1.09)％，經(jīng)PMMA處理的兩組椎體轉(zhuǎn)移瘤細胞的凋亡率比對照組均有顯著增強(P＜0.05)，拉絲期PMMA組的凋亡率比冷卻期PMMA組亦有明顯升高(P＜0.05)。此兩組骨水泥的雖都呈現(xiàn)凋亡率升高的表現(xiàn)，但凋亡類型卻有所不同；拉絲期PMMA組更多的呈現(xiàn)為一種早期凋亡的形式(P<0.05)，而用冷卻后PMMA刺激細胞后，細胞在24h后呈現(xiàn)的是晚期凋亡，(P<0.05)，見表2和圖4。同時，冷卻后PMMA組、拉絲期PMMA組、對照組的死亡率分別為(10.96±1.29)％、(12.53±1.98)％、(1.48±0.31)％，無論是在拉絲期的PMMA還是冷卻后的PMMA均可使細胞的死亡率較對照組升高，(P<0.01)，而兩組骨水泥之間并無明顯差異(P>0.05)。表2.3各組細胞凋亡率的變化(％，x±s)與對照組比較，*：P<0.001；與對照組比較，#：P<0.01；與拉絲期比較，△：P>0.052.4PMMA應用對轉(zhuǎn)移瘤細胞的細胞周期影響為了研究PMMA骨水泥對椎體轉(zhuǎn)移瘤細胞的細胞周期作用，按上述方式將混合后不同時期的PMMA骨水泥作用于腫瘤細胞24h。通過流式細胞術發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞經(jīng)PMMA的作用培養(yǎng)24小時后被阻滯在G0/G1細胞周期，G0/G1細胞百分比從未經(jīng)處理的對照組(39.11±10.27)％上升到拉絲期骨水泥組的(78.15±9.72)％以及冷卻期骨水泥組的(51.07±7.34)％，每組之間兩兩相比均有顯著差異(P<0.05)，見圖4。2.5總RNA提取的結(jié)果提取經(jīng)PMMA處理后椎體轉(zhuǎn)移瘤細胞總RNA，當吸光度A260/A280在1.8～2.0之間時說明總RNA純度較高，基本已經(jīng)去除了蛋白質(zhì)和糖類等其他物質(zhì)的污染。再經(jīng)1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳測試，28S與18S的吸光度的比值≈2，說明總RNA基本無降解，其完整性較好。2.6PMMA處理后脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞的細胞凋亡相關mRNA表達因為caspase被稱為細胞凋亡的關鍵執(zhí)行者，通過real-timePCR檢測了各組的caspase-3和caspase-9的表達。結(jié)果顯示，在經(jīng)過PMMA骨水泥處理后的脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞中的caspase-3和caspase-9的mRNA表達都有所增加。而且caspase-3和caspase-9在拉絲期骨水泥組中都比冷卻期骨水泥組的表達量更高(P<0.05)，見表3，圖6。Bcl-2/bax聚合體是線粒體的功能的關鍵調(diào)節(jié)者，如果它們的比例不均衡則會通過依賴線粒體通路導致細胞凋亡的結(jié)果。在本研究中，通過PMMA骨水泥的刺激后，轉(zhuǎn)移瘤細胞的Bcl-2/bax表達失衡。與對照組相比，Bcl-2表達量顯著降低而Bax表達量明顯增高(P<0.05)，見表4，圖5。然而在拉絲期骨水泥組和冷卻期骨水泥組之前卻并無顯著差異。此外，細胞凋亡的另一個關鍵調(diào)節(jié)者是Fas死亡受體系統(tǒng)，結(jié)果顯示經(jīng)過PMMA骨水泥刺激后的Fas的mRNA的表達量都顯著升高(P<0.05)，并且Fas在拉絲期骨水泥組中的表達量與冷卻骨水泥組相比增加更多。表3Real-timePCR檢測脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞中Caspase-3、Caspase-9和FasmRNA的表達量的變化GROUPCaspase-3Caspase-9Fas對照組1.00001.00001.0000拉絲期PMMA4.2790±0.0046*5.3739±0.0176*3.8968±0.2342冷卻后PMMA2.1331±0.0336#:2.3695±0.1833#2.5976±0.1084與對照組比較，*:P<0.05；與對照組比較，#:P>0.05與拉絲期比較，△：P>0.05表4Real-timePCR檢測脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞中BAX和BCL-2mRNA的表達量的變化GROUPnBaxBcl-2對照組51.00001.0000拉絲期PMMA53.1939±0.0123*0.1156±0.1485*冷卻后PMMA52.2587±0.0899#:0.4141±0.2564#:2.7PMMA處理后脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞的細胞周期相關mRNA表達細胞周期進程是由周期素依賴性蛋白激酶(CDKs)所調(diào)控的，其可以被細胞周期素激活并被細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKIs)。在本研究中，評估了在不同階段骨水泥處理后的脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞的細胞周期蛋白的表達的cyclinD1，P21andP27。real-timePCR的結(jié)果顯示經(jīng)過PMMA刺激后阻滯了cyclinD1的表達并增加P21的表達，但是對P27的表達沒有明顯的改變。此外拉絲期骨水泥組與冷卻骨水泥組相比，cyclinD1的表達降的更低而P21的表達增加的更高，見表5，圖6。表5Real-timePCR檢測脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞中cyclinD1，P21和P27mRNA的表達量的變化GROUPcyclinD1P21P27對照組1.00001.00001.0000拉絲期PMMA0.3856±0.0850*2.1064±0.1773#0.9768±0.0664#冷卻后PMMA0.7273±0.0358#:1.5926±0.0978#1.1131±0.0439#2.8PMMA處理后脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞后凋亡與周期相關蛋白表達用westernblot方法進一步測PMMA處理腫瘤細胞后在蛋白水平上細胞周期相關基因cyclinD1，P21andP27；以及凋亡基因caspase-3、caspase-9和Fas表達情況。免疫印跡結(jié)果顯示蛋白表達水平與mRNA表達水平一致，在經(jīng)過PMMA骨水泥處理后的脊柱轉(zhuǎn)移瘤細胞中的caspase-3、caspase-9和Fas的蛋白水平都有所增加。而且caspase-3、caspase-9和Fas在拉絲期骨水泥組中都比冷卻期骨水泥組的表達量更高(P<0.05)；通過PMMA骨水泥的刺激后，轉(zhuǎn)移瘤細胞的Bcl-2/bax表達失衡。與對照組相比，Bcl-2表達量顯著降低而Bax表達量明顯增高，圖7A。經(jīng)過PMMA刺激后，cyclinD1的蛋白水平降低而P21的蛋白水平增高，但是對P27的表達沒有明顯的改變，圖7B。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3