本發(fā)明屬于微生物應用領域。具體而言，本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌及其用途。

背景技術：

藍莓、桑椹等特色小漿果，含有特殊的營養(yǎng)成分，富含維生素、礦物質、抗氧化物質和花青素，具有較高的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健作用，備受關注，身價倍增。吃保健果品提高健康水平，是國民的強烈愿望。市場需求激發(fā)了種植積極性，特色漿果已成為新興的經(jīng)濟林產(chǎn)業(yè)。但由于氣候的變化和栽培方式的改變、栽培面積的迅速擴大，藍莓、桑椹等小漿果病蟲害(炭疽病、菌核病)已呈現(xiàn)多發(fā)、頻發(fā)、重發(fā)的態(tài)勢，嚴重危害產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。目前，防治措施以依賴化學農(nóng)藥為主，易造成病蟲抗藥性增強、防治效果下降，出現(xiàn)農(nóng)藥越打越多、病蟲越防越難，農(nóng)藥殘留超標等問題，嚴重影響果品質量安全和生態(tài)環(huán)境安全。因此對藍莓炭疽病、桑椹菌核病進行生物防治是必然趨勢。

利用拮抗微生物防治藍莓炭疽病、桑椹菌核病等病害有望成為代替化學藥劑的一種安全、無毒及有效的新方法。拮抗微生物不僅可以防病，而且還能促進植物生長，對改善林地生態(tài)系統(tǒng)，保持林間生物多樣性，以及維護林田生態(tài)平衡實現(xiàn)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展將起到重要作用。農(nóng)業(yè)部2015年專門制定了《到2020年農(nóng)藥使用量零增長行動方案》，其目標就是單位防治面積農(nóng)藥使用量控制在近三年平均水平以下，力爭實現(xiàn)農(nóng)藥使用總量零增長。主要農(nóng)作物病蟲害綠色防治覆蓋率達到30％以上，而且在減少農(nóng)藥使用量的同時，病蟲害防治效果不降低。為保證行動方案順利完成，大力推廣利用生物藥劑是主要途徑。與其他生物農(nóng)藥相比，微生物源生物農(nóng)藥生防因子繁殖速度快、防治效果持久、開發(fā)利用途徑多、不易產(chǎn)生抗性、發(fā)酵工藝簡單及生產(chǎn)成本低，成為生物農(nóng)藥領域的研究熱點，依然是未來較長一段時間生物農(nóng)藥登記的主要選擇。尤其是利用枯草芽孢桿菌防治桑椹菌核病、藍莓炭疽病還未見報道。

采用枯草芽孢桿菌作為生物農(nóng)藥防治植物病害的報道較多。如ZL201310145531.5公開了一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)RC-1CGMCC No.7501，該菌株的殺菌譜廣，可以防治辣椒炭疽病、黃瓜炭疽病、核桃炭疽病、蘋果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬棗黑斑病、板栗枝枯病、石榴干腐病等多種植物病害，防治辣椒炭疽病效果顯著。但是室內對峙試驗表明：它對藍莓炭疽病和桑椹菌核病的抑菌率分別為61.35％和49.12％，防治效果較差。因此尋找一種高效防治藍莓炭疽病和桑椹菌核病的拮抗微生物是當前需要解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株能高效防治藍莓炭疽病、桑椹菌核病的枯草芽孢桿菌菌株JQ-5，該菌株具有生長速度快、產(chǎn)孢量大，在藍莓、桑椹根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應用前景。

本發(fā)明所提供的菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株JQ-5，是從山東省濰坊市濰北地區(qū)近海潮間帶海泥中，采用稀釋分離法分離獲得的，已于2013年9月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No.8129。其具有以下微生物學特性：JQ-5菌株桿狀、具周生鞭毛，長為6-10μm，寬0.9-1.5μm，革蘭氏染色陽性。菌株在NA和NB培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48h后，菌落圓形，平展，呈乳白色偏黃色，表面不規(guī)則，中間有圓環(huán)形突起，邊緣不整齊，不產(chǎn)色素。液體培養(yǎng)形成菌膜，液體顏色棕黃色，渾濁，有沉淀。菌株表現(xiàn)菌株好氧生長。芽孢呈橢圓形或柱狀。

枯草芽孢桿菌菌株JQ-5的培養(yǎng)方法或繁殖方法：普通培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基保存。實驗室液體培養(yǎng)采用略加修改的NB液體培養(yǎng)基。NB配方：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化鈉5g，水1000mL，pH 7.3。大量發(fā)酵培養(yǎng)配方(重量百分含量)：黃豆粉3.5％，玉米粉2.5％，輕質碳酸鈣0.25％，氯化鈉0.05％，其余為水，pH 7.5。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度28℃，初始pH7.5，裝液量70％，接菌量3.0％，培養(yǎng)時間30h，通風1：0.8。采用此培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，菌數(shù)≥85億/g。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有該菌株的微生物菌劑，其制備方法包括以下步驟：

(1)將保存的枯草芽孢桿菌JQ-5轉移至NA試管斜面中，置于培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)36-48h；

(2)在無菌條件下，將培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌JQ-5用無菌水按體積比1：10稀釋，吸取1mL，置于裝有NB液體培養(yǎng)基的搖瓶中，28℃搖床振蕩培養(yǎng)12h得到種子液；

(3)按體積比3.0％將種子液接種到大量發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間30h，通風1：0.8。發(fā)酵完成后，菌數(shù)≥85億/g。

上述微生物菌劑優(yōu)選為水分散粒劑，所述水分散粒劑通過包括以下步驟的方法制得：

(4)將枯草芽孢桿菌JQ-5發(fā)酵液加入基質進行混勻，然后進行干燥，得到原粉；所述基質選自草炭、微粉碳酸鈣和膨潤土中的一種或多種；所述基質與發(fā)酵液的質量比為0.5～1.5：1，優(yōu)選1：1；

(5)按重量份，干燥好的枯草芽孢桿菌JQ-5原粉1-30、輕質碳酸鈣1-60、葡萄糖0.5-60、羧甲基纖維素0.02-10、濕潤劑1004 0.5-30、動物蛋白0.2-30，將上述原料混合均勻，使混合料的枯草芽孢桿菌JQ-5含量為0.1-100億活菌/g；

(6)控制加工溫度0-50℃，在氣流粉碎機或其它高目粉碎機中粉碎到150篩目以上，然后進行沸騰造粒或擠壓造粒，水分控制在6-8％，pH控制在7-7.5。

該微生物菌劑可以用作生物農(nóng)藥，用于防治藍莓炭疽病、桑椹菌核病。因此，又一方面，本發(fā)明提供枯草芽孢桿菌菌株JQ-5或者本發(fā)明的微生物菌劑用于防治藍莓炭疽病、桑椹菌核病中的用途以及提高藍莓、桑葚的鮮果重方面的用途。

本發(fā)明還提供一種用于防治藍莓炭疽病、桑椹菌核病的方法，所述方法包括向具有炭疽病的藍莓、具有菌核病的桑椹施用枯草芽孢桿菌菌株JQ-5或者上述的微生物菌劑。

實驗表明，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌菌株JQ-5具有菌株新穎、高效、生長速度快、產(chǎn)孢量大，在藍莓、桑椹根際能夠快速大量定殖等特點，其15億/g水分散粒劑400倍防治藍莓炭疽病、桑椹菌核病效果顯著，防治效果達到78.63％、76.98％，且藍莓、桑椹生長健壯，無藥害產(chǎn)生，且藍莓、桑葚的鮮果增重20％以上。同時具有安全高效，無藥殘，無毒副作用，能減少化學農(nóng)藥的使用，因而在生物防治藍莓炭疽病、桑椹菌核病中具有重要應用前景。

附圖說明

圖1為以16SrDNA序列為基礎的JQ-5菌系統(tǒng)發(fā)育樹。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是示例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。

實施例1枯草芽孢桿菌菌株JQ-5的分離與鑒定

1.分離：

本發(fā)明的枯草芽孢桿菌是從山東省濰坊市濰北地區(qū)近海潮間帶海泥中采用土壤稀釋分離法分離獲得的，分離方法為：

(1)土樣采集：從土壤表層到15cm處取樣200g，一個地點采幾個樣本，實驗室陰干，混合過粗篩，取25g作分離用；

(2)培養(yǎng)基平板制備：將NA培養(yǎng)基(營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)和PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)培養(yǎng)基融化，分別倒入滅菌培養(yǎng)皿，冷卻，制成NA和PDA平板；

(3)稱取1g土樣于滅菌試管中，加100mL無菌水，振蕩，制成10^-2土壤懸浮液，靜置5min，按10倍梯度稀釋到10^-7；

(4)取上述土壤懸浮液0.5mL，加到培養(yǎng)基平板上，用彎玻棒涂勻。置于培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)5-7d；

(5)將單個菌落在NA培養(yǎng)基上劃線，得到單菌落，轉移至NA試管斜面培養(yǎng)基中，至28℃恒溫培養(yǎng)；

(6)以藍莓炭疽病菌為靶標菌，采用對峙培養(yǎng)法，篩選到一株對藍莓炭疽病菌具有較強抑制活性的菌株，編號JQ-5。

所述NA培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g、牛肉膏3g、瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.3；所述PDA培養(yǎng)基配方為馬鈴薯(去皮切塊)200g，葡萄糖20g，瓊脂14g，蒸餾水1000mL。

2.菌株鑒定

(1)微生物學特性：JQ-5菌株桿狀、具周生鞭毛，長為6-10μm，寬0.9-1.5μm，革蘭氏染色陽性。菌株在NA和NB培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48h后，菌落圓形，平展，呈乳白色偏黃色，表面不規(guī)則，中間有圓環(huán)形突起，邊緣不整齊，不產(chǎn)色素。液體培養(yǎng)形成菌膜，液體顏色棕黃色，渾濁，有沉淀。菌株表現(xiàn)菌株好氧生長。芽孢呈橢圓形或柱狀。其它特性見下表1：

表1JQ-5菌株的生理生化特性

注：“+”表示生長或反應陽性；“-”表示不生長或反應陰性。

(2)分子生物學特性：

16S rRNA基因序列測定結果如下(SEQ-1)：

TAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTGTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGGGGACCG

將JQ-5菌株的16S rRNA擴增序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，與B.subtilis HAZ2(AY162127)同源性為99.79％，結合JQ-5菌株的形態(tài)特征、生理生化特性，確定JQ-5屬于枯草芽孢桿菌B.subtilis。

此菌株已于2013年9月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No.8129。

實施例2枯草芽孢桿菌菌株JQ-5對藍莓炭疽病、桑椹菌核病室內效果驗證

1.實驗方法

采用平板對峙培養(yǎng)法，將供試的藍莓炭疽病、桑椹菌核病菌菌餅(9mm)移至平板中央，四周2cm處接種JQ-5菌株，置27℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每個處理重復3次。待對照菌絲長滿平板時，采用十字交叉法測量菌落直徑、抑菌帶直徑，計算平均值和相對抑制率。

2.結果

由表2可以看出，JQ-5對藍莓炭疽病菌、桑椹菌核病菌菌絲生長均具有較強的抑制作用，抑菌帶直徑分別為11.16mm、9.23mm，菌絲生長抑制率分別為85.26％、83.44％。

表2.JQ-5對藍莓炭疽病、桑椹菌核病菌室內抑菌活性測定

實施例3枯草芽孢桿菌菌株JQ-5水分散粒劑的制備

NB液體培養(yǎng)基配方：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化鈉5g，水1000mL，pH 7.3。

大量發(fā)酵培養(yǎng)配方(重量百分含量)：黃豆粉3.5％，玉米粉2.5％，輕質碳酸鈣0.25％，氯化鈉0.05％，其余為水，pH 7.5。

(1)將保存的枯草芽孢桿菌JQ-5轉移至NA試管斜面中，置于培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)36h；

(2)在無菌條件下，將培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌JQ-5用無菌水按體積比1：10稀釋，吸取1mL，置于裝有NB液體培養(yǎng)基(100mL)的250mL搖瓶中，28℃搖床振蕩培養(yǎng)12h得到種子液；

(3)按體積比3.0％將種子液接種到大量發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間30h，通風1：0.8。發(fā)酵完成后，菌數(shù)≥85億/g；

(4)將枯草芽孢桿菌JQ-5發(fā)酵液加入等質量的膨潤土進行混勻，然后進行干燥，得到原粉；

(5)按重量份，干燥好的枯草芽孢桿菌JQ-5原粉30、輕質碳酸鈣8、葡萄糖45、羧甲基纖維素1、濕潤劑1004 6、動物蛋白10，將上述原料混合均勻，使混合料的枯草芽孢桿菌JQ-5含量為15億活菌/g；

(6)控制加工溫度20-30℃，在氣流粉碎機中粉碎到200目，然后進行沸騰造粒，水分控制在6-8％，pH控制在7-7.5。

實施例4枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑的作用驗證

本實施例提供了枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑針對藍莓炭疽病、桑椹菌核病的相關實驗。

1.1供試藥劑

本發(fā)明實施例3制備的枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑；75％代森錳鋅水分散粒劑(市售)。

1.2供試作物與防治對象：

供試作物為藍莓，品種為伯克利；防治對象：炭疽?。?/p>

供試作物為桑椹，品種為白椹；防治對象：菌核病。

1.3試驗地情況

于2013年分別在山東省青島市膠南藍莓種植園、夏津桑椹種植園中，進行林間防治藍莓炭疽病、桑椹菌核病試驗。樹勢中等偏弱，病害發(fā)生嚴重。所有試驗小區(qū)栽培條件及管理措施一致，開花后3周用藥1次，6月15日起，每隔15d施藥1次，連用3次，共計4次。

1.4試驗設計及安排

本試驗設計了15億/g枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑400倍、600倍、800倍，75％代森錳鋅水分散粒劑400倍液及不施藥清水作對照共5個處理，重復4次，共20個小區(qū)，各小區(qū)隨機排列，每個小區(qū)10棵藍莓樹、果桑樹。

1.5試驗調查及計算方法

1.5.1藥效調查、調查時間和次數(shù)

采收前10d調查，每個處理隨機調查300個果實，計算病果率、防治效果，整個試驗調查1次。

1.5.4藥效計算方法

藥效按式(1)、(2)計算：

1.6對作物的直接影響

觀察藥劑對作物有無藥害，記錄藥害的類型和程度。此外，也要記錄對作物的其他有益影響(例如促進成熟、刺激生長等)。

用下列方式記錄藥害：

(a)如果藥害能被測量或計算，要用絕對值表示，例如株高、結實率。

(b)在其他情況下，可以按下列兩種方法估計藥害程度和頻率：

(1)按照藥害分級方法記錄每小區(qū)的藥害程度，以—、+、++、+++、++++表示。

藥害分級方法：

—：無藥害；

+：輕度藥害，不影響作物生長；

++：中度藥害，可復原，不會造成作物減產(chǎn)；

+++：中度藥害，影響作物正常生長，對作產(chǎn)量和質量造成一定程度的損失；

++++：嚴重藥害，作物生長受阻，產(chǎn)量和質量損失嚴重。

(2)將藥劑處理區(qū)與空白對照區(qū)比較，評價其藥害百分率。

同時，要準確描述作物的藥害癥狀(矮化、褪綠、畸形等)。

2.結果

2.1供試藥劑對藍莓炭疽病、桑椹菌核病的防治效果

表3結果顯示，15億/g枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑對藍莓炭疽病具有較好的防治效果，其中15億/g枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑400倍、600倍防治效果最好，防治效果分別達78.63％、77.10％，在P<0.05水平上無顯著性差異，明顯高于800倍和75％代森錳鋅的防治效果。

表3枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑防治藍莓炭疽病田間藥效試驗

注：表中數(shù)據(jù)后不同的小寫字母表示經(jīng)Duncan多重比較后差異顯著(P<0.05)。

表4枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑防治桑椹菌核病田間藥效試驗

注：表中數(shù)據(jù)后不同的小寫字母表示經(jīng)Duncan多重比較后差異顯著(P<0.05)。

表4結果顯示，15億/g枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑對桑椹菌核病具有較好的防治效果，其中15億/g枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑400倍、600倍處理后，防治效果最好，病果率為10.67％和12.00％，防治效果分別達76.98％、74.10％，在P<0.05水平上無顯著性差異，明顯高于800倍和75％代森錳鋅的防治效果。

2.2安全性調查：經(jīng)施藥7d和14d觀察，各藥劑處理區(qū)與對照區(qū)相比，藍莓、果桑生長正常，無藥害產(chǎn)生，說明15億/g枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑在供試濃度對藍莓、果桑安全。

2.3枯草芽孢桿菌JQ-05水分散粒劑對藍莓、桑椹增產(chǎn)效果

表5枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑對藍莓鮮果重試驗結果

表5結果顯示，15億/g枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑不同濃度處理后，藍莓鮮果增產(chǎn)率分別為25.96％、22.09％、16.57％，其中400倍處理后，增產(chǎn)率最高。15億/g枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑400倍-800倍，均具有較好的增產(chǎn)效果，800倍處理后，增產(chǎn)率仍在15％以上。

表6枯草芽孢桿菌菌株JQ-5水分散粒劑對桑椹鮮果重試驗結果

表6結果顯示，15億/g枯草芽孢桿菌JQ-5水分散粒劑不同濃度處理后，與清水對照相比，桑椹鮮果重分別為2.56g、2.39g、2.26g，清水對照鮮果重為2.09g，不同處理均有增產(chǎn)效果，其中300倍處理后，增產(chǎn)率達22.48％，效果明顯。隨著稀釋濃度的增大，增產(chǎn)效果減弱。

3.小結

從藍莓病果率和防治效果來看，15億/g枯草芽孢桿菌JQ-5對藍莓炭疽病、桑椹菌核病具有較好的防治效果，稀釋400倍后防治效果可達78.63％、76.98％，明顯好于對照藥劑，差異顯著。

從對藍莓、果桑安全性調查來看，枯草芽孢桿菌JQ-5對藍莓、桑椹具有明顯的促生增產(chǎn)效果，400倍處理后，藍莓、桑椹增產(chǎn)率在20％以上，沒有藥害，安全可靠。