本發(fā)明涉及一種從微生物發(fā)酵液或酶轉(zhuǎn)化液中提取α-酮戊二酸的方法，屬于生物分離提取技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
α-酮戊二酸(α-KG)是三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵的中間代謝產(chǎn)物，是氨基酸和蛋白質(zhì)代謝過程中主要的前體物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化妝品等領(lǐng)域。
目前，α-KG的合成方式主要有化學(xué)法及生物合成法兩種。生物合成法主要是利用微生物發(fā)酵將廉價的碳源物質(zhì)或酶法將其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化成α-KG。傳統(tǒng)的有機酸提取方法主要有樹脂吸附解析法(衣康酸、曲酸、2-酮基-L-古龍酸提取)和鈣鹽沉淀法(乳酸、檸檬酸提取)。然而，當(dāng)發(fā)酵液中含有α-KG的類似物，如與酮戊二酸的理化性質(zhì)比較相似的丙酮酸，傳統(tǒng)分離提取方法便存在一定困難，例如，主要依據(jù)分子大小、帶電情況的樹脂吸附解析就無法有效分開丙酮酸副產(chǎn)物。α-酮戊二酸鈣沉淀法需在堿性條件下進(jìn)行加熱處理，在此條件下，丙酮酸由于理化不穩(wěn)定易發(fā)生聚合反應(yīng)生一系列的聚合物。
因此，目前急需一種高效的純化微生物發(fā)酵或酶轉(zhuǎn)化過程所產(chǎn)生的α-酮戊二酸的方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種從含有α-酮戊二酸的微生物發(fā)酵液或酶轉(zhuǎn)化液中分離提取α-酮戊二酸的方法。所述方法是將含有α-酮戊二酸的溶液進(jìn)行濃縮、酸化、萃取、蒸餾、結(jié)晶、精制；所述濃縮是將含α-酮戊二酸的微生物發(fā)酵液或酶轉(zhuǎn)化液進(jìn)行濃縮，使α-酮戊二酸濃度≥120g/L；酸化前將濃縮后的溶液經(jīng)過離子交換樹脂處理，將經(jīng)離子交換樹脂處理后的濃縮液調(diào)至pH≤1.5；所述萃取是采用非水溶性有機溶劑，在5～40℃下萃取10～60min；所述蒸餾為減壓蒸餾，蒸餾溫度30～60℃，蒸餾壓力為-0.07～-0.1Mpa；所述結(jié)晶為低溫冷卻結(jié)晶，結(jié)晶溫度≤15℃；所述精制為采用非水溶性有機溶劑淋洗、然后離心、干燥、粉碎。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述濃縮前還進(jìn)行分離和過濾，所述分離和過濾包括離心分離、超濾、微濾或板框過濾中的一種或幾種的組合。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述離子交換樹脂為陽離子交換樹脂。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述非水溶性有機溶劑是乙酸乙酯或乙酸丁酯。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述淋洗時乙酸乙酯或乙酸丁酯等非水溶性有機溶劑用量≤1/2結(jié)晶粗品體積，所述干燥條件為50～80℃。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法包括如下步驟：
1)預(yù)處理：將含有α-酮戊二酸發(fā)酵液的微生物發(fā)酵液或酶轉(zhuǎn)化液分離去除菌體和其他可見固型物，經(jīng)過濾去除大分子物質(zhì)，濃縮后經(jīng)離子交換樹脂去除高價金屬離子，從而獲得含有α-酮戊二酸的預(yù)處理液；
2)α-酮戊二酸粗品的獲?。侯A(yù)處理液酸化后，以非水溶性有機溶劑萃取預(yù)處理液中的α-酮戊二酸，將萃取液進(jìn)一步蒸發(fā)濃縮得到高濃度α-酮戊二酸溶液，低溫放置進(jìn)行低溫冷卻結(jié)晶，分離母液獲得α-酮戊二酸粗晶體；
3)α-酮戊二酸精品的獲?。簩ⅵ?酮戊二酸粗晶體用非水溶性有機溶劑淋洗，烘干、粉碎后獲得α-酮戊二酸精品。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法按如下步驟操作：
a：將含有α-酮戊二酸的微生物發(fā)酵液或酶轉(zhuǎn)化液去除菌體和其他可見固型物，具體采用下述至少一種方式：離心分離、板框過濾分離或微濾過濾分離。
b：將去除菌體和其他可見固型物后的清液經(jīng)超濾處理，去除其中的菌體碎片、色素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖等大分子物質(zhì)，并用少量水洗滌過濾殘留液。所述超濾膜組件可為卷式膜、管式膜和板式膜，膜截留分子量為500～3000。
c：將超濾過濾液經(jīng)蒸餾處理，使α-酮戊二酸濃度≥120g/L，所述蒸餾條件為：-0.07～-0.095Mpa，50～80℃。
d：將蒸餾后的濃縮液通過陽離子交換樹脂，去除高價陽離子，同時起到部分酸化的作用。所述離子交換樹脂可以為732陽離子交換樹脂。
e：將上述濃縮液邊攪拌邊加入濃硫酸調(diào)節(jié)過濾液pH≤1.5。
f：向酸化液中加入乙酸乙酯或乙酸丁酯等非水溶性有機溶劑萃取，所述萃取條件為5～40℃，萃取劑加入量為≥2倍酸化液體積，萃取時間10～60min，萃取次數(shù)≥2次。
g：蒸餾萃取劑乙酸乙酯或乙酸丁酯等非水溶性有機溶劑，濃縮至α-酮戊二酸濃度≥200g/L，所述蒸餾條件為：-0.07～-0.095Mpa，30～60℃。
h：將濃縮液迅速低溫冷卻結(jié)晶，所述溫度≤15℃，時間1～5天，然后離心分離晶體和母液。
i：將上述所得晶體經(jīng)乙酸乙酯或乙酸丁酯洗滌等非水溶性有機溶劑，乙酸乙酯或乙酸丁酯等非水溶性有機溶劑用量為≤1/2倍粗品體積，然后在50～80℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干，粉碎后即可得到固體粉末(α-酮戊二酸產(chǎn)品)。
有益效果：本發(fā)明的提取方法有效解決了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸過程中副產(chǎn)物丙酮酸對α-酮戊二酸提取帶來的副作用，α-酮戊二酸的純度達(dá)99％以上，收率達(dá)80％以上，產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到食品、醫(yī)藥級等合格標(biāo)準(zhǔn)，具有更高的經(jīng)濟(jì)價值。本發(fā)明具有工藝操作簡單高效、費用低、具有很大的工業(yè)化應(yīng)用潛力。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的提取工藝流程圖，以乙酸乙酯萃取為例。
具體實施方式
α-酮戊二酸的測定方法：高效液相色譜(HPLC)
儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器和工作站)，色譜條件：色譜柱：Aminex HPX-87H ion exchange column；流動相：5mM H2SO4；流速：0.5mL/min柱溫：40℃樣量：10μL；紫外檢測器波長：210nm
純度計算方法：
f1—HPLC檢測的標(biāo)品溶液峰面積；
f2—HPLC檢測的試樣溶液峰面積；
m1—標(biāo)品質(zhì)量，單位為克(g)；
m2—試樣質(zhì)量，單位為克(g)；
p—標(biāo)品的純度，數(shù)值以％表示。
收率計算方法：
M—提取所得精品總質(zhì)量；
W—所得的精品的純度；
C—發(fā)酵液中樣品的濃度；
V—去除菌體后發(fā)酵液的體積。
以下實施例是從含有α-KG的微生物發(fā)酵液或酶轉(zhuǎn)化液中提取α-KG的方法，在以解脂亞洛酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06CCTCC NO：M20714為發(fā)酵菌種獲得的發(fā)酵液中提取α-KG為例。其他類似含有α-KG的微生物發(fā)酵液或酶轉(zhuǎn)化液，均可按本發(fā)明的實施方式進(jìn)行，并經(jīng)過簡單的改進(jìn)獲得具有較高純度的α-KG成品。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實施例1
按如下步驟進(jìn)行α-酮戊二酸的提?。?/p>
(1)離心過濾：將含有α-KG的微生物發(fā)酵液泵入離心機中，離心去除菌體和其他可見固型物。離心條件：常溫，轉(zhuǎn)速3000r/min。
(2)膜過濾：采用超濾過濾去除雜質(zhì)，將離心去除菌體和其他可見固型物后的清液經(jīng)超濾處理，去除微生物發(fā)酵液或酶轉(zhuǎn)化液中的菌體碎片、色素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖等大分子物質(zhì)，并用少量水洗滌過濾殘留液以提高超濾過程收率。所用超濾膜組件管式膜組件，膜材料為截留分子量為500～3000Da的聚乙烯膜，超濾條件：常溫，操作壓力4～10Bar。
(3)濃縮：將超濾過濾液在-0.08Mpa，65℃條件下減壓蒸餾，將α-酮戊二酸濃度濃縮至120g/L以上。
(4)離子交換樹脂除雜：將732陽離子交換樹脂酸化至pH 2.0，清水洗滌至中性(鈉型樹脂轉(zhuǎn)化成氫型樹脂)，上柱，將濃縮液通過交換樹脂處理，少量乙酸乙酯洗滌。此操作目的在于去除濃縮液中的高價陽離子，同時起到部分酸化作用。
(5)酸化：在常溫條件下，邊攪拌邊往上述經(jīng)離子交換樹脂處理后的濃縮液中加入濃硫酸，將濃縮液pH調(diào)節(jié)至≤1.5。
(6)萃取：向酸化液中加入3倍酸化液體積的乙酸乙酯，15℃條件下萃取，萃取時間為20min，分離出有機相，共萃取3次。
(7)蒸餾：將萃取后分理處的有機溶劑乙酸乙酯在-0.08Mpa，50℃條件下進(jìn)行減壓蒸餾，濃縮至α-酮戊二酸濃度為200g/L。
(8)結(jié)晶：將蒸餾有機溶劑后濃稠液于10℃低溫條件下冷卻結(jié)晶，養(yǎng)晶1天，離心分離出晶體。
(9)精制：所得α-酮戊二酸粗晶體用乙酸乙酯洗滌，α-酮戊二酸粗品與乙酸乙酯的體積比為4:1，離心去除乙酸乙酯，在65℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干，粉碎后得到α-酮戊二酸精品。經(jīng)質(zhì)量檢測α-酮戊二酸純度為99.5％，收率為81.5％，相比于傳統(tǒng)分離技術(shù)能取得的98％的純度、70％的收率，產(chǎn)品質(zhì)量和提取收率明顯提升，具有極高的經(jīng)濟(jì)效益。
實施例2
實施方式同實施例1，其區(qū)別在于濃縮后、酸化前不進(jìn)行離子交換樹脂除雜。
對制備獲得的α-酮戊二酸含量進(jìn)行檢測，其純度為98.1％，收率為83.8％。
實施例3
在實施例1的基礎(chǔ)上，省略濃縮前的膜過濾步驟。對制備獲得的α-酮戊二酸含量進(jìn)行檢測，其純度為95.3％，收率為80.4％。
實施例4
在實施例1的基礎(chǔ)上，步驟(5)酸化時將濃縮液pH調(diào)節(jié)至2～4，對制備獲得的α-酮戊二酸含量進(jìn)行檢測，其純度為99.3％，收率為50.1％。
實施例5
在實施例1的基礎(chǔ)上，步驟(5)酸化后不進(jìn)行有機溶劑萃取，直接在-0.08Mpa，50℃條件下進(jìn)行減壓蒸餾，濃縮至α-酮戊二酸濃度為200g/L，再進(jìn)行后期結(jié)晶、精制等過程。對制備獲得的α-酮戊二酸含量進(jìn)行檢測，其純度為92.4％，收率為54.9％。
實施例6
在實施例1的基礎(chǔ)上，采用乙醇進(jìn)行萃取和精制洗滌，乙醇與水互溶無法達(dá)到萃取效果，但析出部分多糖等物質(zhì)，過濾去除析出物質(zhì)，在-0.08Mpa，35℃條件下蒸餾出乙醇，待乙醇蒸餾完后，升高溫度至50℃繼續(xù)減壓蒸餾，濃縮至α-酮戊二酸濃度為200g/L，然后進(jìn)行后期結(jié)晶、精制等過程。對制備獲得的α-酮戊二酸含量進(jìn)行檢測，其純度為93.8％，收率為71.2％。
實施例7
在實施例1的基礎(chǔ)上，步驟(6)采用乙酸丁酯進(jìn)行萃取和精制洗滌。對制備獲得的α-酮戊二酸含量進(jìn)行檢測，其純度為99.4％，收率為80.9％。
實施例8
按如下步驟進(jìn)行α-酮戊二酸的提?。?/p>
(1)離心過濾：將含有α-KG的微生物發(fā)酵液泵入離心機中，離心去除菌體和其他可見固型物。離心條件：常溫，轉(zhuǎn)速3000r/min。
(2)膜過濾：采用超濾過濾去除雜質(zhì)，將離心去除菌體和其他可見固型物后的清液經(jīng)超濾處理，去除微生物發(fā)酵液或酶轉(zhuǎn)化液中的菌體碎片、色素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖等大分子物質(zhì)，并用少量水洗滌過濾殘留液以提高超濾過程收率。所用超濾膜組件管式膜組件，膜材料為截留分子量為500Da的聚乙烯膜，超濾條件：常溫，操作壓力6～9Bar。
(3)濃縮：將超濾過濾液在-0.08Mpa，65℃條件下減壓蒸餾，將α-酮戊二酸濃度濃縮至150g/L。
(4)鈣鹽沉淀：將(3)得到的濃縮液升溫至35℃，邊攪拌邊加入氯化鈣，30min加入過量的氯化鈣，攪拌反應(yīng)2h，加入氯化鈣后溶液pH有所下降，α-酮戊二酸鈣鹽沉淀量很少。表明在此條件下，鈣鹽沉淀法不太適合α-酮戊二酸的提取。
實施例9
按如下步驟進(jìn)行α-酮戊二酸的提?。?/p>
(1)離心過濾：將含有α-KG的微生物發(fā)酵液泵入離心機中，離心去除菌體和其他可見固型物。離心條件：常溫，轉(zhuǎn)速3000r/min。
(2)膜過濾：采用超濾過濾去除雜質(zhì)，將離心去除菌體和其他可見固型物后的清液經(jīng)超濾處理，去除微生物發(fā)酵液或酶轉(zhuǎn)化液中的菌體碎片、色素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖等大分子物質(zhì)，并用少量水洗滌過濾殘留液以提高超濾過程收率。所用超濾膜組件管式膜組件，膜材料為截留分子量為500Da的聚乙烯膜，超濾條件：常溫，操作壓力6～9Bar。
(3)濃縮：將超濾過濾液在-0.08Mpa，65℃條件下減壓蒸餾，將α-酮戊二酸濃度濃縮至150g/L。
(4)鈣鹽沉淀：將(3)得到的濃縮液升溫至35℃，邊攪拌邊加入氯化鈣，30min加入過量的氯化鈣，攪拌反應(yīng)2h。在偏堿性條件下，加熱可促進(jìn)α-酮戊二酸鈣鹽的沉淀，用5mol/L的氫氧化鈣調(diào)節(jié)濃縮液pH至7.5，水浴煮沸20min，離心獲得α-酮戊二酸鈣鹽。HPLC檢測液相中α-酮戊二酸殘留，結(jié)果表明在此條件下，沉淀效率為65.8％，表明鈣鹽沉淀法不太適合α-酮戊二酸的提取。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。