本發(fā)明涉及一種從金針菇中制備亞硝酸鹽還原酶的方法，屬于食品酶生物技術(shù)領(lǐng)域。
二、
背景技術(shù)：
亞硝酸鹽為常見的化學(xué)致病源之一，是強致癌物亞硝胺的前體物質(zhì)，攝入人體后能與人體中的次級胺反應(yīng)，形成亞硝胺，可誘發(fā)多種癌癥；過量攝入亞硝酸鹽也會引起高鐵血紅蛋白癥，導(dǎo)致缺氧窒息。近年來，由于大量使用氮肥及利用工業(yè)廢水和生活污水灌溉農(nóng)田，使得農(nóng)業(yè)用地亞硝酸鹽污染愈演愈烈，致使蔬果、糧食及飼料等農(nóng)產(chǎn)品中亞硝酸鹽超標(biāo)；另一方面，傳統(tǒng)腌制品、肉制品在加工過程中會積累或引入亞硝酸鹽，同樣會帶來食品安全隱患，給消費者造成嚴(yán)重的健康威脅。目前，如何控制和降低亞硝酸鹽在相關(guān)食品中的含量，已成為食品安全領(lǐng)域的焦點問題之一。
近年來，利用生物酶法消除食品中的亞硝酸鹽已成為解決該問題的新途徑之一。研究表明，亞硝酸鹽還原酶是一種有效降解亞硝酸鹽的物質(zhì)，是氮循環(huán)中反硝化過程中的關(guān)鍵作用酶，在高等植物、藻類植物、細(xì)菌及大型真菌中廣泛存在。目前，對于亞硝酸鹽還原酶的分離提取、化學(xué)結(jié)構(gòu)及酶學(xué)性質(zhì)的研究廣受關(guān)注，研究成果在肉制品和腌制品加工領(lǐng)域中也得到了初步應(yīng)用。但對于亞硝酸鹽還原酶的制備原料、高效制備方法及作用機制研究仍有待深入探索，相關(guān)的應(yīng)用技術(shù)和提取后酶活力的穩(wěn)定化保護同樣值得進一步研究。
金針菇(Flammulina velutipes)屬真菌門，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口磨科，金錢菌屬，是世界第三大食用菌，2015年我國金針菇年產(chǎn)量超過320萬噸，需求量呈穩(wěn)步增長態(tài)勢，隨著金針菇工廠化生產(chǎn)技術(shù)的提高，金針菇的產(chǎn)量越來越大。金針菇中活性蛋白含量豐富、來源穩(wěn)定、綠色安全，且富含多種活性酶物質(zhì)，是極具開發(fā)潛力的大型食用真菌。本發(fā)明利用金針菇提取亞硝酸鹽還原酶，提供了一種提取該酶的新來源和新途徑，可應(yīng)用于醬菜、腌肉、研制咸菜等發(fā)酵食品領(lǐng)域來降低產(chǎn)品中亞硝酸鹽的含量。
三、
技術(shù)實現(xiàn)要素：
技術(shù)問題
在眾多降低食品內(nèi)亞硝酸鹽含量的方法中，生物酶解法是新興的技術(shù)之一。亞硝酸鹽還原酶廣泛存在于高等植物、藻類植物、細(xì)菌及大型真菌中，是一種胞內(nèi)的氧化還原類酶，其能有效地降解亞硝酸鹽，大大降低食品中積累的亞硝酸鹽，從而保證食品安全。但目前亞硝酸鹽還原酶多由乳酸菌、蠟狀芽孢桿菌等微生物中提取，來源缺乏廣泛性，技術(shù)應(yīng)用并不成熟，而從大型食用真菌中提取該酶的報道也未曾出現(xiàn)。本發(fā)明提供了一種利用金針菇進行亞硝酸鹽還原酶的制備方法，為亞硝酸鹽還原酶的制備提供新思路，促進生物酶解法在降低食品中亞硝酸鹽含量方面的應(yīng)用，保證醬菜、腌肉、研制咸菜等發(fā)酵食品的安全與人類健康，為相關(guān)食品加工的安全生產(chǎn)提供技術(shù)支持。
技術(shù)解決方案
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案步驟為：
(1)清洗凍干：將金針菇用流水或清洗機徹底洗凈，瀝干，切分，放入-20℃條件下預(yù)凍12h后，放入真空冷凍干燥機處理48h，凍干樣品低溫粉碎后，菇粉過100目篩，置于-20℃條件下備用；
(2)超聲波輔助酶法提?。簩⒐椒郯戳弦罕?∶30溶解于蒸餾水，135W超聲波處理15min，調(diào)節(jié)pH至5.0，加入溶壁酶200～400U/g菇粉重，35℃酶解2h，調(diào)pH為中性，5000r/min離心30min，收集上清液，硫酸銨至75％飽和度，4℃靜置2h，5000r/min離心20min，取沉淀，14kDa透析袋脫鹽后濃縮得到粗酶液，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
(3)酶分離純化：粗酶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，用DEAE-Sepharose Fast Flow和葡聚糖凝膠G-150層析柱分離純化，收集具有酶活性的蛋白質(zhì)，經(jīng)透析，PEG20000包埋濃縮18h，凍干即得亞硝酸鹽還原酶，置于4℃保存。
有益效果
本發(fā)明創(chuàng)造性地提出了從大型食用真菌——金針菇中提取亞硝酸鹽還原酶的方法，并采用超聲波輔助溶壁酶的提取工藝，經(jīng)過工藝優(yōu)化，能高效地提取并分離純化出亞硝酸鹽還原酶，較傳統(tǒng)水提法及機械破碎等提取方法，具有更高的提取效率和得率。本發(fā)明拓展了該酶的原料來源，所得的亞硝酸鹽還原酶可用于醬菜、腌肉、研制咸菜等發(fā)酵食品領(lǐng)域，以降低其中亞硝酸鹽的含量，避免亞硝酸鹽超標(biāo)所帶來的食品安全隱患。
四、具體實施方式
結(jié)合以下具體實例對本發(fā)明的方法和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
實施例 亞硝酸鹽還原酶的制備
將金針菇加工副產(chǎn)物(菇根、菇柄及殘次菇)用流水或清洗機徹底洗凈，瀝干，分切，放入-20℃冰箱預(yù)凍12h后，放入真空冷凍干燥機處理48h，凍干樣品低溫(4℃)粉碎后，菇粉過100目篩，得到菇粉。將菇粉按料液比1∶30溶解于蒸餾水，135W超聲波處理，調(diào)節(jié)pH至5.0，加入溶壁酶400U/g菇粉重，35℃酶解2h，調(diào)pH為中性，5000r/min離心30min，收集上清液，硫酸銨加至60％飽和度，4℃靜置2h，5000r/min離心20min，取沉淀，14kDa透析袋脫鹽后濃縮得到粗酶液，粗酶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，用DEAE-Sepharose Fast Flow和G-150層析柱分離純化，檢測A280值，用鹽酸萘乙二胺法測定酶活力，收集具有酶活性的蛋白質(zhì)，經(jīng)透析，PEG20000包埋濃縮18h，凍干得到亞硝酸鹽還原酶，置于4℃保存。