一種耐熱精氨酸酶的基因表達(dá)序列和應(yīng)用，屬于基因工程和現(xiàn)代酶技術(shù)工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

L-鳥氨酸是一種不參與蛋白質(zhì)組成、含有兩個(gè)-NH₂和一個(gè)-COOH的堿性氨基酸。L-鳥氨酸普遍存在于生物體內(nèi)，是尿素循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，是瓜氨酸、L-精氨酸等多種氨基酸代謝的前體物質(zhì)，對(duì)體內(nèi)聚集的氨具有解毒作用，可促進(jìn)氨態(tài)氮的排出，因而對(duì)人體肝臟細(xì)胞具有重要意義。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，L-鳥氨酸具有以下生理或物理化學(xué)功能：1、保肝護(hù)肝；2、減肥保?。?、促進(jìn)傷口愈合及增強(qiáng)免疫力；4、抑制苦味。2002年12月日本厚生勞動(dòng)省發(fā)布通告，將L-鳥氨酸作為食品原料來看待；在歐美L-鳥氨酸也被廣泛用于提高基礎(chǔ)代謝、預(yù)防肥胖以及增強(qiáng)肌肉合成的膳食補(bǔ)充劑。正是基于L-鳥氨酸所具有的諸多作用，目前對(duì)有關(guān)L-鳥氨酸的功能、制備及應(yīng)用等各方面研究也悄然成為研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

目前用于L-鳥氨酸生產(chǎn)的方法主要有4種：發(fā)酵法、天然提取法、化學(xué)合成法和酶法。但L-鳥氨酸在自然界中存量較小，不足以大量提?。换瘜W(xué)合成法也因合成所需的化學(xué)物質(zhì)有毒且會(huì)產(chǎn)生消旋體而受到限制；發(fā)酵法生產(chǎn)雖然原料價(jià)格低廉，但對(duì)菌種的依賴性強(qiáng)，菌種有回復(fù)突變的問題，補(bǔ)料發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵控制起來難度較大，產(chǎn)量較低，發(fā)酵液中成分復(fù)雜，不利于L-鳥氨酸下游的分離純化工作等。而利用精氨酸酶酶法水解L-精氨酸制備L-鳥氨酸就是一個(gè)經(jīng)濟(jì)實(shí)用且綠色環(huán)保的方法，因此對(duì)精氨酸酶研究的熱點(diǎn)、廣度及深度也進(jìn)一步增強(qiáng)。

酶法是利用動(dòng)植物或微生物體內(nèi)的精氨酸酶作為催化劑，水解L-精氨酸生成L-鳥氨酸。精氨酸酶的來源不易，傳統(tǒng)的酶法采用的精氨酸酶取自動(dòng)物肝臟，但動(dòng)物來源的精氨酸酶其熱穩(wěn)定性較差且酶活不高。生物酶法是目前工業(yè)上的熱點(diǎn)方法，利用分子生物技術(shù)和基因工程技術(shù)，可以將外源的精氨酸酶基因表達(dá)于合適的載體，從而高效表達(dá)得到大量穩(wěn)定性好且高活性的精氨酸酶。相比于傳統(tǒng)動(dòng)物來源精氨酸酶具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種精氨酸酶。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種精氨酸酶基因的調(diào)取方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種精氨酸酶的編碼基因。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有上述的精氨酸酶編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或基因重組菌。

本發(fā)明的又一目的在于提供上述精氨酸酶編碼基因在表達(dá)精氨酸酶中的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種鳥氨酸的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

本發(fā)明提供的精氨酸酶，其氨基酸序列的編碼基因克隆自Rummeliibacillus pycnus SK31.001。本發(fā)明提供一種由實(shí)驗(yàn)室保藏的芽孢桿菌（Rummeliibacillus pycnus ）SK31.001（已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào) CCTCC NO：M 2011466，發(fā)明專利公開號(hào)：CN102433288A）。具有下述序列：

其核苷酸序列為序列表中的SEQ ID NO：1。

其氨基酸序列為編碼序列表中的SEQ ID NO：2。

一種耐熱精氨酸酶的基因表達(dá)序列，對(duì)比不同微生物來源精氨酸酶基因，獲得其保守氨基酸序列，并根據(jù)其氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物P1及P2，利用簡(jiǎn)并PCR，以Rummeliibacillus pycnus SK31.001基因組為模板獲得部分精氨酸酶基因序列SEQ ID NO：3；再設(shè)計(jì)反向引物P3及P4，進(jìn)行反向PCR；獲得耐熱精氨酸酶的基因表達(dá)序列SEQ ID NO：1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

部分精氨酸酶基因序列SEQ ID NO：3的獲得：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中不同來源的精氨酸酶基因序列對(duì)比結(jié)果，找到保守序列：GVDMPSA， GNIHGM， GVGTPVI 和HLAMEML，并選取兩段保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物：

上游引物P1：5’-ggngtngaya tgggncc-3’，

下游引物P2：5’-acnggngtnc cnacncc-3’，

提取Rummeliibacillus pycnus SK31.001的總DNA，以其基因組為模板，擴(kuò)增部分精氨酸酶基因序列，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，并TA克隆至pMD-19T質(zhì)粒上，測(cè)序結(jié)果為序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

設(shè)計(jì)反向引物，擴(kuò)增已知片段的外側(cè)基因序列，引物設(shè)計(jì)如下：

上游引物P3：5’- tgcgcctaaa gtaaaacctg-3’，

下游引物P4： 5’- gaattgcact tggacccat-3’，

選取合適的內(nèi)切酶Hind Ⅲ單切Rummeliibacillus pycnus SK31.001基因組，再利用T4鏈接酶環(huán)化單切的基因組片段，并以此作為反向PCR的模板，進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增已知序列的外側(cè)未知序列；

兩者相結(jié)合得到精氨酸酶基因的完整序列，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1。

一種耐熱精氨酸酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO：2。

所述的耐熱精氨酸酶的基因表達(dá)序列的應(yīng)用，其在大腸桿菌表達(dá)構(gòu)建重組表達(dá)載體，將精氨酸酶編碼基因插入到大腸桿菌表達(dá)載體中得到表達(dá)精氨酸酶的重組表達(dá)載體：所述的大腸桿菌表達(dá)載體優(yōu)選為pET-28a（+），構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒為pET-28a（+）-arg。

其在大腸桿菌表達(dá)，篩選得到表達(dá)精氨酸酶基因的重組菌株；所述的大腸桿菌優(yōu)選為大腸桿菌BL21（DE3），構(gòu)建的重組菌株為E.coliBL21（DE3）-pET-28a（+）-arg。

一種制備鳥氨酸的方法，是以精氨酸為底物，用所述的E.coli BL21（DE3）-pET-28a（+）-arg重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化精氨酸生成鳥氨酸，反應(yīng)底物濃度為200g/L，溫度40℃，pH9.5，Mn²⁺濃度為1mM，100mL體系中加入0.3g濕菌體反應(yīng)6h即得到95.4%轉(zhuǎn)化率的鳥氨酸。

構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，獲得該基因表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行研究，確定其酶學(xué)性質(zhì)。這一成功利用簡(jiǎn)并PCR與反向PCR調(diào)取精氨酸酶基因的技術(shù)尚屬第一次報(bào)導(dǎo)。尚無文獻(xiàn)檢索到公開的文獻(xiàn)和專利等利用該技術(shù)調(diào)取Rummeliibacillus pycnus精氨酸酶基因。這一DNA序列區(qū)別于已報(bào)道的其他精氨酸酶基因序列，且該基因編碼的精氨酸酶在氨基酸序列大小、酶的分子大小、酶的最適溫度及最適pH等方面都有所不同。因此可判斷本發(fā)明屬于一種新的發(fā)明。

從Rummeliibacillus pycnus中得到的精氨酸酶具有以下特征：

1、該精氨酸酶編碼基因長(zhǎng)度為906bp，編碼301個(gè)氨基酸，亞基分子量約為34kDa；

2、該精氨酸酶的最適反應(yīng)溫度為80℃，適合反應(yīng)的溫度范圍為60-85℃；

3、該精氨酸酶的最適反應(yīng)pH為9.5，適合反應(yīng)的pH范圍為8.0-10.0；

4、二價(jià)金屬濃度在1mM時(shí)，Mn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺和Mg²⁺對(duì)酶活有促進(jìn)作用，其中Mn²⁺促進(jìn)作用最明顯，而Cu²⁺和Ba²⁺對(duì)酶活有抑制作用。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所述的精氨酸酶基因調(diào)取方法成功將目的基因從未知基因組中提取出來，為其他未知精氨酸酶基因的獲取提供了新思路；本發(fā)明所述的精氨酸酶基因?qū)儆谑状螆?bào)道發(fā)現(xiàn)，尚無文獻(xiàn)檢索到公開的文獻(xiàn)和專利等利用該技術(shù)調(diào)取Rummeliibacillus pycnus精氨酸酶基因；本發(fā)明所述重組表達(dá)獲得的精氨酸酶最適溫度在80℃，具有良好的耐熱性；本發(fā)明所述的精氨酸酶酶法轉(zhuǎn)化精氨酸生成鳥氨酸，以最優(yōu)選200g/L的精氨酸底物濃度，在最佳條件先反應(yīng)6h，即可得到95.4%轉(zhuǎn)化率的鳥氨酸，反應(yīng)速度快，從而可以減少設(shè)備的占用率和提高生產(chǎn)率，有利于降低成本；本發(fā)明所述的精氨酸酶在天然Rummeliibacillus pycnus SK31.001中含量低，應(yīng)用基因工程技術(shù)，將目的基因異源表達(dá)于大腸桿菌體系中可使酶活力提高數(shù)千倍，有助于鳥氨酸的生產(chǎn)。

附圖說明

圖1. Rummeliibacillus pycnus SK31.001精氨酸酶基因調(diào)取策略示意圖。

圖2.Rummeliibacillus pycnus SK31.001精氨酸酶基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖。1、精氨酸酶基因片段；M、DNA marker。

圖3. pH對(duì)精氨酸酶的影響。

圖4.溫度對(duì)精氨酸酶的影響。

圖5. 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)鳥氨酸反應(yīng)時(shí)間與產(chǎn)物底物濃度關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但下列實(shí)施例不限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：Rummeliibacillus pycnus精氨酸酶編碼基因的核苷酸序列調(diào)取

1.因Rummeliibacillus pycnus其已知報(bào)導(dǎo)的序列僅為其16sRNA序列，進(jìn)而其精氨酸酶編碼基因序列的調(diào)取策略如圖1所示。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中不同來源的精氨酸酶基因序列對(duì)比結(jié)果，找到保守序列：GVDMPSA，GNIHGM，GVGTPVI 和HLAMEML，并選取兩段保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。引物設(shè)計(jì)如下：

上游引物P1：5’-ggngtngaya tgggncc-3’，

下游引物P2：5’-acnggngtnc cnacncc-3’，

提取Rummeliibacillus pycnus SK31.001的總DNA，以其基因組為模板，擴(kuò)增部分精氨酸酶基因序列，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，并TA克隆至pMD-19T（simple）質(zhì)粒上，并送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果為序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

2. 根據(jù)SEQ ID NO：3所示的部分核苷酸序列，設(shè)計(jì)反向引物，擴(kuò)增已知片段的外側(cè)基因序列。引物設(shè)計(jì)如下：

上游引物P3：5’- tgcgcctaaa gtaaaacctg-3’，

下游引物P4：5’- gaattgcact tggacccat-3’，

選擇合適的內(nèi)切酶（Hind Ⅲ），將Rummeliibacillus pycnus SK31.001的基因組切斷，并用T4連接酶將上述切斷的基因片段環(huán)化連接，并以此作為反向PCR的模板。瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，并TA克隆至pMD-19T（simple）質(zhì)粒上，并送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果與SEQ ID NO：3序列結(jié)合為序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

3. 分析SEQ ID NO：4核苷酸序列，推測(cè)出精氨酸酶基因編碼的完整序列，如序列表中SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

實(shí)施例2：Rummeliibacillus pycnus精氨酸酶編碼基因的核苷酸序列克隆表達(dá)

1.提取Rummeliibacillus pycnus SK31.001的總DNA，以其基因組為模板，使用特異性引物P5（加入BamHⅠ酶切位點(diǎn)）和P6（加入XhoⅠ酶切位點(diǎn)），經(jīng)PCR擴(kuò)增得到完整的精氨酸酶基因。引物設(shè)計(jì)如下：

上游引物P5：5’-cgcggatcca tggaatcatt aaaaatatca atga-3’，

下游引物P6：5’-ccgctcgagt taaactaaag tctcaccaaa taa-3’，

瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，所得電泳圖如圖2所示。

2. 將電泳分離的特異性目的片段進(jìn)行切膠，然后利用膠回收試劑盒回收目的片段PCR產(chǎn)物，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒pET-28a（+）在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET-28a（+）-arg。

3. 將重組質(zhì)粒pET-28a（+）-arg轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli BL21（DE3）中，涂布在含有50μg/L卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，得到初步陽性菌落。挑取陽性克隆菌落于5mL LB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素）中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h。提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否為具有目的基因片段的質(zhì)粒，并將確定的質(zhì)粒送去上海生物工程有限公司測(cè)序。目的基因測(cè)序結(jié)果為SEQ ID NO：1，編碼氨基酸序列為SEQ ID NO：2。

實(shí)施例3：Rummeliibacillus pycnus精氨酸酶的異源表達(dá)和性質(zhì)測(cè)定

1.將重組質(zhì)粒pET-28a（+）-arg轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli BL21（DE3）中，涂布在含有50μg/L卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，得到初步陽性菌落。

2. 挑取陽性克隆菌落于5mL LB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素）中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h作為種子液。以1%的添加量轉(zhuǎn)接至LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6，加入終濃度為0.4mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG））并在28℃下進(jìn)行誘導(dǎo)，12h后收集菌體。4℃、8000rpm離心棄上清。

3.收集的菌體用Tris緩沖液（pH7.0）重新懸浮，并超聲破碎細(xì)胞，4℃、 10000rpm離心，取上清即得到精氨酸酶的粗酶液。

4.底物濃度為100mM，精氨酸酶濃度為0.06μM，反應(yīng)溫度為80℃，反應(yīng)時(shí)間10min，在pH5.0-10.0間進(jìn)行反應(yīng)并加入接觸媒氯化錳（1mM）。測(cè)定精氨酸酶最適pH。結(jié)果表明重組精氨酸酶最適pH范圍為8.0-10.0（圖3）。

5.底物濃度為100mM，精氨酸酶濃度為0.06μmol，pH9.5，反應(yīng)時(shí)間10min，在30-90℃間進(jìn)行反應(yīng)并加入接觸媒氯化錳（1mM）。測(cè)定精氨酸酶最適溫度。結(jié)果表明重組精氨酸酶適于反應(yīng)的溫度范圍為60-85℃（圖4）。

實(shí)施例4：全細(xì)胞反應(yīng)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥氨酸

100mL反應(yīng)體系中：精氨酸底物濃度200g/L，鹽酸調(diào)節(jié)pH至9.5，接觸媒氯化錳至終濃度1mM，反應(yīng)溫度為40℃，加入實(shí)施例3中發(fā)酵得到的濕菌體0.3g。酶反應(yīng)進(jìn)行中在各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定底物與產(chǎn)物的量并記錄。發(fā)現(xiàn)該全細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有高效的L-鳥氨酸合成能力，見圖5。在200 g/L底物濃度的生產(chǎn)中，反應(yīng)6h即可得到95.4%摩爾轉(zhuǎn)化的L-鳥氨酸產(chǎn)物。

SEQ ID NO：1

atggaatcat taaaaatatc aatgattggg gttcctatgg atatggggca gttacgcaga 60

ggtgttgata tgggtccaag tgcaattcgc tatgctggcg cggttgaacg tttaataaat 120

attggtcata cagtaataga tgatggggat atctatattg accattcaaa aaaagaaagt 180

tctacaaatt cagcattaag aaatttagag gcagttattg aagcaaatac taagttagct 240

caaaaagttc atgaaatagt agagaaagga agattccctt tagtactggg tggtgatcat 300

agtattgcga taggtacgtt agctggaatt tcagatcact acgaaaatct aggtgttatt 360

tggtatgatg ctcatgcaga tatgaataca agtgaaacat caccctcagg aaatattcat 420

ggcatgccat tagctgttag catgggtatt ggtgatgaag gtttggtaaa tattaaagga 480

tatgcgccta aagtaaaacc tgagaatatt gttattatcg gtgcacgttc tattgatcag 540

ggtgagaagc aattaattcg tgaaaaaggt ataaaagtat attcaatgca tgaaattgat 600

cgtctaggca tgactgatgt tatacaagat gcaattattt atttaaaagg tcaaaatgta 660

gatggcgttc atttatctct agatttagat ggcattgatc cgatatatac tccaggagta 720

ggaacaccag tgccaggtgg aataacatac agagaaagtc atctagccat ggaaatgttg 780

caagaatcag gtttagttac atctgcagaa tttgtagaag tcaatccaat acttgatgaa 840

agaaataaaa cagctgacgt agcagttgct ttaatgggtt cattatttgg tgagacttta 900

gtttaa 906

SEQ ID NO：2

MET Glu Ser Leu Lys Ile Ser MET Ile Gly Val Pro MET Asp MET

5 10 15

Gly Gln Leu Arg Arg Gly Val Asp MET Gly Pro Ser Ala Ile Arg

20 25 30

Tyr Ala Gly Ala Val Glu Arg Leu Ile Asn Ile Gly His Thr Val

35 40 45

Ile Asp Asp Gly Asp Ile Tyr Ile Asp His Ser Lys Lys Glu Ser

50 55 60

Ser Thr Asn Ser Ala Leu Arg Asn Leu Glu Ala Val Ile Glu Ala

65 70 75

Asn Thr Lys Leu Ala Gln Lys Val His Glu Ile Val Glu Lys Gly

80 85 90

Arg Phe Pro Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Ile Ala Ile Gly

95 100 105

Thr Leu Ala Gly Ile Ser Asp His Tyr Glu Asn Leu Gly Val Ile

110 115 120

Trp Tyr Asp Ala His Ala Asp MET Asn Thr Ser Glu Thr Ser Pro

125 130 135

Ser Gly Asn Ile His Gly MET Pro Leu Ala Val Ser MET Gly Ile

140 145 150

Gly Asp Glu Gly Leu Val Asn Ile Lys Gly Tyr Ala Pro Lys Val

155 160 165

Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Ile Gly Ala Arg Ser Ile Asp Gln

170 175 180

Gly Glu Lys Gln Leu Ile Arg Glu Lys Gly Ile Lys Val Tyr Ser

185 190 195

MET His Glu Ile Asp Arg Leu Gly MET Thr Asp Val Ile Gln Asp

200 205 210

Ala Ile Ile Tyr Leu Lys Gly Gln Asn Val Asp Gly Val His Leu

215 220 225

Ser Leu Asp Leu Asp Gly Ile Asp Pro Ile Tyr Thr Pro Gly Val

230 235 240

Gly Thr Pro Val Pro Gly Gly Ile Thr Tyr Arg Glu Ser His Leu

245 250 255

Ala MET Glu MET Leu Gln Glu Ser Gly Leu Val Thr Ser Ala Glu

260 265 270

Phe Val Glu Val Asn Pro Ile Leu Asp Glu Arg Asn Lys Thr Ala

275 280 285

Asp Val Ala Val Ala Leu MET Gly Ser Leu Phe Gly Glu Thr Leu

290 295 300

Val ***

301

SEQ ID NO：3

atgggtccaa gtgcaattcg ctatgctggc gcggttgaac gtttaataaa tattggtcat 60

acagtaatag atgatgggga tatctatatt gaccattcaa aaaaagaaag ttctacaaat 120

tcagcattaa gaaatttaga ggcagttatt gaagcaaata ctaagttagc tcaaaaagtt 180

catgaaatag tagagaaagg aagattccct ttagtactgg gtggtgatca tagtattgcg 240

ataggtacgt tagctggaat ttcagatcac tacgaaaatc taggtgttat ttggtatgat 300

gctcatgcag atatgaatac aagtgaaaca tcaccctcag gaaatattca tggcatgcca 360

ttagctgtta gcatgggtat tggtgatgaa ggtttggtaa atattaaagg atatgcgcct 420

aaagtaaaac ctg 433

SEQ ID NO：4

tttacctgta agtgattaga attgatccct tggtttctat ttcttattta gtaagtaaaa 60

taatctcttt cttacttctt ttgtataaaa agggttagtc atgttaaaag aatttagaat 120

tgaataaaaa tacagaaaaa tgataagttg agccatgagt attcctgccg ttacaataga 180

attagctgac aaagggggta tcaattcatg gaatcattaa aaatatcaat gattggggtt 240

cctatggata tggggcagtt acgcagaggt gttgatatgg gtccaagtgc aattcgctat 300

gctggcgcgg ttgaacgttt aataaatatt ggtcatacag taatagatga tggggatatc 360

tatattgacc attcaaaaaa agaaagttct acaaattcag cattaagaaa tttagaggca 420

gttattgaag caaatactaa gttagctcaa aaagttcatg aaatagtaga gaaaggaaga 480

ttccctttag tactgggtgg tgatcatagt attgcgatag gtacgttagc tggaatttca 540

gatcactacg aaaatctagg tgttatttgg tatgatgctc atgcagatat gaatacaagt 600

gaaacatcac cctcaggaaa tattcatggc atgccattag ctgttagcat gggtattggt 660

gatgaaggtt tggtaaatat taaaggatat gcgcctaaag taaaacctga gaatattgtt 720

attatcggtg cacgttctat tgatcagggt gagaagcaat taattcgtga aaaaggtata 780

aaagtatatt caatgcatga aattgatcgt ctaggcatga ctgatgttat acaagatgca 840

attatttatt taaaaggtca aaatgtagat ggcgttcatt tatctctaga tttagatggc 900

attgatccga tatatactcc aggagtagga acaccagtgc caggtggaat aacatacaga 960

gaaagtcatc tagccatgga aatgttgcaa gaatcaggtt tagttacatc tgcagaattt 1020

gtagaagtca atccaatact tgatgaaaga aataaaacag ctgacgtagc agttgcttta 1080

atgggttcat tatttggtga gactttagtt taaaaagaat gagcggtttc cctgttttat 1140

atctccgact gtagataaac tcgaagaaaa tagagtttat ctacagtttt tttctttaaa 1200

agatataaat aagaaaggtg attatagcta tgatagatac tttttgcgcg cagtgtttat 1260

taattctccg gtagccttaa tcaggtgata cataattatt tcaattatga tgaagtattt 1320

tctcttttaa tctatttttt tatattttac atgaatgtgt ataaaatgat aaaagttgta 1380

aggcaaaatt ggtataataa atataatatc ataatttaaa aaat 1424