本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種優(yōu)良生物力學(xué)三維細(xì)胞培養(yǎng)組織工程支架及制備方法，尤其涉及一種能高效培養(yǎng)心肌細(xì)胞和促進(jìn)心肌干細(xì)胞分化的、具有優(yōu)良生物力學(xué)性能的三維組織工程支架。

背景技術(shù)：

隨著冠心病及先天性心臟病對(duì)人類威脅日益加重，受損心肌的替代治療已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域急需解決的難題之一。對(duì)于該類疾病，普通的藥物治療已經(jīng)難以發(fā)揮功效，最具潛力的治療方法是進(jìn)行移植，而其中的難題為細(xì)胞培養(yǎng)和體外組織構(gòu)建。

目前，進(jìn)行體外組織構(gòu)建大多采用先從組織分離細(xì)胞再在體外進(jìn)行大量擴(kuò)增，然后接種至組織工程支架上形成工程化組織的方法。其中，組織工程的優(yōu)劣直接影響細(xì)胞培養(yǎng)和組織形成的好壞。

一般而言，二維組織工程支架已經(jīng)得到了較為充分的研究。二維組織工程支架主要研究是是材料性質(zhì)和材料表面特性對(duì)細(xì)胞功能的影響，在此基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)細(xì)胞功能的行使對(duì)材料的要求。然而，由于實(shí)際上細(xì)胞的生長(zhǎng)是處于三維環(huán)境的，二維組織工程支架的研究成果并不能一定應(yīng)用于實(shí)際的細(xì)胞培養(yǎng)中。

近些年來，隨著相應(yīng)疾病的不斷發(fā)展，對(duì)三維細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)研究的要求變得越來越迫切。能否成功的進(jìn)行三維細(xì)胞培養(yǎng)，無論對(duì)于藥物的研發(fā)和相應(yīng)的細(xì)胞和組織移植都至關(guān)重要。

目前，對(duì)于心肌細(xì)胞的三維培養(yǎng)所用的組織工程支架，大多為凝膠材料，其物理性能差、使用時(shí)間短且內(nèi)部孔洞結(jié)構(gòu)不適于細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能的行使。對(duì)于能促進(jìn)心肌干細(xì)胞分化的三維組織工程支架更是鳳毛麟角。而選擇何種材料以及進(jìn)行何種處理方式可以適合何種干細(xì)胞的分化培養(yǎng)，學(xué)界尚未形成定論，相關(guān)研究人員仍在進(jìn)行大量的試錯(cuò)實(shí)驗(yàn)并偶爾獲得正確發(fā)現(xiàn)。其中，中國(guó)專利200810227671.6便發(fā)現(xiàn)了PLGA能支持ADSCs向肝細(xì)胞分化。

在制備組織工程支架中，支架的力學(xué)性能是重要的，其力學(xué)性能需與相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)際環(huán)境相匹配。

由于限制于生物相容性等問題，目前可供制備組織工程支架的材料較少，很多材料需要進(jìn)行表面改性或者與其它材料進(jìn)行嵌段聚合才能滿足特定細(xì)胞的培養(yǎng)。然而，這些方法的成本十分高昂，且難以量產(chǎn)，其產(chǎn)業(yè)化前景較差。

目前，在心肌細(xì)胞培養(yǎng)的組織工程支架制備方面，最新的研究成果之一為“Indirect three-dimensional printing:A method for fabricating polyurethane-urea based cardiac scaffolds”。該支架機(jī)械性能較好且適于心肌細(xì)胞培養(yǎng)。然而遺憾的是，該材料同樣需要將聚氨酯與尿素聚合，且用的是3D打印技術(shù)，這兩點(diǎn)使得剛方法在當(dāng)下是不具備產(chǎn)業(yè)化能力的。更重要的是，該研究并未涉及心肌干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化問題。這這一點(diǎn)在相關(guān)心臟疾病，特別是心梗中治療問題中，是尤為重要的。

因此，本領(lǐng)域亟需一種原料易得、制備方法成熟簡(jiǎn)單、力學(xué)性能好、適于心肌細(xì)胞培養(yǎng)和促進(jìn)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化的組織工程支架。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明實(shí)際需要解決的技術(shù)問題為：提供一種原料易得、制備方法成熟簡(jiǎn)單、力學(xué)性能好、適于心肌細(xì)胞培養(yǎng)和促進(jìn)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化的組織工程支架及其制備方法。

針對(duì)所述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種可解決上述問題的組織工程支架的制備方法，該方法包括如下步驟：

(1)按重量比36-38:51-52.5:10.5-12的比例，將PLGA、聚氨酯和聚苯乙烯溶于二甲基亞砜、N，N’-二甲基甲酰胺和四氫呋喃的混合溶劑中，獲得溶質(zhì)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為15％的聚合物溶液；其中，二甲基亞砜、N，N’-二甲基甲酰胺和四氫呋喃的體積比為4-6:3:1；所述聚苯乙烯的分子量為400kDa，所述聚氨酯的分子量為100kDa，所述PLAG的分子量為140kDa

(2)進(jìn)行靜電紡絲：將步驟(1)所得溶液置于注射器中，設(shè)定流速為1.5ml/h，電壓為20KV；利用轉(zhuǎn)筒作為接收板，轉(zhuǎn)筒外徑為30-40cm，轉(zhuǎn)筒上橫桿的間距為5cm，橫桿的直徑為1cm，轉(zhuǎn)筒的轉(zhuǎn)速為60-70rpm；注射劑針頭至轉(zhuǎn)筒的距離為12cm；

(3)待膜的厚度為1-3mm時(shí)，停止收集；室溫下，將所得膜進(jìn)行真空干燥2天以上，除去殘留溶劑，即得所述組織工程支架。

優(yōu)選的，所述PLGA、聚氨酯和聚苯乙烯的重量百分比為37:52:11。

優(yōu)選的，所述二甲基亞砜、N，N’-二甲基甲酰胺和四氫呋喃的體積比為5:3:1。

優(yōu)選的，步驟(2)中，所述轉(zhuǎn)筒的外徑為35cm。

優(yōu)選的，步驟(2)中，所述轉(zhuǎn)筒的轉(zhuǎn)速為65rpm。

優(yōu)選的，在步驟(2)進(jìn)行靜電紡絲時(shí)，環(huán)境溫度為22℃。

優(yōu)選的，步驟(3)中，膜的厚度為2mm。

步驟(3)中，除去殘留溶劑后，還需進(jìn)行滅菌處理。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供由上述方法制備得到的組織工程支架。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明所得組織工程支架具有良好的力學(xué)性能，適于心肌細(xì)胞的培養(yǎng)并且能促進(jìn)心肌干細(xì)胞的分化；

2、本發(fā)明所用的原料易得，無需進(jìn)行表面改性或者與其它材料進(jìn)行聚合；

3、本發(fā)明的制備工藝為成熟的靜電紡絲工藝，工藝成熟，實(shí)際應(yīng)用前景大。

具體實(shí)施方式

下面給出實(shí)施例以對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。有必要在此指出的是以下實(shí)施例不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，如果該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述本發(fā)明內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。

下列實(shí)施例中所用到的聚苯乙烯的分子量為400kDa，聚氨酯的分子量為100kDa，PLAG的分子量為140kDa。

實(shí)施例1

(1)按重量比37:52:11的比例，將PLGA、聚氨酯和聚苯乙烯溶于二甲基亞砜、N，N’-二甲基甲酰胺和四氫呋喃的混合溶劑中，獲得溶質(zhì)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為15％的聚合物溶液；其中，二甲基亞砜、N，N’-二甲基甲酰胺和四氫呋喃的體積比為4:3:1；

(2)進(jìn)行靜電紡絲：將步驟(1)所得溶液置于注射器中，設(shè)定流速為1.5ml/h，電壓為20KV；利用轉(zhuǎn)筒作為接收板，轉(zhuǎn)筒外徑為35cm，轉(zhuǎn)筒上橫桿的間距為5cm，橫桿的直徑為1cm，轉(zhuǎn)筒的轉(zhuǎn)速為65rpm；注射劑針頭至轉(zhuǎn)筒的距離為12cm；電紡時(shí)，溫度為20℃；

(3)待膜的厚度為2mm時(shí)，停止收集；室溫下，將所得膜進(jìn)行真空干燥2天以上，除去殘留溶劑，進(jìn)行滅菌后，即得組織工程支架。

實(shí)施例2

(1)按重量百分比38:52.5:12的比例，將PLGA、聚氨酯和聚苯乙烯溶于二甲基亞砜、N，N’-二甲基甲酰胺和四氫呋喃的混合溶劑中，獲得溶質(zhì)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為15％的聚合物溶液；其中，二甲基亞砜、N，N’-二甲基甲酰胺和四氫呋喃的體積比為6:3:1；

(2)進(jìn)行靜電紡絲：將步驟(1)所得溶液置于注射器中，設(shè)定流速為1.5ml/h，電壓為20KV；利用轉(zhuǎn)筒作為接收板，轉(zhuǎn)筒外徑為40cm，轉(zhuǎn)筒上橫桿的間距為5cm，橫桿的直徑為1cm，轉(zhuǎn)筒的轉(zhuǎn)速為70rpm；注射劑針頭至轉(zhuǎn)筒的距離為12cm；電紡時(shí)，溫度為20℃；

(3)待膜的厚度為1mm時(shí)，停止收集；室溫下，將所得膜進(jìn)行真空干燥2天以上，除去殘留溶劑，進(jìn)行滅菌，即得組織工程支架。

實(shí)施例3

(1)按重量百分比36:51:10.5的比例，將PLGA、聚氨酯和聚苯乙烯溶于二甲基亞砜、N，N’-二甲基甲酰胺和四氫呋喃的混合溶劑中，獲得溶質(zhì)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為15％的聚合物溶液；其中，二甲基亞砜、N，N’-二甲基甲酰胺和四氫呋喃的體積比為5:3:1；

(2)進(jìn)行靜電紡絲：將步驟(1)所得溶液置于注射器中，設(shè)定流速為1.5ml/h，電壓為20KV；利用轉(zhuǎn)筒作為接收板，轉(zhuǎn)筒外徑為30cm，轉(zhuǎn)筒上橫桿的間距為5cm，橫桿的直徑為1cm，轉(zhuǎn)筒的轉(zhuǎn)速為60rpm；注射劑針頭至轉(zhuǎn)筒的距離為12cm；電紡時(shí)，溫度我25℃；

(3)待膜的厚度為3mm時(shí)，停止收集；室溫下，將所得膜進(jìn)行真空干燥2天以上，除去殘留溶劑，進(jìn)行滅菌后，即得組織工程支架。

對(duì)比實(shí)施例1

除PLGA、聚氨酯和聚苯乙烯的重量比為30:60:10之外，其余與實(shí)施例1一致。

對(duì)比實(shí)施例2

除不添加聚苯乙烯之外，其余與實(shí)施例1一致。

對(duì)比實(shí)施例3

除不添加PLGA之外，其余與實(shí)施例1一致。

實(shí)驗(yàn)例1力學(xué)性能檢測(cè)

對(duì)實(shí)施例1-3和對(duì)比實(shí)施例1-3所得組織工程支架進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試，測(cè)試內(nèi)容為干燥狀態(tài)下和浸濕狀態(tài)(浸沒于PBS緩沖液48小時(shí)后)下支架的彈性模量和壓縮模量。結(jié)果如表1和表2所示。

表1干燥狀態(tài)下支架壓縮模量和彈性模量結(jié)果

表2浸濕狀態(tài)下支架壓縮模量結(jié)果

實(shí)驗(yàn)例2細(xì)胞存活率檢測(cè)

利用Presto Blue檢測(cè)法考察實(shí)施例1-3和對(duì)比實(shí)施例1-3支架對(duì)心肌細(xì)胞活率的影響，以標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)板為對(duì)照組。活率的計(jì)算以將培養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)板的心肌細(xì)胞存活情況為基數(shù)(100％)。結(jié)果如表3所示。

表3

實(shí)驗(yàn)例3

1、心肌干細(xì)胞的分離提?。?/p>

(1)取1只小鼠心臟置于培養(yǎng)皿中，眼科剪小心剪去心臟周邊組織，0.01mol/L的PBS沖洗2次，洗去血細(xì)胞；

(2)心臟標(biāo)本置于Eppendorf離心管中，加入1.5mol/L的PBS，眼科剪反復(fù)剪切，剪切為l mm³大小的組織塊，吸管反復(fù)吹打分散組織；

(3)吸棄上清，去除血清、紅細(xì)胞；

(4)將1mm³大小的組織塊置入離心管中，1500rpm×5min離心，0.01mol/L的PBS沖洗2次；

(5)洗滌后的心肌組織塊置入25cm²培養(yǎng)瓶中，加入0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA(二者1:1混合)和等量0.1％膠原酶二種消化液鋪滿瓶底，37℃、5％CO₂飽和濕度CO₂孵箱中消化15min，肉眼觀察組織松散，立即加入等量含10％FBS的培養(yǎng)液終止消化，收集組織及細(xì)胞至離心管，150rpm×5min離心。

(6)去上清，1500rpm×5min離心，0.01mol/L的PBS洗滌組織塊及細(xì)胞2次；

(7)收集組織塊及懸浮細(xì)胞接種于25cm²培養(yǎng)瓶，加入5ml培養(yǎng)液，37℃、5％CO₂飽和濕度CO₂孵箱中孵育。

2、干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞測(cè)試：

對(duì)實(shí)施例1-3和對(duì)比實(shí)施例1-3進(jìn)行細(xì)胞增殖測(cè)試。細(xì)胞數(shù)量在培養(yǎng)第2、3、4、5天，相對(duì)于初始細(xì)胞數(shù)目而言增加的倍數(shù)如表4所示。

表4

在培養(yǎng)第7天時(shí)，具有收縮性的心肌細(xì)胞占總細(xì)胞的比例如表5所示。

表5

在培養(yǎng)第7天和第30天時(shí)，所得具有收縮性的心肌細(xì)胞的收縮頻率如表6所示。

表6