本發(fā)明涉及魚類育種和分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用熒光微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定倒刺鲃家系的方法。

背景技術(shù)：

倒刺鲃(Spinibarbus denticulatus denticulatus)，隸屬鯉形目(Cyprinfomres)、鯉科(Cyprindae)、鲃亞科(Barbinae)、倒刺鲃屬(Spinibarbus)，俗稱青竹鯉，主要分布于我國(guó)珠江水系的北江、西江和東江的中上游，以及海南島的昌化江、南渡江，是珠江水系優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)魚類。因其生長(zhǎng)快、體型大、食性雜、肉質(zhì)好、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，是一個(gè)很有推廣前途的養(yǎng)殖品種。

目前倒刺鲃繁殖親本主要來自野生或培養(yǎng)數(shù)代的種群，沒有經(jīng)過人工選育，導(dǎo)致苗種種質(zhì)退化加劇。常規(guī)苗種生長(zhǎng)速度緩慢，其生長(zhǎng)速度、抗病能力和其他養(yǎng)殖性能等還未達(dá)到良種化的程度，以及普遍存在近親繁殖的現(xiàn)象，病害爆發(fā)等問題日益凸顯；同時(shí)也在一定程度上影響倒刺鲃在更大范圍內(nèi)的推廣。因此，盡快開展倒刺鲃良種選育工作加強(qiáng)倒刺鲃種質(zhì)資源檢測(cè)和評(píng)估，選育出生長(zhǎng)快、抗逆性好的優(yōu)良品種，對(duì)于倒刺鲃種群保護(hù)和滿足集約化養(yǎng)殖業(yè)的迫切需要具有重要的意義。

家系選育是獲得優(yōu)良品種的重要手段。家系選育過程中，保持完整、準(zhǔn)確的系譜信息可以有效指導(dǎo)親本選育，從而避免近交衰退現(xiàn)象。傳統(tǒng)的水產(chǎn)動(dòng)物選擇育種中，通常是將不同的家系分養(yǎng)在不同的分養(yǎng)池中以維持家系信息。這種方法由于不同分養(yǎng)池間的環(huán)境因子存在差異等，這可能會(huì)導(dǎo)致育種相關(guān)的遺傳參數(shù)估計(jì)產(chǎn)生偏差，不利于育種計(jì)劃的制定。

在混合養(yǎng)殖群體中，通常是通過物理標(biāo)記如：剪鰭、烙印、掛牌、熒光染料等保持家系信息，但這些物理標(biāo)記同樣存在諸多問題，使用物理標(biāo)記存在操作繁瑣、易損傷魚體、標(biāo)記存在時(shí)間不長(zhǎng)及不易于在仔、稚魚上進(jìn)行標(biāo)記等缺點(diǎn)。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記的出現(xiàn)使得混養(yǎng)親緣關(guān)系的鑒定成為可能，以微衛(wèi)星分型為基礎(chǔ)的親子鑒定技術(shù)是目前水產(chǎn)動(dòng)物系譜確認(rèn)中應(yīng)用最廣泛最可靠的手段之一。

微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性高、共顯性遺傳等特點(diǎn)，為水產(chǎn)動(dòng)物選育中保持家系信息、確認(rèn)親緣關(guān)系、追蹤系譜提供了有用的工具。目前已在草魚、黃顙魚、大鱗鲆和凡納濱對(duì)蝦等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中證實(shí)了微衛(wèi)星在水產(chǎn)動(dòng)物中家系鑒定的可行性及應(yīng)用價(jià)值。目前尚未見微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于倒刺鲃家系鑒定的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種倒刺鲃微衛(wèi)星家系鑒定方法，應(yīng)用于倒刺鲃?dòng)H子鑒定、種質(zhì)管理、家系管理和評(píng)價(jià)增殖放流效果等。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種倒刺鲃微衛(wèi)星家系鑒定方法，包括以下步驟：

(1)將來自自然群體的倒刺鲃?dòng)H本進(jìn)行人工繁育，得到2個(gè)家系，待魚苗孵化出三個(gè)月后分別取30尾以上的魚苗作為親子鑒定的家系群體；

(2)隨機(jī)選取步驟(1)中親本和子代群體的魚苗，以它們的鰭條組織提取基因組DNA；

(3)設(shè)計(jì)并合成一系列倒刺鲃微衛(wèi)星引物序列，并對(duì)步驟(2)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性高、雜合度高的引物；共篩選出以下9對(duì)倒刺鲃微衛(wèi)星引物：SPMi1、SPMi7、SPMi15、SPMi18、SPMi23、SPMi24、SPMi31、SPMi33、SPMi36；

SPMi1的序列分別如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示；

SPMi7的序列分別如SEQ.ID.NO.7和SEQ.ID.NO.8所示；

SPMi15的序列分別如SEQ.ID.NO.13和SEQ.ID.NO.14所示；

SPMi18的序列分別如SEQ.ID.NO.9和SEQ.ID.NO.10所示；

SPMi23的序列分別如SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示；

SPMi24的序列分別如SEQ.ID.NO.11和SEQ.ID.NO.12所示；

SPMi31的序列分別如SEQ.ID.NO.15和SEQ.ID.NO.16所示；

SPMi33的序列分別如SEQ.ID.NO.17和SEQ.ID.NO.18所示；

SPMi36的序列分別如SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.6所示；

(4)將步驟(3)篩得的9對(duì)倒刺鲃微衛(wèi)星引物組合成3個(gè)多重PCR體系，多重PCR體系1包括SPMi1、SPMi23、SPMi36；多重PCR體系2包括SPMi7、SPMi18、SPMi24；多重PCR體系3包括SPMi15、SPMi31、SPMi33，其中每一對(duì)引物的正向引物的5’端標(biāo)記上熒光標(biāo)記；然后用3個(gè)多重PCR體系分別對(duì)步驟(2)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到多重PCR產(chǎn)物；

所述引物SPMi1、SPMi7、SPMi15、SPMi18、SPMi23、SPMi24、SPMi31、SPMi33、SPMi36的正向引物5’端標(biāo)記的熒光標(biāo)記分別是TAMRA、HEX、HEX、FAM、FAM、TAMRA、TAMRA、FAM、HEX；

多重PCR體系1的總體積20μl，包括基因組DNA20ng，PCR Mix10μl，SPMi1正反引物各0.2μl，SPM23、SPMi36正反引物各0.4μl，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至20μl，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸40s，共28個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，最后4℃保存；

多重PCR體系2的總體積20μl，包括基因組DNA20ng，PCR Mix10μl，SPMi7、SPMi18正反引物各0.2μl，SPMi24正反引物各0.4μl，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至20μl，PCR反應(yīng)條件與多重體系1的完全相同；

多重PCR體系3除引物之外的PCR體系和反應(yīng)條件與多重PCR體系1的完全相同；

(5)將3組多重PCR產(chǎn)物在ABI3730xl分析儀上進(jìn)行基因分型，讀取個(gè)體等位基因大小，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)待測(cè)個(gè)體與親本基因型之間的相關(guān)性，確定待測(cè)個(gè)體與哪個(gè)親本具有親子關(guān)系；

所述的對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析是用軟件CERVUS3.0進(jìn)行分析。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

1、本發(fā)明利用微衛(wèi)星標(biāo)記與多重?zé)晒釶CR技術(shù)結(jié)合，篩選了9個(gè)高度多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，組建3個(gè)多重?zé)晒釶CR體系，通過ABI3730xl分析儀分型，利用CERVUS3.0軟件對(duì)倒刺鲃家系進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親子關(guān)系分析。

2、本發(fā)明一次PCR反應(yīng)可以檢測(cè)3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，效率較之以前提高了三倍，費(fèi)用下降為原來的三分之一左右。

3、本發(fā)明通過毛細(xì)管電泳利用測(cè)序儀分型，克服了利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分型中等位基因大小判讀誤差的問題，大大提高了基因型數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

4、本發(fā)明方法的建立為倒刺鲃的家系管理、種質(zhì)管理和增殖放流效果評(píng)估提供了一種新的技術(shù)手段。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例

一種倒刺鲃微衛(wèi)星家系鑒定方法，包括以下步驟：

1)倒刺鲃家系的構(gòu)建

從倒刺鲃自然群體(北江韶關(guān)段)中挑選優(yōu)良父母本，通過注射激素的方法進(jìn)行人工催產(chǎn)。通過1雄配1雌的方法構(gòu)建了兩個(gè)倒刺鲃全同胞家系。剪取繁殖親本的臀鰭鰭條40mg左右，儲(chǔ)存在95％的酒精內(nèi)，保存于-20℃。將不同家系分養(yǎng)在不同分養(yǎng)池中，待喂養(yǎng)三個(gè)月后，每個(gè)家系隨機(jī)選取30尾子代，剪取倒刺鲃40mg左右尾鰭組織，儲(chǔ)存在95％的酒精內(nèi)，保存于-20℃。

2)倒刺鲃?dòng)H本和子代基因組DNA提取

利用上海生工生物工程公司的“Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒”提取倒刺鲃?dòng)H本和子代基因組DNA。用NanoDrop-1000紫外分光光度儀檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量，檢測(cè)后將DNA樣品稀釋至20ng/μl。

3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選

設(shè)計(jì)并合成系列引物，并分別對(duì)10個(gè)倒刺鲃個(gè)體(以步驟(2)的基因組DNA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性高、雜合度高的引物；

共篩選出9對(duì)倒刺鲃微衛(wèi)星引物：SPMi1、SPMi7、SPMi15、SPMi18、SPMi23、SPMi24、SPMi31、SPMi33、SPMi36。

4)倒刺鲃微衛(wèi)星多重PCR條件的優(yōu)化和擴(kuò)增

將上述篩選出來的9對(duì)引物，組合成3個(gè)多重PCR，多重PCR體系1包括引物SPMi1、SPMi23、SPMi36；多重PCR體系2包括引物SPMi7、SPMi18、SPMi24；多重PCR體系3包括引物SPMi15、SPMi31、SPMi33，其中每一對(duì)引物的正向引物的5’端標(biāo)記上熒光標(biāo)記；SPMi1、SPMi7、SPMi15、SPMi18、SPMi23、SPMi24、SPMi31、SPMi33、SPMi36的熒光標(biāo)記分別是：TAMRA、HEX、HEX、FAM、FAM、TAMRA、TAMRA、FAM、HEX，見表1。

然后用3個(gè)多重PCR體系分別對(duì)步驟(2)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到多重PCR產(chǎn)物；

表1 倒刺鲃3個(gè)多重?zé)晒釶CR體系的引物序列及熒光標(biāo)記

注：F表示正向引物，R表示反向引物，熒光標(biāo)記均標(biāo)記在正向引物的5’端。

多重PCR體系1的總體積為20μl，包括基因組DNA20ng，PCR Mix10μl，SPMi1正反引物各0.2μl，SPM23、SPMi36正反引物各0.4μl，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至20μl，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸40s，共28個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，最后4℃保存。

多重PCR體系2的總體積為20μl，包括基因組DNA20ng，PCR Mix10μl，SPMi7、SPMi18正反引物各0.2μl，SPMi24正反引物各0.4μl，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至20μl，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸40s，共28個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，最后4℃保存。

多重PCR體系3的總體積為20μl，包括基因組DNA20ng，PCR Mix10μl，SPMi15正反引物各0.2μl，SPM31、SPMi33正反引物各0.4μl，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至20μl，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸40s，共28個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，最后4℃保存。

表2 倒刺鲃?dòng)H子鑒定的多重微衛(wèi)星熒光標(biāo)記PCR反應(yīng)體系

5)微衛(wèi)星位點(diǎn)基因分型及親子鑒定

將上步驟獲得的三組PCR樣品分別利用ABI3730xl分析儀進(jìn)行微衛(wèi)星分型，LIZ500熒光分子作為內(nèi)標(biāo)。利用GeneMapper V1.75軟件對(duì)微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取，結(jié)合人工加以校正，排成數(shù)字基因型矩陣。

采用CERVUS 3.0對(duì)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行等位基因頻率分析包括各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率、觀測(cè)雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量、Hardy-Weinberg平衡及無效等位基因頻率，接著進(jìn)行模擬分析以及親子鑒定分析。通過似然率(LOD)檢驗(yàn)待測(cè)個(gè)體與親本基因型之間的關(guān)聯(lián)性，并在95％置信水平下，確定待測(cè)個(gè)體與哪個(gè)親本具有親子關(guān)系。

6)結(jié)果

利用9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)58尾子代和4尾親本進(jìn)行擴(kuò)增和基因分型，基因型應(yīng)用CERVUS 3.0軟件分析結(jié)果如表3。為保證鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，根據(jù)LOD值鑒定候選父母本時(shí)，只有比家系記錄數(shù)據(jù)一致，并且LOD大于0的才確認(rèn)親子關(guān)系。最終確認(rèn)了57尾子代，鑒定準(zhǔn)確率為98.3％。以上結(jié)果表明，利用本發(fā)明的微衛(wèi)星多重?zé)晒釶CR方法能高效快捷實(shí)現(xiàn)倒刺鲃家系的親子鑒定分析、種質(zhì)管理和增殖放流效果評(píng)估的要求。

表3 9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在倒刺鲃家系中的檢測(cè)參數(shù)

注：Na為等位基因數(shù)目；Ho為觀測(cè)雜合度；He為期望雜合度；PIC為多態(tài)信息含量；HW為哈溫

平衡；Fn為無效等位基因頻率；ns表示不顯著，*表示P<0.01，經(jīng)Bonferroni校正。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。