本發(fā)明為一種添加過氧化氫脅迫節(jié)桿菌Arthrobacter sp. LHM 7719發(fā)酵產(chǎn)過氧化氫酶的方法。通過研究過氧化氫對Arthrobacter sp. LHM 7719產(chǎn)酶的脅迫影響，達到過氧化氫酶高產(chǎn)的目的，屬于微生物發(fā)酵產(chǎn)酶技術領域。
背景技術：
過氧化氫(H2O2)，俗稱雙氧水，是一種強氧化劑，主要應用于化學品合成、紙漿漂白、印染、冶金、半導體材料處理以及食品的生產(chǎn)和加工。在2006年，全世界消耗過氧化氫的量已接近220萬噸；但過氧化氫在紡織和造紙行的殘留會極大地影響印染效果；沒有及時除去過氧化氫工業(yè)廢水，會引起外環(huán)境污染。過氧化氫酶(CAT)可以將紡織漂洗工藝殘留的過氧化氫催化分解為無毒的水和氧氣，不影響下游的印染工藝,該反應不需要在高溫高壓的條件就能有效進行，避免了大量能源的消耗。CAT能夠有效地清除食品工業(yè)中殘余的H2O2,從而避免食品風味的破壞，并且該酶本身沒有毒性。另在工業(yè)廢水的處理中，添加了CAT的H2O2，對芳環(huán)化合物和脂族化合物的降解具有促進作用。因此極大的刺激了過氧化氫酶生產(chǎn)的研究。
目前國內(nèi)外過氧化氫酶市場需求量日益增加，然而微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶量較低從而導致成本較高仍然是當今人們在進行過氧化氫酶工業(yè)化生產(chǎn)過程中亟待解決的主要問題；本申請人已經(jīng)獲得授權的發(fā)明專利“ZL201310505522.2一種堿性過氧化氫酶高產(chǎn)菌及該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)工藝”。該菌株(Arthrobacter sp. LHM7719)所生產(chǎn)的過氧化氫酶不僅具有產(chǎn)量高、耐堿等優(yōu)點，而且所生產(chǎn)過程中所需要的主要原料為非糧食農(nóng)產(chǎn)品，廉價易得且環(huán)保。采用一定濃度的H2O2添加脅迫Arthrobacter sp. LHM7719可以明顯地提升該菌株發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶的潛力，進一步地降低了過氧化氫酶的生產(chǎn)成本。所添加的H2O2價格低廉，整個操作簡便，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明研究出菌體對數(shù)中后期以后在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加0.4%(v/v)～0.9%(v/v)過氧化氫作為誘導劑后，脅迫菌體產(chǎn)生過氧化氫酶，經(jīng)過深層發(fā)酵，可明顯提高過氧化氫酶的活力達1.15倍左右，相當于增加過氧化氫酶15%左右，且適用于工業(yè)化。
本發(fā)明的技術方案：以已經(jīng)獲批授權發(fā)明專利“ZL201310505522.2一種堿性過氧化氫酶高產(chǎn)菌及該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)工藝”的一株高產(chǎn)過氧化氫酶的Arthrobactersp. LHM 7719為生產(chǎn)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加0.4%(v/v)～0.9%(v/v)過氧化氫作為誘導劑后，脅迫菌體產(chǎn)生過氧化氫酶，經(jīng)過深層發(fā)酵，可明顯提高過氧化氫酶的產(chǎn)量，且適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
一種添加過氧化氫脅迫節(jié)桿菌發(fā)酵產(chǎn)過氧化氫酶的方法，按照下述步驟進行：
（1）種子培養(yǎng)基：
從斜面上挑取單菌落，劃線于LB平板培養(yǎng)基，將平板倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，再從平板上刮取一環(huán)菌種，接種到含有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：pH 7.2，培養(yǎng)時間16小時，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，即發(fā)酵種子液；
其中LB平板培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂25g/L,pH 7.2,121℃滅菌30min，冷卻。
其中種子培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基，其組成為：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化鈉5g/L，pH 7.2，121℃滅菌30min，冷卻。
（2）發(fā)酵產(chǎn)酶
以體積比3.5%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接種到含5L產(chǎn)酶培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐進行發(fā)酵產(chǎn)酶；發(fā)酵條件：pH為7.0～8.0，培養(yǎng)溫度為30～40℃，發(fā)酵時間為35～55小時，轉(zhuǎn)速350～500r/min，通氣量1.2L/min～1.7L/min；
發(fā)酵過程中過氧化氫的添加方式為：在發(fā)酵開始后18小時，22小時，26小時，30小時，34小時，38小時分批添加培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中的過氧化氫的體積濃度為0.4%～0.6%；42小時至52小時恒速流加過氧化氫，使得這一段時間培養(yǎng)基中過氧化氫的體積濃度維持在0.6%～0.9%區(qū)間的某一定值處；
其中產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為：木薯淀粉15～20g/L，豆粕粉50～70g/L，磷酸二氫鉀 0.5g/L，消泡劑0.2～0.5g/L，121℃滅菌20min，冷卻。
（3）過氧化氫酶提取
取2.5L發(fā)酵液，10000 轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，獲得菌泥，采用高壓進行細胞破碎，破碎機壓力控制在2000bar以上，加入磷酸緩沖液2.5L混勻后，10000 轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清液得到堿性過氧化氫酶。
然后按本篇所介紹的過氧化氫酶活力測定方法測定酶活力，并按照發(fā)酵液等體積計算過氧化氫酶產(chǎn)量（U/mL）；
本發(fā)明酶活的測定方法
反應總體積為3 mL，含0.1ml粗酶液和pH 7.0的1mol/L的K2HPO4-KH2PO4緩沖液2.4mL，新鮮配置的0.12mol/LH2O2溶液0.5mL，以去離子水替代H2O2溶液作為空白對照，以波長240nm體系下吸光度的下降來衡量過氧化氫的酶促降解速度，每隔10s讀取一次吸光度值，一般持續(xù)1min后停止測定，以反應的線性范圍計算酶活U/mL；一個標準酶活單位定義為:在最適溫度下，1 min內(nèi)分解1 μmol H2O2 (消光系數(shù)為39.4L/mol/cm)所需的酶量。
本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明的方法可以明顯地提升該菌株Arthrobacter sp. LHM7719發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶的潛力，進一步地降低了過氧化氫酶的生產(chǎn)成本。所添加的H2O2價格低廉，整個操作簡便，適合工業(yè)化生產(chǎn)，所生產(chǎn)的過氧化氫酶可用于紡織印染行業(yè)、食品工業(yè)、工業(yè)廢水處理、造紙等領域。因此本發(fā)明有廣泛的工業(yè)使用價值和較好的經(jīng)濟效益前景。
具體實施方式
對照實施例1：
從斜面上挑取單菌落，劃線于LB平板培養(yǎng)基，將平板倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，再從平板上刮取一環(huán)菌種，接種到含有40mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：pH 7.2，培養(yǎng)時間16小時，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，再以3.5%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接種到含5L產(chǎn)酶培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐進行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗，整個發(fā)酵過程不添加過氧化氫。發(fā)酵條件：pH為7.2，培養(yǎng)溫度為30℃，發(fā)酵時間為42小時，轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量1.7L/min，最終獲得的發(fā)酵液酶活力達45100U/mL。
其中LB平板培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂25g/L,pH 7.2,121℃滅菌30min，冷卻。
其中種子培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基，其組成為：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化鈉5g/L，pH 7.2，121℃滅菌30min，冷卻。
其中產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為：木薯淀粉15～20g/L，豆粕粉50～70g/L，磷酸二氫鉀 0.5g/L，消泡劑0.2～0.5g/L，121℃滅菌20min，冷卻。
實施例1
從斜面上挑取單菌落，劃線于LB平板培養(yǎng)基，將平板倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，再從平板上刮取一環(huán)菌種，接種到含有40mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：pH 7.2，培養(yǎng)時間16小時，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，再以3.5%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接種到含5L產(chǎn)酶培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐進行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗。產(chǎn)酶發(fā)酵過程中添加H2O2的方式為：在發(fā)酵開始后18小時，22小時，26小時，30小時，34小時，38小時，42小時分批添加培養(yǎng)基中體積濃度為0.55%的過氧化氫。發(fā)酵條件：pH為7.2，培養(yǎng)溫度為30℃，發(fā)酵時間為46小時，轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量1.7L/min，最終獲得的發(fā)酵液酶活力達48230U/mL，酶活力較對照實施例1提高了1.0694倍，相當于過氧化氫酶產(chǎn)量提高了6.94%。其中LB平板培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂25g/L,pH 7.2,121℃滅菌30min，冷卻。
其中種子培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基，其組成為：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化鈉5g/L，pH 7.2，121℃滅菌30min，冷卻。
其中產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為：木薯淀粉15～20g/L，豆粕粉50～70g/L，磷酸二氫鉀 0.5g/L，消泡劑0.2～0.5g/L，121℃滅菌20min，冷卻。
實施例2
從斜面上挑取單菌落，劃線于LB平板培養(yǎng)基，將平板倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，再從平板上刮取一環(huán)菌種，接種到含有40mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：pH 7.2，培養(yǎng)時間16小時，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，再以3.5%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接種到含5L產(chǎn)酶培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐進行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗。產(chǎn)酶發(fā)酵過程中添加H2O2的方式為：發(fā)酵過程中過氧化氫的添加方式為：在發(fā)酵開始后18小時，22小時，26小時，30小時，34小時，38小時分批添加培養(yǎng)基中體積濃度為0.55%的過氧化氫；42小時至52小時恒速流加過氧化氫，使得這一段時間培養(yǎng)基中過氧化氫的體積濃度維持在0.82%。發(fā)酵條件：pH為7.2，培養(yǎng)溫度為30℃，發(fā)酵時間為52小時，轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量1.7L/min，最終獲得的發(fā)酵液酶活力達51870U/mL，酶活力較對照實施例1提高了1.15倍，相當于過氧化氫酶產(chǎn)量提高了15.01%。其中LB平板培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂25g/L,pH 7.2,121℃滅菌30min，冷卻。
其中種子培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基，其組成為：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化鈉5g/L，pH 7.2，121℃滅菌30min，冷卻。
其中產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為：木薯淀粉15～20g/L，豆粕粉50～70g/L，磷酸二氫鉀 0.5g/L，消泡劑0.2～0.5g/L，121℃滅菌20min，冷卻。