本申請(qǐng)是2013年11月25日提交的發(fā)明名稱為“絲狀真菌中多個(gè)基因拷貝的同時(shí)位點(diǎn)特異性整合”、申請(qǐng)?zhí)枮椤?01280025301.9”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。對(duì)序列表的引用本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。該計(jì)算機(jī)可讀形式并入本文以作參考。本發(fā)明涉及使用短暫表達(dá)的重組酶連同合適的駐留(resident)選擇標(biāo)記將多個(gè)拷貝的目標(biāo)多核苷酸同時(shí)位點(diǎn)特異性地整合到真菌宿主細(xì)胞的基因組中的方法。
背景技術(shù)：
：已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量的自然產(chǎn)生的生物體產(chǎn)生有用的多肽產(chǎn)物，例如酶，酶的大規(guī)模生產(chǎn)為研究和商業(yè)用途所需。在鑒定出這樣的多肽產(chǎn)物后，經(jīng)常要致力于開發(fā)具有改進(jìn)的生產(chǎn)率的制造方法。一種廣泛運(yùn)用的基于重組dna技術(shù)的方法是克隆編碼該產(chǎn)物的基因，并將該基因插入到合適的表達(dá)體系中，從而在有益于產(chǎn)物表達(dá)的條件下在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)該產(chǎn)物，該基因或是整合到染色體中，或是作為染色體外的實(shí)體。無(wú)論使用何種生產(chǎn)方法，通常期望提高給定的多肽或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)水平。因此，正在為增加生產(chǎn)而作出努力，例如，通過將編碼該產(chǎn)物的基因插入到強(qiáng)表達(dá)信號(hào)的控制下，增加所轉(zhuǎn)錄的mrna的穩(wěn)定性或通過增加所考慮的生產(chǎn)生物體中該基因的拷貝數(shù)。后一種方法可以通過將該基因插入到多拷貝質(zhì)粒中來(lái)實(shí)現(xiàn)，但是通常多拷貝質(zhì)粒存在在所考慮的宿主細(xì)胞中不穩(wěn)定的傾向，或者通過將多個(gè)拷貝的該基因整合到生產(chǎn)生物體的染色體中來(lái)實(shí)現(xiàn)，該途徑由于構(gòu)建體的穩(wěn)定性趨向于是更高的而通常被認(rèn)為是更具有吸引力的。宿主細(xì)胞的構(gòu)建已被描述過，其中高度表達(dá)的染色體基因由位點(diǎn)特異性重組酶的識(shí)別序列替代，從而可以在隨后通過使用識(shí)別所述序列的重組酶將單個(gè)編碼產(chǎn)物的多核苷酸插入到那個(gè)位點(diǎn)(ep1405908a1；probiogenag)。已經(jīng)公開了在基因組中的已知位置插入dna(o'gorman等,1991science，251:1351-55；baubonis和sauer,1993nucl.,acidsres.,21:2025-29；albert等,1995plantj.,7:649-59)。這些方法利用自由可逆的位點(diǎn)特異性重組體系。這些可逆體系包括以下：來(lái)自噬菌體p1的cre-lox體系(baubonis和sauer，1993，見上文；albert等，1995plantj.,7549-59)，釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)的flp-frt體系(o'gorrnan等，1991，見上文)，zygosaccharonzycesrouxii的r-rs體系(onouchi等，1995mol.gen.genet.247：653-660)，來(lái)自mu噬菌體的改良gin-gix體系(maeser和kahmann，1991mol.gen.genet.，230:170-76)，來(lái)自枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)質(zhì)粒的β-重組酶-six體系(diaz等，1999j.biol.chem.274：6634-6640)以及來(lái)自細(xì)菌轉(zhuǎn)座子tn1000的δ-γ-res體系(schwikardi和dorge，2000ebslet.471：147-150)。cre、flp、r、gin、β-重組酶和δ-γ是重組酶，lox、frt、rs、gix、six和res是各個(gè)重組位點(diǎn)(由sadowslu，1993fasebj.,7:750-67；ow和medberry，1995crit.rev.plantsci.14：239-261綜述)。多重cre/lox重組允許選擇性位點(diǎn)特異性dna靶向酵母基因組中的自然位點(diǎn)和工程化位點(diǎn)(sauer,b.nucleicacidsresearch.1996,vol.24(23):4608-4613)。已經(jīng)顯示使用鏈霉菌屬(streptomyces)噬菌體φc31的衍生物感染具有自然附著位點(diǎn)attb和異位引入的attb位點(diǎn)的宿主細(xì)胞，結(jié)果使該噬菌體整合到兩個(gè)attb位點(diǎn)中(smith等，2004，switchingthepolarityofabacteriophageintegrationsystem.molmicrobiol51(6):1719-1728)。使用mx9噬菌體轉(zhuǎn)化體系，多個(gè)拷貝的基因可以引入到包含多個(gè)被mx9整合酶識(shí)別的附著位點(diǎn)的細(xì)胞中(wo2004/018635a2)。溫帶lactococcal噬菌體tp901-1整合酶和識(shí)別序列是良好表征的(breüner等，(1990)novelorganizationofgenesinvolvedinprophageexcisionidentifiedinthetemperatelactococcalbacteriophagetp901-1.jbacteriol181(23):7291-7297；breüner等，2001.resolvase-likerecombinationperformedbythetp901-1integrase.microbiology147:2051-2063)。以上的位點(diǎn)特異性重組體系具有共同的性質(zhì)，即單一的多肽重組酶催化相同序列或近乎相同序列在兩個(gè)位點(diǎn)間的重組。每個(gè)重組位點(diǎn)由短的不對(duì)稱間隔序列組成，在該短的不對(duì)稱間隔序列處發(fā)生鏈交換，該短的不對(duì)稱間隔序列在兩側(cè)有重組酶結(jié)合的反向重復(fù)序列。間隔序列的不對(duì)稱性對(duì)重組位點(diǎn)提供了一個(gè)方向，并規(guī)定了重組反應(yīng)的結(jié)果。直接或間接定向的順式位點(diǎn)之間的重組分別切除或倒置干預(yù)dna。反式位點(diǎn)之間的重組引起兩個(gè)線性dna分子的相互易位，或者，如果兩個(gè)分子之中有至少一個(gè)是環(huán)形的，則引起共整合。因?yàn)橛芍亟M產(chǎn)生的產(chǎn)物位點(diǎn)自身是隨后重組的底物，所以反應(yīng)是自由可逆的。但是，在實(shí)際中，因?yàn)閮蓚€(gè)重組位點(diǎn)緊密相連的地方的分子內(nèi)相互作用的可能性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不相連位點(diǎn)間的分子內(nèi)相互作用的可能性，所以切除基本上是不可逆的。必然的結(jié)果是插入到基因組重組位點(diǎn)中的dna分子會(huì)很容易地切除掉。已經(jīng)公開了在真核生物的基因組中進(jìn)行dna取代、易位和疊加的方法，在這些方法中多個(gè)基因可以一步步整合(wo02/08409)。通過位點(diǎn)特異性和短暫表達(dá)的整合酶在微生物宿主細(xì)胞中進(jìn)行多個(gè)拷貝的無(wú)啟動(dòng)子開放閱讀框或操縱子的同時(shí)基因組整合(wo2006/042548)早前已經(jīng)在芽孢桿菌(bacillus)宿主中示出。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及將兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的目標(biāo)多核苷酸整合到真菌宿主細(xì)胞的染色體中的方法，該方法通過以下步驟進(jìn)行：(a)提供在其染色體內(nèi)包括至少兩個(gè)整合位點(diǎn)的真菌宿主細(xì)胞，每個(gè)整合位點(diǎn)包括一對(duì)位點(diǎn)特異性重組酶的識(shí)別序列，每對(duì)識(shí)別序列位于駐留(resident)選擇標(biāo)記的兩側(cè)；(b)向所述細(xì)胞中引入核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包括一對(duì)位點(diǎn)特異性重組酶的識(shí)別序列，該識(shí)別序列對(duì)位于目標(biāo)多核苷酸的兩側(cè)；(c)在細(xì)胞中短暫表達(dá)位點(diǎn)特異性重組酶，借此染色體的識(shí)別序列對(duì)通過重組酶與核酸構(gòu)建體的對(duì)應(yīng)的識(shí)別序列對(duì)重組，從而使得在至少兩個(gè)整合位點(diǎn)，染色體中的駐留選擇標(biāo)記被切除而目標(biāo)多核苷酸的拷貝整合到它的位置上，產(chǎn)生包括兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的整合到真菌宿主細(xì)胞的染色體中的目標(biāo)多核苷酸的真菌宿主細(xì)胞。如在以下的實(shí)施例部分中所例證的，本發(fā)明的主要方面提供將兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的目標(biāo)多核苷酸同時(shí)整合到真菌宿主細(xì)胞的染色體中的方法，該方法包括以下步驟：(a)提供在其染色體內(nèi)包括至少兩對(duì)位點(diǎn)特異性重組酶的識(shí)別序列的真菌宿主細(xì)胞，每對(duì)識(shí)別序列位于駐留陰性選擇標(biāo)記的兩側(cè)；(b)向所述細(xì)胞中引入核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包括一對(duì)位點(diǎn)特異性重組酶的識(shí)別序列，該識(shí)別序列對(duì)位于目標(biāo)多核苷酸的兩側(cè)；(c)在細(xì)胞中短暫表達(dá)位點(diǎn)特異性重組酶，借此染色體的識(shí)別序列對(duì)通過重組酶與核酸構(gòu)建體的對(duì)應(yīng)的識(shí)別序列對(duì)重組，從而使得染色體中的每個(gè)駐留陰性選擇標(biāo)記被切除而目標(biāo)多核苷酸的拷貝整合到它的位置上；然后(d)在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞并選擇細(xì)胞，其中每個(gè)陰性選擇標(biāo)記已經(jīng)通過雙同源重組被兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的目標(biāo)多核苷酸取代。附圖說(shuō)明圖1顯示本發(fā)明方法的基本方案，在此運(yùn)用frt/flp重組體系和pyrg(作為雙向選擇標(biāo)記)以及兩側(cè)是兩拷貝轉(zhuǎn)錄終止子(標(biāo)記為“term”)的flp編碼基因一起加以例證，其使得可以通過雙同源重組實(shí)現(xiàn)flp和pyrg基因的切除，使得可以進(jìn)行flp的短暫表達(dá)。圖2顯示phuda981的質(zhì)粒圖譜(在wo07045248中描述了pgpd，hsv1tk和ttrpc)。圖3顯示phuda1019的質(zhì)粒圖譜。圖4顯示phuda1000的質(zhì)粒圖譜。圖5顯示phuda1000正確引入到nn059183中之后的na1(上圖)和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座示意圖(下圖)。圖6顯示phuda801的質(zhì)粒圖譜。圖7顯示phuda1043的質(zhì)粒圖譜。圖8顯示phuda1078的質(zhì)粒圖譜。圖9顯示phuda1067的質(zhì)粒圖譜。圖10顯示nn059208中的na1基因座(上部)、na2基因座(中間)和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座(下部)示意圖。圖11顯示prika147的質(zhì)粒圖譜。圖12顯示prika147正確整合到nn059208中之后的na1(上部)、na2(中間)和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座(下部)示意圖。圖13顯示phuda1174的質(zhì)粒圖譜。圖14顯示m1146中pay基因座(上部)的示意圖。圖15顯示phuda1306的質(zhì)粒圖譜。圖16a顯示當(dāng)prika147引入到m1146中時(shí)的na1基因座(上部)和na2(2nd)的示意圖。圖16b顯示當(dāng)prika147引入到m1146中時(shí)的sp288基因座(3rd)示意圖。圖16c顯示當(dāng)prika147引入到m1146中時(shí)的pay基因座示意圖。圖17顯示phuda1356的質(zhì)粒圖譜。圖18顯示用來(lái)將frt位點(diǎn)在cbh1基因座處整合到里氏木霉(t.reesei)基因組中的載體pjfys147的圖譜。圖19顯示使用flp/frt體系用來(lái)將煙曲霉(a.fumigatus)bg在cbh1基因座處整合到里氏木霉菌株jfys147-20b中的載體pjfys150的圖譜。定義胞嘧啶脫氨酶：胞嘧啶脫氨酶(ec3.5.4.1)催化胞嘧啶和5-氟胞嘧啶(5fc)的脫氨基作用以分別形成尿嘧啶和有毒的5-氟尿嘧啶(5fu)。當(dāng)包含胞嘧啶脫氨酶的基因改造細(xì)胞與5fc結(jié)合時(shí)，5fc被轉(zhuǎn)化成有毒的5fu，因此胞嘧啶脫氨酶編碼基因潛在地是有效的陰性選擇標(biāo)記。也已顯示，嘧啶從頭(denovo)合成途徑中的抑制劑可以用于創(chuàng)造如下條件，在該條件下細(xì)胞依賴于通過胞嘧啶脫氨酶進(jìn)行的嘧啶補(bǔ)充物到尿嘧啶的轉(zhuǎn)化。因此，只有表達(dá)胞嘧啶脫氨酶基因的細(xì)胞可以在包含嘧啶從頭合成抑制劑及肌苷和胞嘧啶的陽(yáng)性選擇介質(zhì)中被救援(參見weiandhuber,1996,jbiolchem271(7):3812的圖1)。該抑制劑優(yōu)選是n-膦乙酰基-l-天冬氨酸(pala)，其抑制天冬氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶。如果必要的話，胞嘧啶脫氨酶活性可以通過基因檢測(cè)加以定量(fredericol.a.等，1990，biochemistry29：2532-2537)。等位變體(allelicvariant)：術(shù)語(yǔ)“等位變體”是指占據(jù)相同染色體基因座的兩種或多種可替換基因形式中的任一種。等位變體自然地通過突變而產(chǎn)生，且可以引起群體內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中沒有變化)，或者可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。催化結(jié)構(gòu)域：術(shù)語(yǔ)“催化結(jié)構(gòu)域”是指酶的包含酶的催化機(jī)構(gòu)的區(qū)域。cdna：術(shù)語(yǔ)“cdna”是指能夠通過得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mrna分子的反轉(zhuǎn)錄而制得的dna分子。cdna缺少可能存在于相應(yīng)基因組dna中的內(nèi)含子序列。早先的初始rna轉(zhuǎn)錄子是mrna的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mrna之前要經(jīng)一系列的步驟加工，包括剪接。編碼序列：術(shù)語(yǔ)“編碼序列”是指多核苷酸，其直接明確多肽的氨基酸序列。編碼序列的邊界通常由開放閱讀框決定，其以起始密碼子例如atg、gtg或ttg開始，并以終止密碼子例如taa、tag或tga結(jié)束。編碼序列可以是基因組dna、cdna、合成dna或其組合?？刂菩蛄校盒g(shù)語(yǔ)“控制序列”是指對(duì)于本發(fā)明的編碼成熟多肽的多核苷酸的表達(dá)為必要的核酸序列。各個(gè)控制序列可以相對(duì)于編碼多肽的多核苷酸是原生的(native)(即，來(lái)自相同基因)或外源的(即，來(lái)自不同基因)或者相互為原生的或外源的。這樣的控制序列包括但不限于，前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子?？刂菩蛄兄辽侔▎?dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入特定限制性酶切位點(diǎn)的目的，控制序列可具有接頭，其促進(jìn)控制序列與編碼多肽的多核苷酸的編碼區(qū)域的連接。表達(dá)：術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及到多肽生產(chǎn)中的任何步驟，包括但不限于：轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。表達(dá)載體：術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指包括編碼多肽的多核苷酸并且可操作地與用于其表達(dá)的控制序列相連接的線性或環(huán)狀dna分子。片段：術(shù)語(yǔ)“片段”是指具有一個(gè)或多個(gè)(例如，數(shù)個(gè))從成熟多肽或結(jié)構(gòu)域的氨基和/或羧基端缺失的氨基酸的多肽或催化結(jié)構(gòu)域；其中片段具有胞嘧啶脫氨酶活性。宿主細(xì)胞：術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指對(duì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等敏感的任何細(xì)胞類型，其具有包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括因復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任意后代。分離的或純化的：術(shù)語(yǔ)“分離的”或“純化的”是指從與其自然相關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)成分中移出的多肽或多核苷酸。例如，按照sds-page所測(cè)定的，多肽可以是至少1％純的，例如至少5％純，至少10％純，至少20％純，至少40％純，至少60％純，至少80％純，至少90％純，或至少95％純，如按照瓊脂糖電泳所測(cè)定的，多核苷酸可以是至少1％純的，例如至少5％純，至少10％純，至少20％純，至少40％純，至少60％純，至少80％純，至少90％純，或至少95％純。陰性選擇標(biāo)記：術(shù)語(yǔ)“陰性選擇標(biāo)記”是指能夠賦予選擇特征從而使得具有該陰性選擇標(biāo)記的細(xì)胞被殺死或者以其他方式例如通過熒光被識(shí)別的核酸序列。陰性選擇標(biāo)記優(yōu)選基本不能與靶標(biāo)dna序列同源重組。核酸構(gòu)建體：術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”是指從天然存在的基因中分離的、或以自然中不會(huì)另外出現(xiàn)的方式被修飾成包含核酸片段的、或合成的單鏈或雙鏈的核酸分子，其包括一個(gè)或多個(gè)控制序列?？刹僮鞯剡B接：術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指如下的構(gòu)造，其中，控制序列相對(duì)于多核苷酸的編碼序列安置在合適位置處，從而控制序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。序列同一性：兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的關(guān)聯(lián)性通過參數(shù)“序列同一性”來(lái)說(shuō)明。出于本發(fā)明的目的，使用在emboss軟件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite(歐洲分子生物學(xué)開放軟件包),rice等人,2000,trendsgenet.16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版本或更新)的needle程序中執(zhí)行的needleman-wunsch算法(needlemanandwunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)來(lái)確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性。所用的參數(shù)：空位開放罰分為10，空位擴(kuò)展罰分為0.5，以及eblosum62(blosum62的emboss版本)替換矩陣。needle標(biāo)記的“最長(zhǎng)一致度”的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)得到的)被用作百分比一致度并如下計(jì)算：(相同殘基×100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))出于本發(fā)明的目的，使用在emboss軟件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite(歐洲分子生物學(xué)開放軟件包),rice等人,2000，同上)(優(yōu)選5.0.0版本或更新)的needle程序中執(zhí)行的needleman-wunsch算法(needlemanandwunsch,1970，同上)來(lái)確定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性。所用的參數(shù)：空位開放罰分為10，空位擴(kuò)展罰分為0.5，以及ednafull(ncbinuc4.4的emboss版本)替換矩陣。needle標(biāo)記的“最長(zhǎng)一致度”的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)得到的)被用作百分比一致度并如下計(jì)算：(相同脫氧核糖核酸×100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))同時(shí)：本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“同時(shí)”，即，關(guān)于至少兩個(gè)目標(biāo)多核苷酸向宿主細(xì)胞中的整合，指的是這樣一個(gè)過程，通過這個(gè)過程在至少兩個(gè)拷貝的目標(biāo)多核苷酸向宿主細(xì)胞中的整合發(fā)生在同一過程步驟中，致使增加一個(gè)拷貝的目標(biāo)多核苷酸，即，不需要增加任何其它材料和/或任何附加過程步驟。因此，目標(biāo)多核苷酸在同一過程中在相同時(shí)刻或不同時(shí)刻但在同一過程中同時(shí)期地被引入到該宿主細(xì)胞中的至少兩個(gè)不同整合位點(diǎn)。子序列：術(shù)語(yǔ)“子序列”是指從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個(gè)或多個(gè)(例如，數(shù)個(gè))核苷酸的多核苷酸；其中子序列編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性的片段。變體：術(shù)語(yǔ)“變體”是指在一個(gè)或多個(gè)位置上包括一個(gè)或多個(gè)(例如，數(shù)個(gè))氨基酸殘基的改變(即替換、插入和/或缺失)的具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽。替換是指用不同的氨基酸替換占據(jù)某位置的氨基酸；缺失是指去除占據(jù)位置的氨基酸；并且插入是指增加與占據(jù)某位置的氨基酸相鄰的氨基酸。具體實(shí)施方式本發(fā)明的第一方面涉及將兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的目標(biāo)多核苷酸整合到真菌宿主細(xì)胞的染色體中的方法，該方法通過以下步驟進(jìn)行：(a)提供在其染色體內(nèi)包括至少兩個(gè)整合位點(diǎn)的真菌宿主細(xì)胞，每個(gè)整合位點(diǎn)包括一對(duì)位點(diǎn)特異性重組酶的識(shí)別序列，每對(duì)識(shí)別序列位于駐留(resident)選擇標(biāo)記的兩側(cè)；(b)向所述細(xì)胞中引入核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包括一對(duì)位點(diǎn)特異性重組酶的識(shí)別序列，該識(shí)別序列對(duì)位于目標(biāo)多核苷酸的兩側(cè)；(c)在細(xì)胞中短暫表達(dá)位點(diǎn)特異性重組酶，借此染色體的識(shí)別序列對(duì)通過重組酶與核酸構(gòu)建體的對(duì)應(yīng)的識(shí)別序列對(duì)重組，從而使得在至少兩個(gè)整合位點(diǎn)，染色體中的駐留選擇標(biāo)記被切除而目標(biāo)多核苷酸的拷貝整合到它的位置上，產(chǎn)生包括兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的整合到真菌宿主細(xì)胞的染色體中的目標(biāo)多核苷酸的真菌宿主細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的第一方面涉及將兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的目標(biāo)多核苷酸同時(shí)整合到真菌宿主細(xì)胞的染色體中的方法，該方法包括以下步驟：(a)提供在其染色體內(nèi)包括至少兩對(duì)位點(diǎn)特異性重組酶的識(shí)別序列的真菌宿主細(xì)胞，每對(duì)識(shí)別序列位于駐留陰性選擇標(biāo)記的兩側(cè)；(b)向所述細(xì)胞中引入核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包括一對(duì)位點(diǎn)特異性重組酶的識(shí)別序列，該識(shí)別序列對(duì)位于目標(biāo)多核苷酸的兩側(cè)；(c)在細(xì)胞中短暫表達(dá)位點(diǎn)特異性重組酶，借此染色體的識(shí)別序列對(duì)通過重組酶與核酸構(gòu)建體的對(duì)應(yīng)的識(shí)別序列對(duì)重組，從而使得染色體中的每個(gè)駐留陰性選擇標(biāo)記被切除而目標(biāo)多核苷酸的拷貝整合到它的位置上；然后(d)在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞并選擇細(xì)胞，其中每個(gè)陰性選擇標(biāo)記已經(jīng)通過雙同源重組被兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的目標(biāo)多核苷酸取代。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該目標(biāo)多核苷酸包括編碼至少一個(gè)目標(biāo)多肽的操縱子或開放閱讀框。該目標(biāo)多肽可以編碼任何目標(biāo)蛋白質(zhì)，比如，例如，細(xì)胞因子(特別是白介素、干擾素、集落刺激因子(csf)和生長(zhǎng)因子)，抗凝血?jiǎng)?，酶和酶抑制劑。?yōu)選地，該目標(biāo)多肽包括酶，優(yōu)選為水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶或轉(zhuǎn)移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。自由可逆的位點(diǎn)特異性重組體系已經(jīng)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。這些可逆體系包括以下：來(lái)自噬菌體p1的cre-lox體系(baubonis和sauer，1993，見上文；albert等，1995plantj.,7549-59)，釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)的flp-frt體系(o'gorrnan等，1991，見上文)，zygosaccharonzycesrouxii的r-rs體系(onouchi等，1995mol.gen.genet.247：653-660)，來(lái)自mu噬菌體的改良gin-gix體系(maeser和kahmann，1991mol.gen.genet.，230:170-76)，來(lái)自枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)質(zhì)粒的β-重組酶-six體系(diaz等，1999j.biol.chem.274：6634-6640)以及來(lái)自細(xì)菌轉(zhuǎn)座子tn1000的δ-γ-res體系(schwikardi和dorge，2000ebslet.471：147-150)。cre、flp、r、gin、β-重組酶和δ-γ是重組酶，lox、frt、rs、gix、six和res是各個(gè)重組位點(diǎn)(由sadowslu，1993fasebj.,7:750-67；ow和medberry，1995crit.rev.plantsci.14：239-261綜述)。多重cre/lox重組允許選擇性位點(diǎn)特異性dna靶向酵母基因組中的自然位點(diǎn)和工程化位點(diǎn)(sauer,b.nucleicacidsresearch.1996,vol.24(23):4608-4613)。已經(jīng)顯示使用鏈霉菌屬(streptomyces)噬菌體φc31的衍生物感染具有自然附著位點(diǎn)attb和異位引入的attb位點(diǎn)的宿主細(xì)胞，結(jié)果使該噬菌體整合到兩個(gè)attb位點(diǎn)中(smith等，2004，switchingthepolarityofabacteriophageintegrationsystem.molmicrobiol51(6):1719-1728)。使用mx9噬菌體轉(zhuǎn)化體系，多個(gè)拷貝的基因可以引入到包含多個(gè)被mx9整合酶識(shí)別的附著位點(diǎn)的細(xì)胞中(wo2004/018635a2)。溫帶lactococcal噬菌體tp901-1整合酶和識(shí)別序列是良好表征的(breüner等，(1990)novelorganizationofgenesinvolvedinprophageexcisionidentifiedinthetemperatelactococcalbacteriophagetp901-1.jbacteriol181(23):7291-7297；breüner等，2001.resolvase-likerecombinationperformedbythetp901-1integrase.microbiology147:2051-2063)。以上的位點(diǎn)特異性重組體系具有共同的性質(zhì)，即單一的多肽重組酶催化相同序列或近乎相同序列在兩個(gè)位點(diǎn)間的重組。每個(gè)重組位點(diǎn)由短的不對(duì)稱間隔序列組成，在該短的不對(duì)稱間隔序列處發(fā)生鏈交換，該短的不對(duì)稱間隔序列在兩側(cè)有重組酶結(jié)合的反向重復(fù)序列。間隔序列的不對(duì)稱性對(duì)重組位點(diǎn)提供了一個(gè)方向，并規(guī)定了重組反應(yīng)的結(jié)果。直接或間接定向的順式位點(diǎn)之間的重組分別切除或倒置干預(yù)dna。反式位點(diǎn)之間的重組引起兩個(gè)線性dna分子的相互易位，或者，如果兩個(gè)分子之中有至少一個(gè)是環(huán)形的，則引起共整合。因?yàn)橛芍亟M產(chǎn)生的產(chǎn)物位點(diǎn)自身是隨后重組的底物，所以反應(yīng)是自由可逆的。但是，在實(shí)際中，因?yàn)閮蓚€(gè)重組位點(diǎn)緊密相連的地方的分子內(nèi)相互作用的可能性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不相連位點(diǎn)間的分子內(nèi)相互作用的可能性，所以切除基本上是不可逆的。必然的結(jié)果是插入到基因組重組位點(diǎn)中的dna分子會(huì)很容易地切除掉，除非該重組酶短暫表達(dá)，在這種情況下，插入的dna在重組酶不再表達(dá)后得以保持。因此，在第一方面的方法中，優(yōu)選位點(diǎn)特異性重組酶和它的識(shí)別序列對(duì)來(lái)自于噬菌體p1的cre-lox體系、釀酒酵母的flp-frt體系、zygosaccharonzycesrouxii的r-rs體系、來(lái)自mu噬菌體的改良gin-gix體系、來(lái)自枯草芽孢桿菌質(zhì)粒的β-重組酶-six體系，來(lái)自細(xì)菌轉(zhuǎn)座子tn1000的δ-γ-res體系、鏈霉菌屬噬菌體φc31、mx9噬菌體轉(zhuǎn)化體系或溫帶lactococcal噬菌體tp901-1的xis-att體系。在實(shí)施方式中，位點(diǎn)特異性重組酶和它的識(shí)別序列對(duì)來(lái)自flp-frt體系。在具體的實(shí)施方式中，flp重組酶是如在buchholz,frank,improvedpropertiesofflprecombinaseevolvedbycyclingmutagenesis,naturebiotechnologyvolume:16issue:7(1998-07-01)p.657-662中記載的flp重組酶變體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，flp重組酶是具有氨基酸改變p2s、l33s、y108n和s294p的被指定為“flpe”的熱穩(wěn)定性重組酶變體。flpe的核酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列分別見seqidno:106和seqidno:107。在第一方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，陰性選擇標(biāo)記編碼對(duì)宿主細(xì)胞賦予抗菌素抗性的多肽且選擇性培養(yǎng)基包括抑菌濃度的抗菌素。或者，在第一方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，陰性選擇標(biāo)記編碼胞嘧啶脫氨酶且選擇性培養(yǎng)基包括足量的5-氟胞嘧啶，其通過所述胞嘧啶脫氨酶轉(zhuǎn)化為抑菌濃度的毒性5-氟尿嘧啶。在實(shí)施方式中，陰性選擇標(biāo)記編碼胞嘧啶脫氨酶多肽，該胞嘧啶脫氨酶多肽與seqidno:60具有至少60％的序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。在一個(gè)方面，多肽與seqidno:60相差不多于十個(gè)氨基酸，例如九個(gè)氨基酸、八個(gè)氨基酸、七個(gè)氨基酸、六個(gè)氨基酸、五個(gè)氨基酸、四個(gè)氨基酸、三個(gè)氨基酸、二個(gè)氨基酸或一個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的編碼的胞嘧啶脫氨酶多肽包括seqidno:60的氨基酸序列或其等位變體或者由其組成；或者該胞嘧啶脫氨酶多肽是它的具有胞嘧啶脫氨酶活性的片段。在另一個(gè)方面，該多肽包括或者由seqidno:60的多肽組成。在另一個(gè)實(shí)施方式中，陰性選擇標(biāo)記編碼胞嘧啶脫氨酶多肽，并在極低等嚴(yán)格條件、低等嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件、中高等嚴(yán)格條件、高等嚴(yán)格條件或極高等嚴(yán)格條件下與(i)seqidno:59的多肽編碼序列，(ii)其cdna序列，或(iii)，(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物雜交(sambrook等，1989，molecularcloning，alaboratorymanual，第2版，冷泉港(coldspringharbor)，紐約)。根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法，seqidno:59的多核苷酸或其子序列以及seqidno:60的多肽或其片段可以用來(lái)設(shè)計(jì)核酸探針，以鑒定和克隆來(lái)自不同屬或種的菌株的編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽的dna。具體地，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)southern印跡步驟，這些探針可以用于與目標(biāo)細(xì)胞的基因組dna或cdna進(jìn)行雜交，以鑒定并分離其中的相應(yīng)基因。在長(zhǎng)度上，這些探針可以比完整序列短很多，但應(yīng)當(dāng)是至少15個(gè)核苷酸，例如，在長(zhǎng)度上為至少25個(gè)，至少35個(gè)或至少個(gè)70核苷酸。優(yōu)選地，核酸探針在長(zhǎng)度上是至少100個(gè)核苷酸，例如，在長(zhǎng)度上為至少200個(gè)核苷酸，至少300個(gè)核苷酸，至少400個(gè)核苷酸，至少500個(gè)核苷酸，至少600個(gè)核苷酸，至少700個(gè)核苷酸，至少800個(gè)核苷酸或至少900個(gè)核苷酸。dna和rna探針兩者都可以使用。通常，這些探針被標(biāo)記以檢測(cè)相應(yīng)基因(例如，用32p、3h、35s、生物素或抗生物素蛋白標(biāo)記)。本發(fā)明涵蓋這些探針。對(duì)于與上述探針雜交且編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽的dna，可以篩選從這樣的其他菌株制備的基因組dna或cdna文庫(kù)?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術(shù)，分離來(lái)自這樣的其他菌株的基因組dna或其它dna。來(lái)自文庫(kù)的dna或分離的dna可以被轉(zhuǎn)移到并被固定在硝化纖維或其它合適的載體材料上。為了鑒定與seqidno:59或其子序列同源的克隆或dna，優(yōu)選在southern印跡中使用載體材料。出于本發(fā)明的目的，雜交是指多核苷酸在極低等到極高等嚴(yán)格條件下與如下的標(biāo)記核酸探針雜交，該標(biāo)記的核酸探針與(i)seqidno:59；(ii)seqidno:59的多肽編碼序列；(iii)其cdna序列；(iv)其全長(zhǎng)互補(bǔ)物；或(v)其子序列相對(duì)應(yīng)?？梢赃\(yùn)用例如x-ray膜來(lái)檢測(cè)核酸探針在這些條件下所雜交的分子。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針，極低等嚴(yán)格條件定義為，在42℃下在5×sspe、0.3％sds、200mg/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和25％甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，最佳地，之后進(jìn)行12～24個(gè)小時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)southern印跡過程。載體材料最終使用2×ssc、0.2％sds在45℃下清洗三次，每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針，低等嚴(yán)格條件定義為，在42℃下在5×sspe、0.3％sds、200mg/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和25％甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，最佳地，之后進(jìn)行12～24個(gè)小時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)southern印跡過程。載體材料最終使用2×ssc、0.2％sds在50℃下清洗三次，每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針，中等嚴(yán)格條件定義為，在42℃下在5×sspe、0.3％sds、200mg/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，最佳地，之后進(jìn)行12～24個(gè)小時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)southern印跡過程。載體材料最終使用2×ssc、0.2％sds在55℃下清洗三次，每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針，中高等嚴(yán)格條件定義為，在42℃下在5×sspe、0.3％sds、200mg/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，最佳地，之后進(jìn)行12～24個(gè)小時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)southern印跡過程。載體材料最終使用2×ssc、0.2％sds在60℃下清洗三次，每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針，高等嚴(yán)格條件定義為，在42℃下在5×sspe、0.3％sds、200mg/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和50％甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，最佳地，之后進(jìn)行12～24個(gè)小時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)southern印跡過程。載體材料最終使用2×ssc、0.2％sds在65℃下清洗三次，每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針，極高等嚴(yán)格條件定義為，在42℃下在5×sspe、0.3％sds、200mg/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和50％甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，最佳地，之后進(jìn)行12～24個(gè)小時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)southern印跡過程。載體材料最終使用2×ssc、0.2％sds在70℃下清洗三次，每次15分鐘。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一方面的陰性選擇標(biāo)記與seqidno:59的多肽編碼序列或其cdna序列具有至少60％的序列同一性，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，陰性選擇標(biāo)記編碼包括在一個(gè)或多個(gè)(例如數(shù)個(gè))位置的取代、缺失和/或插入的seqidno:60的胞嘧啶脫氨酶多肽的變體。氨基酸變化優(yōu)選性質(zhì)小的變化，即不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代或插入；小的缺失，通常為1到大約30個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基端或羧基端延伸，諸如氨基端的蛋氨酸殘基；最多約20～25個(gè)殘基的小接頭肽；或者通過改變凈電荷或其它功能而有助于純化的小延伸，諸如多聚組氨酸片段(tract)、抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。保守性取代的實(shí)例是堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸)各組內(nèi)的取代。通常不改變比活度的氨基酸取代在本領(lǐng)域是已知的，并且在例如h.neurathandr.l.hill,1979,in,theproteins,academicpress,newyork中記載。常見的取代是ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly?；蛘?，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)，即多肽的理化性質(zhì)發(fā)生改變。例如，氨基酸改變可以提高多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物專一性、改變最適ph等等。多肽中的必需氨基酸可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的程序如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變加以鑒定(cunninghamandwells,1989,science244:1081-1085)。在后述技術(shù)中，在分子中的每個(gè)殘基處引入單一丙氨酸突變，且對(duì)生成的突變分子測(cè)試胞嘧啶脫氨酶活性，以鑒定對(duì)該分子的活性很關(guān)鍵的氨基酸殘基。還參見hilton等，1996，j.biol.chem.271：4699-4708。酶的活性位點(diǎn)或其他生物相互作用同樣可以通過結(jié)構(gòu)的物理分析測(cè)定，如通過這樣的技術(shù)測(cè)定，如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射或光親合標(biāo)記，連同假定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變。例如，參閱devos等，1992，science255:306-312；smith等，1992，j.mol.biol.224:899-904；wlodaver等，1992，febslett.309:59-64。必需氨基酸的鑒定也可以從與相關(guān)多肽的比對(duì)來(lái)推斷。使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，接著進(jìn)行相關(guān)的篩選步驟，比如reidhaar-olsonandsauer,1988,science241:53-57；bowieandsauer,1989,proc.natl.acad.sci.usa86:2152-2156；wo95/17413；或wo95/22625所公開的，可以完成和測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入。可以運(yùn)用的其他方法包括易錯(cuò)pcr、噬菌體展示(例如，lowman等，1991，biochemistry30:10832-10837；u.s.專利號(hào)5,223,409；wo92/06204)和定位誘變(derbyshire等，1986，gene46:145；ner等，1988，dna7:127)。誘變/改組方法可以與高通量的自動(dòng)篩選方法結(jié)合，以檢測(cè)宿主細(xì)胞所表達(dá)的克隆的誘變多肽的活性(ness等，1999，naturebiotechnology17：893-896)?？梢詮乃拗骷?xì)胞回收編碼活性多肽的誘變dna分子且可以用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)快速測(cè)序。這些方法允許對(duì)多肽中個(gè)別氨基酸殘基的重要性進(jìn)行快速測(cè)定。在實(shí)施方式中，引入到seqidno:60多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目不多于10，例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9。多肽可以是雜合多肽，在其中，一個(gè)多肽的區(qū)域融合在另一個(gè)多肽的區(qū)域的n端或c端。具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽的來(lái)源編碼本發(fā)明的具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽的多核苷酸可以從任何屬的微生物中獲得。出于本發(fā)明的目的，本文中與給定來(lái)源一起使用的術(shù)語(yǔ)“由……獲得”應(yīng)指，由多核苷酸編碼的多肽是由該來(lái)源或插入了來(lái)自該來(lái)源的多核苷酸的菌株所產(chǎn)生。胞嘧啶脫氨酶多肽可以是真菌多肽。例如，該多肽可以是酵母多肽，諸如假絲酵母屬(candida)、克魯維酵母屬(kluyveromyces)、畢赤酵母屬(pichia)、酵母屬(saccharomyces)、裂殖酵母屬(schizosaccharomyces)或耶氏酵母屬(yarrowia)多肽；或絲狀真菌多肽，諸如支頂孢屬(acremonium)、傘菌屬(agaricus)、鏈格孢屬(alternaria)、曲霉屬(aspergillus)、短梗霉屬(aureobasidium)、botryospaeria、擬蠟菌屬(ceriporiopsis)、毛喙殼屬(chaetomidium)、金孢子菌屬(chrysosporium)、麥角菌屬(claviceps)、旋孢腔菌(cochliobolus)、鬼傘屬(coprinopsis)、乳白蟻屬(coptotermes)、棒囊殼屬(corynascus)、栗疫屬(cryphonectria)、隱球酵母屬(cryptococcus)、色二孢屬(diplodia)、黑耳屬(exidia)、filibasidium、鐮孢霉屬(fusarium)、赤霉菌屬(gibberella)、全鞭毛蟲屬(holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(humicola)、耙齒菌屬(irpex)、香菇屬(lentinula)、leptospaeria、稻瘟菌屬(magnaporthe)、melanocarpus、meripilus、毛霉屬(mucor)、毀絲霉屬(myceliophthora)、neocallimastix、脈孢菌屬(neurospora)、擬青霉屬(paecilomyces)、青霉屬(penicillium)、平革菌屬(phanerochaete)、piromyces、poitrasia、假黑盤菌屬(pseudoplectania)、pseudotrichonympha、根毛霉屬(rhizomucor)、裂褶菌屬(schizophyllum)、柱頂孢屬(scytalidium)、踝節(jié)菌屬(talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(thermoascus)、梭孢殼屬(thielavia)、彎頸霉屬(tolypocladium)、木霉屬(trichoderma)、長(zhǎng)毛盤菌屬(trichophaea)、輪枝孢屬(verticillium)、小包腳菇屬(volvariella)或炭角菌屬(xylaria)多肽。另一方面，多肽是卡氏酵母(saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(saccharomycesnorbensis)或saccharomycesoviformis多肽。另一方面，多肽是解纖維枝頂孢霉(acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(aspergillusawamori)、臭曲霉(aspergillusfoetidus)、煙曲霉(aspergillusfumigatus)、日本曲霉(aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉(aspergillusniger)、米曲霉(aspergillusoryzae)、chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金孢子菌(chrysosporiumkeratinophilum)、chrysosporiumlucknowense、chrysosporiummerdarium、chrysosporiumpannicola、chrysosporiumqueenslandicum、熱帶金孢子菌(chrysosporiumtropicum)、chrysosporiumzonatum、桿孢狀鐮孢(fusariumbactridioides)、fusariumcerealis、克地鐮刀菌(fusariumcrookwellense)、黃色鐮孢菌(fusariumculmorum)、禾谷鐮刀菌(fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(fusariumgraminum)、異孢鐮孢(fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(fusariumnegundi)、尖孢鐮孢菌(fusariumoxysporum)、fusariumreticulatum、粉紅鐮刀菌(fusariumroseum)、接骨木鐮孢(fusariumsambucinum)、膚色鐮孢(fusariumsarcochroum)、擬枝孢鐮刀菌(fusariumsporotrichioides)、硫色鐮孢(fusariumsulphureum)、fusariumtorulosum、擬絲孢鐮刀菌(fusariumtrichothecioides)、fusariumvenenatum、灰腐質(zhì)霉(humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(humicolainsolens)、柔毛腐質(zhì)霉(humicolalanuginosa)、白耙齒菌(irpexlacteus)、米赫毛霉(mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)、繩狀青霉(penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉菌(penicilliumpurpurogenum)、黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、thielaviaachromatica、thielaviaalbomyces、thielaviaalbopilosa、澳洲梭孢殼(thielaviaaustraleinsis)、thielaviafimeti、小孢梭孢殼(thielaviamicrospora)、卵孢梭孢殼(thielaviaovispora)、thielaviaperuviana、毛梭孢殼(thielaviasetosa)、thielaviaspededonium、耐熱梭孢殼(thielaviasubthermophila)、太瑞斯梭孢殼霉(thielaviaterrestris)、哈茨木霉(trichodermaharzianum)、康寧木霉(trichodermakoningii)、長(zhǎng)梗木霉(trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(trichodermareesei)或綠色木霉(trichodermaviride)多肽。應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于前面提及的物種，本發(fā)明涵蓋上述物種的完全和不完全狀態(tài)(imperfectstate)和其它分類學(xué)同等物，如無(wú)性型，而不論這些物種現(xiàn)在的名稱如何。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易領(lǐng)會(huì)適當(dāng)同等物的具體內(nèi)容(identity)。這些物種的菌株可以從大量的培養(yǎng)物收藏中心為公眾獲得，諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(americantypeculturecollection，atcc)、deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh(dsmz)、centraalbureauvoorschimmelcultures(cbs)和北方地區(qū)研究中心(nrrl)的農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物收藏中心。此外，可以使用上述探針由其它來(lái)源包括由自然界(如土壤、堆肥、水等等)分離的微生物鑒定并獲得多肽。用于由天然棲息地分離微生物的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的。然后，相似地，可以通過對(duì)另一微生物的基因組dna或cdna文庫(kù)或者混合的dna樣本進(jìn)行篩選而獲得編碼多肽的多核苷酸。在用探針檢測(cè)到編碼多肽的多核苷酸后，可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)分離或克隆多核苷酸(參閱sambrook等人，1989，見上文)。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包括選擇標(biāo)記和目標(biāo)多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，該選擇標(biāo)記和目標(biāo)多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)在合適的表達(dá)宿主細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的控制序列可操作地連接。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及包括陰性選擇標(biāo)記和目標(biāo)多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，該陰性選擇標(biāo)記和目標(biāo)多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)在合適的表達(dá)宿主細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的控制序列可操作地連接?？梢酝ㄟ^多種方式操縱多核苷酸以提供所編碼的多肽的表達(dá)。根據(jù)該表達(dá)載體，在多核苷酸插入到載體之前對(duì)多核苷酸進(jìn)行操縱是合乎需要的或必須的。使用重組dna方法修飾多核苷酸的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的?？刂菩蛄锌梢允菃?dòng)子序列，一種由宿主細(xì)胞識(shí)別以表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的多核苷酸。啟動(dòng)子序列包含介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子可以是任何在選擇的宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的多核苷酸，包括突變、截短和雜合的啟動(dòng)子，并且可從編碼胞外或胞內(nèi)多肽的對(duì)于宿主細(xì)胞為同源或異源的基因得到。用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是包括從構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaa)、米曲霉(aspergillusoryzae)taka淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、尖孢鐮刀菌(fusariumoxysporum)胰酶樣蛋白酶(wo96/00787)、fusariumvenenatum淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、fusariumvenenatumdaria(wo00/56900)、fusariumvenenatumquinn(wo00/56900)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(trichodermareesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶i、里氏木霉纖維二糖水解酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iv、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉β-木糖苷酶的基因獲得的啟動(dòng)子，以及na2-tpi啟動(dòng)子(編碼中性α淀粉酶的曲霉基因的修飾啟動(dòng)子，其中不翻譯的前導(dǎo)被編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的曲霉基因的不翻譯前導(dǎo)替代；非限制性實(shí)例包括來(lái)自編碼中性α淀粉酶的黑曲霉基因的修飾啟動(dòng)子，其中不翻譯前導(dǎo)被編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的構(gòu)巢曲霉或米曲霉基因的不翻譯前導(dǎo)替代)；及其突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)烯醇酶(eno-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(gal1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(adh1、adh2/gap)、釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)、釀酒酵母金屬硫蛋白(cup1)以及釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因獲得。其它用于酵母宿主細(xì)胞的有用啟動(dòng)子在romanos等人(1992，酵母(yeast)8：423-488)中記載?？刂菩蛄羞€可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄。終止子序列與編碼多肽的多核苷酸的3'末端可操作地連接。在選定的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何終止子都可以用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子從構(gòu)巢曲霉的鄰氨基苯甲酸合成酶基因、黑曲霉的葡糖淀粉酶基因、黑曲霉的α-葡糖苷酶基因、米曲霉的taka淀粉酶基因和尖孢鐮刀菌的類胰蛋白酶蛋白酶基因獲得。用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子從釀酒酵母的烯醇酶基因、釀酒酵母的細(xì)胞色素c(cyc1)基因和釀酒酵母的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因獲得。其它用于酵母宿主細(xì)胞的有用終止子在romanos等人(1992，見上文)中記載?？刂菩蛄羞€可以是合適的前導(dǎo)序列，其在轉(zhuǎn)錄時(shí)是mrna的非翻譯區(qū)且對(duì)于宿主細(xì)胞進(jìn)行的翻譯很重要。前導(dǎo)序列與編碼多肽的多核苷酸的5’端可操作地連接?？墒褂萌魏卧谶x擇的宿主細(xì)胞中有功能的前導(dǎo)序列。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列從米曲霉的taka淀粉酶基因和構(gòu)巢曲霉的磷酸丙糖異構(gòu)酶基因獲得。用于酵母宿主細(xì)胞的合適前導(dǎo)序列由釀酒酵母的烯醇酶(eno-1)基因、釀酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母的α-因子基因和釀酒酵母的醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(adh2/gap)基因獲得?？刂菩蛄羞€可以是多腺苷酸化序列，即與多核苷酸的3'末端可操作地連接、當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)由宿主細(xì)胞識(shí)別作為向轉(zhuǎn)錄的mrna添加多腺苷酸殘基的信號(hào)的序列?？梢允褂迷谶x定的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何多腺苷酸化序列。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選多腺苷酸化序列由米曲霉的taka淀粉酶基因、黑曲霉的葡糖淀粉酶基因、構(gòu)巢曲霉的鄰氨基苯甲酸合成酶基因、尖孢鐮刀菌的類胰蛋白酶蛋白酶基因和黑曲霉的α-葡糖苷酶基因獲得。guo和sherman(1995,mol.cellularbiol.15:5983-5990)描述了可用于酵母宿主細(xì)胞的多腺苷酸化序列。控制序列也可以是編碼與多肽的n端連接并指導(dǎo)多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌通路的信號(hào)肽的信號(hào)肽編碼區(qū)。多核苷酸的編碼序列的5’端本身可包含在翻譯閱讀框中天然與編碼多肽的編碼序列片段相連接的信號(hào)肽編碼序列?；蛘撸幋a序列的5’端可含有對(duì)于該編碼序列為外源的信號(hào)肽編碼序列。在編碼序列并不天然包含信號(hào)肽編碼序列的情況下可能需要外源的信號(hào)肽編碼序列?；蛘?，為增強(qiáng)多肽的分泌，可以簡(jiǎn)單地用外源信號(hào)肽編碼序列替換天然信號(hào)肽編碼序列。然而，可以使用指導(dǎo)所表達(dá)多肽進(jìn)入選定宿主細(xì)胞的分泌通路的任何信號(hào)肽編碼序列。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是獲自黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉taka淀粉酶、特異腐質(zhì)霉(humicolainsolens)纖維素酶、特異腐質(zhì)酶內(nèi)切葡聚糖酶v、柔毛腐質(zhì)霉(humicolalanuginosa)脂肪酶以及米黑根毛霉(rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶的基因的信號(hào)肽編碼序列。可用于酵母宿主細(xì)胞的信號(hào)肽獲自釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因。其他可用的信號(hào)肽編碼序列在romanos等,1992(同上)中有過描述?？刂菩蛄幸部梢允蔷幋a位于多肽n端的前肽的前肽編碼序列。得到的多肽被稱為酶原(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下為酶原(zymogen))。多肽原通常為無(wú)活性的并能夠通過前肽的催化切割或自身催化切割而從多肽原轉(zhuǎn)化為活性多肽。當(dāng)信號(hào)肽和前肽序列在多肽的n端同時(shí)存在時(shí)，前肽序列的位置緊鄰于多肽的n端，且信號(hào)肽序列的位置緊鄰于前肽序列的n端。也可能期望加入相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)多肽表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的調(diào)控序列。調(diào)控體系的例子是使得基因表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)控化合物的存在)而打開或關(guān)閉的那些。原核系統(tǒng)中的調(diào)控體系包括lac、tac和trp操縱基因體系。在酵母中，可以使用adh2體系或gal1體系。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、米曲霉takaα-淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子。調(diào)控序列的其他例子是允許基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)控序列包括，在甲氨蝶呤的存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因、以及在重金屬下擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)控序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，包括本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)，以及如本文所述的，一對(duì)在目標(biāo)多核苷酸側(cè)翼的位點(diǎn)特異性重組酶的識(shí)別序列、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)?？蓪⒍喾N核苷酸和控制序列連接在一起，產(chǎn)生可包括一個(gè)或多個(gè)方便的限制性位點(diǎn)的重組表達(dá)載體，從而可以在這些位點(diǎn)插入或替代編碼多肽的多核苷酸。或者，可以通過將多核苷酸或包括該序列的核酸構(gòu)建體插入到合適的表達(dá)載體中來(lái)表達(dá)多核苷酸。在建立表達(dá)載體時(shí)，編碼序列位于載體中，使得該編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是能夠方便地進(jìn)行重組dna程序并能使多核苷酸表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?。載體的選擇將通常取決于載體和載體將要被引入的宿主細(xì)胞之間的相容性。載體可以是線性或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制型載體，即作為染色體外實(shí)體而存在、其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制的載體，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可以包括確保自我復(fù)制的任何元件(means)?；蛘撸d體可以是，在被引入宿主細(xì)胞后整合到基因組中并與其整合的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單個(gè)載體或質(zhì)粒，或一起包含將要引入宿主細(xì)胞基因組中的總dna的兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等細(xì)胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記是其產(chǎn)物例如提供殺生物劑或病毒抗性、重金屬抗性、相對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等的基因。用于酵母宿主細(xì)胞的合適標(biāo)記為，ade2、his3、leu2、lys2、met3、trp1和ura3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞中的選擇標(biāo)記包括但不限于amds(乙酰胺酶)、argb(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶，phosphinothricinacetyltransferase)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niad(硝酸還原酶)、pyrg(乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶)、sc(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，sulfateadenyltransferase)和trpc(鄰氨基苯甲酸合酶)、及其等同物。優(yōu)選用于曲霉細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amds和pyrg基因以及吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)bar基因。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，sambrook等，1989，見上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及適合于用包含目標(biāo)多核苷酸的整合核酸構(gòu)建體向宿主細(xì)胞基因組中進(jìn)行轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞，其中目標(biāo)多核苷酸的側(cè)翼是與胞嘧啶脫氨酶編碼基因同源的區(qū)域或與分別在該基因的上游和下游的區(qū)域同源的區(qū)域，該整合核酸構(gòu)建體指導(dǎo)通過位點(diǎn)特異性雙同源重組進(jìn)行的染色體整合，借此目標(biāo)多核苷酸整合到該宿主細(xì)胞的基因組中，同時(shí)該胞嘧啶脫氨酶編碼基因被部分或全部切除并因此失活。駐留胞嘧啶脫氨酶編碼基因的成功失活在培養(yǎng)基包括包含5-氟胞嘧啶的培養(yǎng)基中是可以選擇的，5-氟胞嘧啶通過胞嘧啶脫氨酶轉(zhuǎn)化成有毒的5-氟尿嘧啶。所以，在這樣的轉(zhuǎn)化方法中，胞嘧啶脫氨酶編碼基因起陰性選擇標(biāo)記的作用，如在本發(fā)明的方法中概述的一樣。具有不能測(cè)量的胞嘧啶脫氨酶活性的宿主細(xì)胞適合于這樣的轉(zhuǎn)化方法，在該轉(zhuǎn)化方法中，用包括至少一個(gè)可表達(dá)的編碼胞嘧啶脫氨酶的多核苷酸的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化該宿主細(xì)胞，然后在有利于胞嘧啶脫氨酶表達(dá)的條件下在包括從頭嘧啶合成抑制劑的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中用作陽(yáng)性選擇標(biāo)記。優(yōu)選地，從頭嘧啶合成抑制劑是n-膦乙?；?l-天冬氨酸(pala)，其抑制天冬氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括任意因復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞后代。對(duì)于宿主細(xì)胞的選擇將很大程度取決于編碼多肽的基因及其來(lái)源。宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。本文中使用的“真菌”包括子囊菌門(ascomycota)、擔(dān)子菌門(basidiomycota)、壺菌門(chytridiomycota)和接合菌門(zygomycota)(如在hawksworth等,in,ainsworthandbisby’sdictionaryofthefungi,8thedition,1995,cabinternational,universitypress,cambridge,uk中定義的)以及卵菌門(oomycota)(如在hawksworth等,1995,同上,page171中引用的)和所有有絲分裂的孢子真菌(hawksworth等,1995,同上)。真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。本文中使用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(內(nèi)孢霉目(endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)孢子(basidiosporogenous)酵母以及屬于半知菌類(fungiimperfecti)芽孢綱(blastomycetes)的酵母。因?yàn)榻湍阜诸悓?lái)可能會(huì)變化，出于本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)按biologyandactivitiesofyeast(skinner,f.a.,passmore,s.m.,anddavenport,r.r.,eds,soc.app.bacteriol.symposiumseriesno.9,1980)中的描述來(lái)定義。酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母屬(candida)、漢遜酵母屬(hansenula)、克魯維酵母屬(kluyveromyces)、畢赤酵母屬(pichia)、酵母屬(saccharomyces)、裂殖酵母屬(schizosaccharomyces)、或耶氏酵母屬(yarrowia)細(xì)胞，例如乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)、卡爾酵母(saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(saccharomycesdiastaticus)、saccharomycesdouglasii、克魯弗酵母(saccharomyceskluyveri)、saccharomycesnorbensis、saccharomycesoviformis或解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)細(xì)胞。真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(eumycota)和卵菌門亞門的所有絲狀類型(如hawksworth等,1995，同上，定義的)。絲狀真菌的總體特征為，由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其他復(fù)合多糖構(gòu)成的菌絲體壁。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過菌絲延伸進(jìn)行的，且碳的分解代謝一般是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過單細(xì)胞菌體的出芽來(lái)進(jìn)行的，且碳的分解代謝可以是發(fā)酵的。絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是支頂孢屬(acremonium)、曲霉屬(aspergillus)、短梗霉屬(aureobasidium)、煙管菌屬(bjerkandera)、擬蠟菌屬(ceriporiopsis)、金孢子菌屬(chrysosporium)、鬼傘屬(coprinus)、革蓋菌屬(coriolus)、隱球菌屬(cryptococcus)、filibasidium、鐮孢霉屬(fusarium)、腐質(zhì)霉屬(humicola)、稻瘟菌屬(magnaporthe)、毛霉屬(mucor)、毀絲霉屬(myceliophthora)、neocallimastix、脈孢菌屬(neurospora)、擬青霉屬(paecilomyces)、青霉屬(penicillium)、平革菌屬(phanerochaete)、射脈菌屬(phlebia)、piromyces、側(cè)耳屬(pleurotus)、裂褶菌屬(schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(thermoascus)、梭孢殼屬(thielavia)、彎頸霉屬(tolypocladium)、栓菌屬(trametes)或木霉屬(trichoderma)細(xì)胞。例如，該真菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉(aspergillusawamori)、臭曲霉(aspergillusfoetidus)、煙曲霉(aspergillusfumigatus)、日本曲霉(aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉(aspergillusniger)、米曲霉(aspergillusoryzae)、煙管菌(bjerkanderaadusta)、干擬蠟菌(ceriporiopsisaneirina)、ceriporiopsiscaregiea、淺黃擬蠟孔菌(ceriporiopsisgilvescens)、ceriporiopsispannocinta、ceriporiopsisrivulosa、ceriporiopsissubrufa、蟲擬蠟菌(ceriporiopsissubvermispora)、chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金孢子菌(chrysosporiumkeratinophilum)、chrysosporiumlucknowense、chrysosporiummerdarium、chrysosporiumpannicola、chrysosporiumqueenslandicum、熱帶金孢子菌(chrysosporiumtropicum)、chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(coprinuscinereus)、毛云芝菌(coriolushirsutus)、fusariumbactridioides、fusariumcerealis、fusariumcrookwellense、黃色鐮刀菌(fusariumculmorum)、禾谷鐮孢菌(fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(fusariumgraminum)、異孢鐮孢(fusariumheterosporum)、fusariumnegundi、尖孢鐮刀菌(fusariumoxysporum)、fusariumreticulatum、粉紅色鐮刀菌(fusariumroseum)、接骨木鐮刀菌(fusariumsambucinum)、膚色鐮孢(fusariumsarcochroum)、擬枝孢鐮刀菌(fusariumsporotrichioides)、硫色鐮刀菌(fusariumsulphureum)、fusariumtorulosum、擬絲孢鐮刀菌(fusariumtrichothecioides)、fusariumvenenatum、特異腐質(zhì)霉(humicolainsolens)、柔毛腐質(zhì)霉(humicolalanuginosa)、米赫毛霉(mucormiehei)、嗜熱毀絲菌(myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)、產(chǎn)紫青霉(penicilliumpurpurogenum)、黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、脈射側(cè)菌(phlebiaradiata)、白腐菌(pleurotuseryngii)、太瑞斯梭孢殼霉(thielaviaterrestris)、長(zhǎng)絨毛栓菌(trametesvillosa)、變色栓菌(trametesversicolor)、哈茨木霉菌(trichodermaharzianum)、康寧木霉(trichodermakoningii)、長(zhǎng)梗木霉(trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(trichodermareesei)、或綠色木霉(trichodermaviride)細(xì)胞?？梢酝ㄟ^涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞壁再生的方法以本質(zhì)上已知的方式來(lái)轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。用于曲霉和木霉宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的合適過程在ep238023、yelton等,1984,proc.natl.acad.sci.usa81:1470-1474、和christensen等,1988,bio/technology6:1419-1422中有過描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢菌屬的適當(dāng)方法描述于malardier等,1989,gene78:147-156和wo96/00787中。酵母可以使用在beckerandguarente,inabelson,j.n.andsimon,m.i.,editors,guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology,methodsinenzymology,volume194,pp182-187,academicpress,inc.,newyork；ito等,1983,j.bacteriol.153:163；andhinnen等,1978,proc.natl.acad.sci.usa75:1920中描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。胞嘧啶脫氨酶活性的去除或降低本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，該方法包括使第一方面的多核苷酸或其編碼胞嘧啶脫氨酶的部分滅活、破壞或缺失，結(jié)果產(chǎn)生當(dāng)在同樣的條件下培養(yǎng)時(shí)與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生更少或不產(chǎn)生所編碼的胞嘧啶脫氨酶的突變細(xì)胞?？梢赃\(yùn)用本領(lǐng)域中熟知的方法(例如插入、破壞、取代或缺失)通過減少或消除多核苷酸的表達(dá)來(lái)構(gòu)建突變細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，多核苷酸被失活。例如，待修飾或失活的多核苷酸可以是編碼區(qū)域或其對(duì)于活性而言必需的一部分，或編碼區(qū)域表達(dá)所需的調(diào)控元件。這樣的調(diào)控序列或控制序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或它的功能性部分，即，足以影響該多核苷酸的表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其他控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活因子?？梢酝ㄟ^對(duì)親本細(xì)胞進(jìn)行誘變并選擇其中多核苷酸的表達(dá)降低或消除的突變細(xì)胞，進(jìn)行多核苷酸的修飾或失活。例如，可以通過使用合適的物理或化學(xué)誘變劑、通過使用合適的寡核苷酸或通過對(duì)dna序列進(jìn)行pcr產(chǎn)生的誘變來(lái)進(jìn)行誘變，該誘變可以是特異或隨機(jī)的。此外，可以通過使用這些誘變劑的任意組合進(jìn)行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(uv)照射、羥胺、n-甲基-n'-硝基-n-亞硝基胍(mnng)、o-甲基羥胺、亞硝酸、甲基磺酸乙酯(ems)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些試劑時(shí)，通常通過在合適條件下在選定誘變劑的存在下培育要突變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇表現(xiàn)出降低的基因表達(dá)或沒有該基因表達(dá)的突變細(xì)胞來(lái)進(jìn)行誘變。多核苷酸的修飾或失活可以通過在基因中或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件中插入、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可以插入或除去核苷酸，從而引入終止密碼子、引起起始密碼子的除去或引起開放閱讀框的改變。根據(jù)本領(lǐng)域的已知方法，這樣的修飾或失活可以通過定點(diǎn)誘變或pcr產(chǎn)生的誘變來(lái)實(shí)現(xiàn)。雖然從理論上說(shuō)，可以在體內(nèi)進(jìn)行修飾，即，直接在表達(dá)待修飾的多核苷酸的細(xì)胞上進(jìn)行修飾，但優(yōu)選如下文所示例的在體外進(jìn)行修飾。消除或降低多核苷酸的表達(dá)的方便方法的實(shí)例是基于基因取代、基因缺失或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，在體外對(duì)對(duì)應(yīng)于內(nèi)源多核苷酸的核酸序列進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷的核酸序列，然后將該序列轉(zhuǎn)化到親本細(xì)胞以產(chǎn)生缺陷型基因。通過同源重組，該缺陷核酸序列取代了內(nèi)源多核苷酸?？赡芷谕撊毕菪投嗪塑账徇€編碼可以用于選擇其中多核苷酸已被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記物。在一個(gè)方面，多核苷酸被如本文所描述的這些可選標(biāo)記破壞。本發(fā)明還涉及抑制具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括對(duì)細(xì)胞施用雙鏈rna(dsrna)分子或者在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈rna(dsrna)分子，其中該dsrna包含本發(fā)明多核苷酸的子序列。在優(yōu)選的方面，dsrna是長(zhǎng)約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的雙鏈體(duplex)核苷酸。dsrna優(yōu)選是小干擾rna(sirna)或微rna(mirna)。在優(yōu)選的方面，dsrna是用于抑制轉(zhuǎn)錄的小干擾rna。在另一優(yōu)選的方面，dsrna是用于抑制翻譯的微rna。本發(fā)明還涉及用于抑制細(xì)胞中多肽表達(dá)的這種雙鏈rna(dsrna)分子，其包含seqidno:59的多肽編碼序列的一部分。本發(fā)明不局限于任何特定的作用機(jī)制，dsrna能進(jìn)入細(xì)胞，并引起相似或相同序列的單鏈rna(ssrna)包括內(nèi)源mrna的降解。當(dāng)細(xì)胞暴露于dsrna時(shí)，來(lái)自同源基因的mrna選擇性地通過稱為rna干擾(rnai)的過程被降解。本發(fā)明的dsrna可以用于基因沉默中。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的dsrnai選擇性地降解rna的方法。該方法可以在體外、先體外后體內(nèi)(exvivo)或在體內(nèi)實(shí)踐。在一個(gè)方面，該dsrna分子可以用于在細(xì)胞、器官或動(dòng)物中產(chǎn)生功能喪失突變(loss-of-functionmutation)。制備和使用選擇性降解rna的dsrna分子的方法在本領(lǐng)域中公知；參見，例如，美國(guó)專利no.6,489,127；no.6,506,559；no.6,511,824；和no.6,515,109。本發(fā)明進(jìn)一步涉及親本細(xì)胞的突變細(xì)胞，其包括編碼胞嘧啶脫氨酶多肽的多核苷酸或其控制序列的破壞或缺失或者編碼該多肽的沉默基因，這導(dǎo)致突變細(xì)胞與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的胞嘧啶脫氨酶或不產(chǎn)生胞嘧啶脫氨酶。胞嘧啶脫氨酶缺陷型突變細(xì)胞作為宿主細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化編碼目標(biāo)原生蛋白和異源蛋白的基因是特別有用的。因此，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生原生或異源多肽的方法，其包括：(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。術(shù)語(yǔ)“異源多肽”是指對(duì)于宿主細(xì)胞而言不是原生的多肽，例如，原生多肽的突變體。宿主細(xì)胞可以包括多于一個(gè)拷貝的編碼原生或異源多肽的多核苷酸。用于培養(yǎng)和純化目標(biāo)產(chǎn)物的方法可以用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。重組酶的短暫表達(dá)有眾多眾所周知的簡(jiǎn)單方法來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一方面中步驟(c)的位點(diǎn)特異性重組酶的短暫表達(dá)。首先，有利的是，在引入到細(xì)胞中的核酸構(gòu)建體內(nèi)包含編碼重組酶的多核苷酸，即使使用這種方式，核酸構(gòu)建體在整合后也可以很容易地從細(xì)胞中去除而在染色體中留下剩余的整合目標(biāo)多核苷酸。一個(gè)這樣的方法被用于實(shí)施例中且也在圖1中概括出，其中指示出優(yōu)選的識(shí)別位點(diǎn)對(duì)，即frt-f和frt-f3，以及flp重組酶編碼基因和雙向pyrg標(biāo)記及雙轉(zhuǎn)錄終止子(在圖1中指示為“term”)，其對(duì)于之后通過雙同源重組切除flp基因和pyrg標(biāo)記充當(dāng)同源盒。當(dāng)然，圖1中的術(shù)語(yǔ)僅是實(shí)例且不是意在限制本發(fā)明的范圍，它們可以被其他眾所周知的標(biāo)記和識(shí)別序列對(duì)等替換。在第一方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體(兩側(cè)同樣是該對(duì)識(shí)別序列)進(jìn)一步包括：進(jìn)入選擇標(biāo)記和編碼位點(diǎn)特異性重組酶的多核苷酸，其依次在兩側(cè)是一對(duì)同源盒，它們?nèi)颗c步驟(c)中的目標(biāo)多核苷酸一起整合。優(yōu)選地，該進(jìn)入選擇標(biāo)記使得可以進(jìn)行陽(yáng)性選擇或陰性選擇或者該進(jìn)入選擇標(biāo)記是雙向的。然后，設(shè)想該第一方面的方法包括對(duì)步驟(c)中通過目標(biāo)多核苷酸連同進(jìn)入選擇標(biāo)記和編碼位點(diǎn)特異性重組酶的多核苷酸的雙同源重組進(jìn)行的整合進(jìn)行陽(yáng)性選擇，其中后兩者在兩側(cè)是同源盒。進(jìn)一步地，該方法包括對(duì)進(jìn)入選擇標(biāo)記和編碼位點(diǎn)特異性重組酶的多核苷酸的每個(gè)整合拷貝的切除進(jìn)行陰性選擇的步驟，其中切除通過其側(cè)翼同源盒之間的雙同源重組而進(jìn)行。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，第二核酸構(gòu)建體在步驟(b)中被引入該細(xì)胞中，該第二核酸構(gòu)建體是非復(fù)制型或是溫度敏感復(fù)制型，其包括編碼該位點(diǎn)特異性重組酶的多核苷酸和選擇標(biāo)記，并分別通過選擇壓力或在許可溫度下的生長(zhǎng)而短暫維持在該細(xì)胞內(nèi)，從而使該位點(diǎn)特異性重組酶可以在步驟(c)中短暫表達(dá)，其中該選擇標(biāo)記使得可以進(jìn)行陽(yáng)性選擇或陰性選擇或者其是雙向的。在最后的優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(a)中的細(xì)胞在其染色體內(nèi)包括至少一個(gè)拷貝的與緊密調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子可操作地連接的編碼該位點(diǎn)特異性重組酶的多核苷酸，該啟動(dòng)子可以通過改變生長(zhǎng)條件而被啟動(dòng)或關(guān)閉，例如通過提供特定的碳源或誘導(dǎo)物，從而可以在步驟(c)中進(jìn)行該位點(diǎn)特異性重組酶的短暫表達(dá)。實(shí)施例分子克隆技術(shù)記載于sambrook,j.,fritsch,e.f.，maniatis,t.(1989)《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(molecularcloning：alaboratorymanual)(第2版)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約。酶用于dna操作的酶(如限制性內(nèi)切酶、連接酶等等)可得自newenglandbiolabs，inc.且根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明書使用。培養(yǎng)基和試劑使用以下培養(yǎng)基和試劑除非另有說(shuō)明：用于緩沖劑和底物的化學(xué)品是分析等級(jí)的商品。cove：342.3g/l蔗糖，20ml/lcove鹽溶液，10mm乙酰胺，30g/l諾布爾瓊脂(nobleagar)。cove頂層瓊脂：342.3g/l蔗糖，20ml/lcove鹽溶液，10mm乙酰胺，10g/l低熔點(diǎn)瓊脂糖。cove-2：30g/l蔗糖，20ml/lcove鹽溶液，10mm乙酰胺，30g/l諾布爾瓊脂。cove-n(tf)平板由342.3g蔗糖，20mlcove鹽溶液，3gnano3，以及30g諾布爾瓊脂和水(每升)構(gòu)成。cove-n平板由30g蔗糖，20mlcove鹽溶液，3gnano3，以及30g諾布爾瓊脂和水(每升)構(gòu)成。cove鹽溶液由26gkcl，26gmgso4·7h2o，76gkh2po4以及50mlcove微量金屬和水(每升)構(gòu)成。cove微量金屬溶液由0.04gnab4o7·10h2o，0.4gcuso4·5h2o，1.2gfeso4·7h2o，1.0gmnso4·h2o，0.8g中性淀粉酶iimoo2·2h2o，以及10.0gznso4·7h2o和水(每升)構(gòu)成。cove-n頂層瓊脂由342.3g蔗糖，20mlcove鹽溶液，3gnano3，以及10g低熔點(diǎn)瓊脂糖和水(每升)構(gòu)成。淀粉葡糖苷酶微量金屬溶液由6.8gzncl2·7h2o，2.5gcuso4·5h2o，0.24gnicl2·6h2o，13.9gfeso4·7h2o，13.5gmnso4·h2o以及3g檸檬酸和水(每升)構(gòu)成。ypg由4g酵母提取物，1gkh2po4，0.5gmgso4·7h2o和15g葡萄糖(ph6.0)和水(每升)構(gòu)成。stc緩沖液由0.8m山梨醇，25mmtris(ph8)以及25mmcacl2和水(每升)構(gòu)成。stpc緩沖液由其中含40％peg4000的stc緩沖液構(gòu)成。mlc由40g葡萄糖，50g大豆粉末，4g檸檬酸(ph5.0)和水(每升)構(gòu)成。mss由70g蔗糖，100g大豆粉末(ph6.0)和水(每升)構(gòu)成。mu-1由260g麥芽糖糊精，3gmgso4·7h2o，5gkh2po4，6gk2so4，0.5ml淀粉葡糖苷酶微量金屬溶液，以及2g尿素(ph4.5)和水(每升)構(gòu)成。kcl平板由0.6mkcl，20mlcove鹽溶液，3gnano3以及30g諾布爾瓊脂和水(每升)構(gòu)成。5-氟胞嘧啶儲(chǔ)液：1000mg5-氟胞嘧啶溶解于1ml0.91nacl溶液中。購(gòu)買的材料(大腸桿菌，質(zhì)粒和試劑盒)大腸桿菌dh5-α(toyobo)用于質(zhì)粒構(gòu)建和擴(kuò)增。商業(yè)質(zhì)粒/載體topo克隆試劑盒(invitrogen)和pbluescriptiisk-(stratagene#212206)用于pcr片段的克隆。擴(kuò)增的質(zhì)粒由質(zhì)粒試劑盒(qiagen)回收。用dna連接試劑盒(takara)或t4dna連接酶(boehringermannheim)來(lái)完成連接。用expandtmpcr體系(boehringermannheim)來(lái)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)。qiaquicktm凝膠提取試劑盒(qiagen)用于pcr片段純化和從瓊脂糖凝膠提取dna片段。菌株wo2000/039322中描述了米曲霉bech-2。構(gòu)巢曲霉菌株nrrl1092用作供體株。表達(dá)宿主菌株黑曲霉nn059095由novozymes分離且是從土壤中分離的黑曲霉nn049184的派生物。對(duì)nn059095進(jìn)行基因改造以破壞淀粉葡糖苷酶活性的表達(dá)。wo2005/070962的實(shí)施例11中描述了米曲霉toc1512。質(zhì)粒專利申請(qǐng)wo2006/069289描述了表達(dá)質(zhì)粒phuda440和來(lái)自瓣環(huán)栓菌(trametescingulata)的淀粉葡糖苷酶的核苷酸序列。wo07045248的實(shí)施例9中描述了質(zhì)粒pjal574和單純皰疹病毒(hsv)胸苷激酶基因(tk)、構(gòu)巢曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(pgpd)和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶終止子(ttrpc)的核苷酸序列。專利公開wo2005070962描述了表達(dá)盒質(zhì)粒pjal790和中性淀粉酶ii啟動(dòng)子(pna2)的核苷酸序列。專利申請(qǐng)10729.000-us中描述了ja126淀粉酶表達(dá)載體。專利wo2001/068864的實(shí)施例8中描述了質(zhì)粒pdv8。實(shí)施例10中描述了質(zhì)粒pjal504。實(shí)施例10中描述了質(zhì)粒pjal504-delta-bglll。專利wo2000/050567a1的實(shí)施例1中描述了質(zhì)粒pjal554。質(zhì)粒pjal574記載于實(shí)施例10中。質(zhì)粒pjal835記載于實(shí)施例10中。質(zhì)粒pjal955記載于實(shí)施例10中。質(zhì)粒pjal1022記載于實(shí)施例10中。質(zhì)粒pjal1025記載于實(shí)施例10中。質(zhì)粒pjal1027記載于實(shí)施例10中。質(zhì)粒pjal1029記載于實(shí)施例10中。質(zhì)粒pjal1120記載于實(shí)施例10中。質(zhì)粒pjal1123記載于實(shí)施例10中。質(zhì)粒pjal1183記載于實(shí)施例10中。質(zhì)粒pjal1194記載于實(shí)施例10中。質(zhì)粒pjal1202記載于實(shí)施例10中。專利wo91/17243中記載了質(zhì)粒ptoc65。質(zhì)粒puc19：該構(gòu)建記載于vieira等，1982，基因(gene)19:259-268。質(zhì)粒4blunt來(lái)自invitrogen曲霉的轉(zhuǎn)化曲霉屬菌株的轉(zhuǎn)化可使用用于酵母轉(zhuǎn)化的一般方法實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的優(yōu)選步驟描述如下。將黑曲霉宿主菌株接種至補(bǔ)充10mm尿苷的100mlypg培養(yǎng)基中，并在32℃以80rpm溫育16小時(shí)。收集沉淀，用0.6mkcl洗滌，并重懸于20ml含有終濃度為20mg/ml的市售β-葡聚糖酶產(chǎn)物(glucanextm,novozymesa/s,denmark)的0.6mkcl中。將懸液于32℃在振動(dòng)下(80rpm)溫育直至形成原生質(zhì)體，然后用stc緩沖液洗滌兩次。對(duì)原生質(zhì)體用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，在stc:stpc:dmso為8:2:0.1的溶液中重懸并調(diào)節(jié)至2.5×l07個(gè)原生質(zhì)體/ml的終濃度。將大約4μg的質(zhì)粒dna添加至100μl的原生質(zhì)體懸液，輕柔混合，并在冰上溫育30分鐘。添加1ml的sptc，并將原生質(zhì)體懸液在37℃溫育20分鐘。在添加10ml的50℃cove或cove-n頂層瓊脂糖之后，將反應(yīng)物傾至cove或cove-n(tf)瓊脂平板上，并將平板在32℃溫育5日。其它真菌宿主比如木霉屬菌株的轉(zhuǎn)化也可以使用用于真菌轉(zhuǎn)化的一般方法實(shí)現(xiàn)。用于葡糖淀粉酶產(chǎn)生的sf培養(yǎng)將所選轉(zhuǎn)化子的孢子接種到100mlmlc培養(yǎng)基中，并在30℃下培育2天。將10mlmlc接種到100mlmu-1培養(yǎng)基中，并在30℃下培育7天。通過離心獲得上清液。southern雜交從100mlypg培養(yǎng)基的過夜培養(yǎng)物中收集所選轉(zhuǎn)化子的菌絲體，對(duì)其用蒸餾水漂洗，干燥，并于-80℃冷凍。將研磨的菌絲體在65℃下與蛋白酶k和rnasea一起孵育1小時(shí)。通過酚/chcl3提取兩次，接著進(jìn)行etoh沉淀來(lái)回收基因組dna，并在蒸餾水中重懸。使用pcrdig探針合成試劑盒(rocheappliedscience,indianapolisin)按照制造商的說(shuō)明書來(lái)合成非放射性探針。使用qiaquicktm凝膠提取試劑盒(qiageninc.,valencia,ca)根據(jù)制造商的說(shuō)明書對(duì)dig標(biāo)記的探針進(jìn)行凝膠提純。將5微克基因組dna用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶完全消化16小時(shí)(總體積40μl，4u酶/μldna)，并在0.8％的瓊脂糖凝膠上跑膠。通過0.2mhcl處理，使dna在凝膠中片段化，變性(0.5mnaoh，1.5mnacl)，并中和(1mtris,ph7.5；1.5mnacl)，隨后于20×ssc中轉(zhuǎn)移至hybondn+膜(amersham)。將dna以u(píng)v交聯(lián)到膜上，并在20mldigeasyhyb(rochediagnosticscorporation,mannheim,germany)中于42℃預(yù)雜交1小時(shí)。將變性的探針直接加入到digeasyhyb緩沖液中，并在42℃下進(jìn)行過夜雜交。在雜交后洗滌(于2×ssc中進(jìn)行兩次，室溫，5分鐘，于0.1×ssc中進(jìn)行兩次，68℃，每次15分鐘)，接著按照制造商的操作指南，使用dig檢測(cè)系統(tǒng)和cpd-star(roche)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。將dig標(biāo)記的dna分子量標(biāo)記物ii(roche)用作標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物。葡糖淀粉酶活性葡糖淀粉酶活性以淀粉葡糖苷酶單位(agu)進(jìn)行測(cè)量。agu定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(37℃，ph4.3，底物：麥芽糖23.2mm，緩沖液：醋酸鹽0.1m，反應(yīng)時(shí)間5分鐘)每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶的量?？梢允褂米詣?dòng)分析儀系統(tǒng)。將變旋酶加至葡萄糖脫氫酶試劑中，從而使得存在的任何α-d-葡萄糖均變?yōu)棣?d-葡萄糖。在上述反應(yīng)中葡萄糖脫氫酶特異性地與β-d-葡萄糖反應(yīng)，形成nadh，nadh使用光度計(jì)在340nm下測(cè)定，作為原始葡萄糖濃度的測(cè)量結(jié)果。淀粉葡糖苷酶孵育：顯色反應(yīng)：酸性α-淀粉酶活性的測(cè)定當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用時(shí)，任何酸性α-淀粉酶的活性均可以用afau(酸性真菌α-淀粉酶單位)進(jìn)行測(cè)量，其相對(duì)于酶標(biāo)準(zhǔn)物而測(cè)定。1fau定義為在下述標(biāo)準(zhǔn)條件下每小時(shí)降解5.260mg淀粉干物質(zhì)的酶的量。酸性α-淀粉酶(即酸穩(wěn)定的α-淀粉酶)，內(nèi)切-α-淀粉酶(1,4-α-d-葡聚糖-葡聚糖-水解酶，e.c.3.2.1.1)水解淀粉分子內(nèi)部區(qū)域中的α-1,4-糖苷鍵，形成具有不同鏈長(zhǎng)的糊精和寡糖。與碘形成的顏色強(qiáng)度與淀粉的濃度直接成比例。使用反向比色法將淀粉酶活性測(cè)定為指定分析條件下的淀粉濃度的減少。λ＝590nm藍(lán)/紫t＝23秒脫色標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件：實(shí)施例1.在黑曲霉nn059095的中性淀粉酶i(nai)基因座處引入frt位點(diǎn)構(gòu)建潮霉素b抗性基因表達(dá)質(zhì)粒phuda966基于genbank(id#ab007770)中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入ecori/spei和bamhi位點(diǎn)的以下引物tef-f和tef-r，以分離米曲霉tef1的啟動(dòng)子區(qū)(翻譯延長(zhǎng)因子1/ptef1)：tef-f(seqidno:1)：gaattcactagtggggttcaaatgcaaacaatef-r(seqidno:2)：ggatcctggtgcgaactttgtagtt使用引物對(duì)tef-f和tef-r，以米曲霉菌株bech2的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，從膠上切除0.7kb的產(chǎn)物條帶。將0.7kb擴(kuò)增的dna片段用bamhi和ecori消化，并連接到用bamhi和ecori消化的曲霉表達(dá)盒phuda440中，產(chǎn)生phuda440-ptef。基于embl:d49701中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入xhoi和xbai位點(diǎn)的以下引物nia-f和nia-r，以分離米曲霉硝酸還原酶(niad)的終止子區(qū)(tniad)：nia-f(seqidno:3)：ctcgagattatccaagggaatgacnia-r(seqidno:4)：tctagaaagtattttcggtacgatt使用引物對(duì)nia-f和nia-r，以米曲霉菌株bech2的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除0.5kb的產(chǎn)物條帶。將0.5kb擴(kuò)增的dna片段用xhoi和xbai消化，并連接到用xhoi和xbai消化的曲霉表達(dá)盒phuda440-ptef中，以產(chǎn)生phuda440-ptef-tnia。基于embl:ar109978中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入bamh和xhoi位點(diǎn)的以下引物hph-f和hph-r，以分離潮霉素b抗性基因的編碼區(qū)：hph-f(seqidno:5)：ggatcctacacctcagcaatgtcgcctgaahph-r(seqidno:6)：ctcgagctattcctttgccctcggacgagtgct使用引物對(duì)hph-f和hph-r，以帶有潮霉素b抗性基因(hph)的pjal154作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，從凝膠上切除1.0kb的產(chǎn)物條帶。將1.0kb的擴(kuò)增dna片段用bamhi和xhoi消化，并連接到用bamhi和xhoi消化的曲霉表達(dá)盒phuda440-ptef-tnia中，以產(chǎn)生phuda966。phuda966中潮霉素b抗性基因(hph)表達(dá)部分的核苷酸序列顯示在seqidno:7中，其指示出用于進(jìn)行構(gòu)建的引物的特征位置，所編碼的潮霉素b抗性因子顯示于seqidno:8。構(gòu)建用于在na1基因座處引入frt位點(diǎn)的phuda981通過xhoi和ecori消化，從pjal574中回收含有單純皰疹病毒(hsv)胸苷激酶基因(tk)的2.5kbdna片段。將回收的2.5kb片段連接到經(jīng)xhoi和ecori消化的pbluescriptiisk-。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒ptk。frt-f和frt-f3位點(diǎn)的核苷酸序列為：frt-f(seqidno:9)：ttgaagttcctattccgagttcctattctctagaaagtataggaacttcfrt-f3(seqidno:10)：ttgaagttcctattccgagttcctattcttcaaatagtataggaacttca分別基于embl:am270106和embl:dj052242中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入ecori和spei位點(diǎn)的以下引物3na1-f和3na1-r，分別，以分離融合有frt-f3識(shí)別位點(diǎn)的黑曲霉中性淀粉酶i(nai)的3’側(cè)翼區(qū)：3na1-f(seqidno:11)：actagtttgaagttcctattccgagttcctattcttcaaatagtataggaacttcaactagagtatatgatggtact3na1-r(seqidno:12)：gaattcgcattctcctagttactgatgacttt使用引物對(duì)3na1-f和3na1-r，以黑曲霉nn059095的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除1.0kb的產(chǎn)物條帶。將1.5kb的擴(kuò)增dna片段用spei和ecori消化，并連接到用ecori和spei消化的曲霉表達(dá)盒ptk中，以產(chǎn)生phudatk-3na1。分別基于embl:am270106和embl:dj052242中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入noti和spei位點(diǎn)的以下引物5na1-f和5na1-r，以分離融合有frt-f識(shí)別位點(diǎn)的黑曲霉中性淀粉酶i(nai)的5’側(cè)翼區(qū)：5na1-f(seqidno:13)：gcggccgcgtttaaacctatctgttccc5na1-r(seqidno:14)：actagtgctagcgaagttcctatactttctagagaataggaactcggaataggaacttcaagatgaattcgcggcctacatg使用引物對(duì)5na1-f和5na1-r，以黑曲霉nn059095的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除1.8kb的產(chǎn)物條帶。將1.8kb的擴(kuò)增dna片段用noti和spei消化，并連接到用noti和spei消化的曲霉表達(dá)盒ptk-3na1中，以產(chǎn)生phudatk-3na1-5na1。通過xbai和nhei消化，從phuda966中回收含有由米曲霉tefl啟動(dòng)子(ptef)和niad終止子(tniad)驅(qū)動(dòng)的潮霉素b抗性基因的2.2kbdna片段。將回收的2.2kb片段連接到spei消化的phudatk-3na1-5na1。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒phuda981。phuda981的na1編碼部分和側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列顯示于seqidno:15，na1顯示于seqidno:16，且質(zhì)粒圖譜顯示于圖2。在黑曲霉nn059095的na1基因座處引入frt位點(diǎn)將phuda981引入到黑曲霉菌株nn059095中。從補(bǔ)充有10mm尿苷和1mm潮霉素b的cove-n(tf)中選擇轉(zhuǎn)化子。將隨機(jī)選擇的轉(zhuǎn)化子接種到具有10mm尿苷、1mm潮霉素b和2.5μm5-氟-2-脫氧尿苷(fdu)(一種殺死對(duì)在phuda981中攜帶的單純皰疹病毒(hsv)胸苷激酶基因(tk)進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞的試劑)的cove-n平板上。對(duì)在補(bǔ)充有2.5μmfdu的cove-n平板上生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行純化，并進(jìn)行southern印跡分析以證實(shí)phuda981中的frt位點(diǎn)是否正確引入。使用以下用于非放射性探針的引物組來(lái)分析所選擇的轉(zhuǎn)化子。對(duì)于5’na1側(cè)翼區(qū)：正向引物(seqidno:17)：aatccggatcctttcctata反向引物(seqidno:18)：gatggagcgcgcctagaagc對(duì)從所選擇的轉(zhuǎn)化子中提取的基因組dna用ncoi消化，并使用上述探針進(jìn)行southern印跡分析。通過2.8kbncoi條帶的消失和3.1kbncoi條帶的出現(xiàn)來(lái)識(shí)別目標(biāo)菌株。在這些給出正確整合事件的菌株當(dāng)中，選擇出稱作nn059180的菌株。實(shí)施例2.在黑曲霉nn059095的酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座處引入frt位點(diǎn)構(gòu)建構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因(amds)表達(dá)質(zhì)粒phuda976.基于embl:af348620中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入bamhi和xhoi位點(diǎn)的以下引物amds-f和amds-r，以分離amds基因的編碼區(qū)：amds-f(seqidno:19)：ggatccaccatgcctcaatcctggamds-r(seqidno:20)：ctcgagctatggagtcaccacatttcccag使用引物對(duì)amds-f和amds-r，以構(gòu)巢曲霉菌株nrrl1092的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除1.0kb的產(chǎn)物條帶。將1.9kb的擴(kuò)增dna片段用bamhi和xhoi消化，并連接到用bamhi和xhoi消化的曲霉表達(dá)盒phuda440-ptef-tnia中，以產(chǎn)生phuda976。phuda976中構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因(amds)表達(dá)部分的核苷酸序列顯示于seqidno:21，具有所使用的引物的基因特征位置，所編碼的乙酰胺酶氨基酸序列顯示于seqidno:22。構(gòu)建用于在酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座處引入frt位點(diǎn)的phuda1019分別基于embl:am270232和embl:dj052242的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入ecori和spei位點(diǎn)的以下引物3sp-f和3sp-r，以分離融合有frt-f3識(shí)別位點(diǎn)的黑曲霉酸穩(wěn)定性淀粉酶的3’側(cè)翼區(qū)：3sp-f(seqidno:23)：actagtttgaagttcctattccgagttcctattcttcaaatagtataggaacttcaactagagaatgcaatcataacagaaagta3sp-r(seqidno:24)：gaattcttaattaaatcacggcaagggtttac使用引物對(duì)3sp-f和3sp-r，以黑曲霉nn059095的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除1.8kb的產(chǎn)物條帶。將1.8kb的擴(kuò)增dna片段用spei和ecori消化，并連接到用ecori和spei消化的曲霉表達(dá)盒ptk，以產(chǎn)生phudatk-3sp。分別基于embl:am270232和embl:dj052242中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入sacii和spei位點(diǎn)的以下引物5sp-f和5sp-r，以分離融合有frt-f識(shí)別位點(diǎn)的黑曲霉酸穩(wěn)定性淀粉酶的5’側(cè)翼區(qū)：5sp-f(seqidno:25)：ccgcggcaacaggcagaatatcttcc5sp-r(seqidno:26)：actagtgaagttcctatactttctagagaataggaactcggaataggaacttcaaacgggatcttggacgcattcca使用引物對(duì)5sp-f和5sp-r，以黑曲霉nn059095的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除2.0kb的產(chǎn)物條帶。將2.0kb的擴(kuò)增dna片段用sacii和spei消化，并連接到用sacii和spei消化的曲霉表達(dá)盒ptk-3sp，以產(chǎn)生phudatk-3sp-5sp。通過xbai和nhei消化，從phuda976中回收含有由米曲霉tefl啟動(dòng)子和niad終止子驅(qū)動(dòng)的amds基因的3.1kbdna片段。將回收的3.1kb片段連接到spei消化的phudatk-3sp-5sp。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒phuda1019。具有phuda1019側(cè)翼序列的黑曲霉酸穩(wěn)定性淀粉酶基因的核苷酸序列顯示于seqidno:27，所編碼的淀粉酶氨基酸序列顯示于seqidno:28；質(zhì)粒圖譜顯示在圖3中。在黑曲霉nn059180中的基因座處引入frt位點(diǎn)將phuda1019引入到黑曲霉菌株nn059180中。從補(bǔ)充有10mm尿苷的cove(tf)中選擇轉(zhuǎn)化子。將隨機(jī)選擇的轉(zhuǎn)化子接種到具有10mm尿苷和2.5μm5-氟-2-脫氧尿苷(fdu)(一種殺死對(duì)在phuda1019中攜帶的單純皰疹病毒(hsv)胸苷激酶基因(tk)進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞的試劑)的cove-2平板上。將在具有2.5μmfdu的cove-2平板上生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行純化，并進(jìn)行southern印跡分析，以確認(rèn)phuda1019中的frt位點(diǎn)是否正確引入。使用用于非放射性探針的以下引物組來(lái)分析所選擇的轉(zhuǎn)化子。對(duì)于5’酸穩(wěn)定性淀粉酶?jìng)?cè)翼區(qū)：正向引物(seqidno:29)：cgtacaccttgggattatgcgctg反向引物(seqidno:30)：cacaaaggcgcaaagcataccatc將從所選擇的轉(zhuǎn)化子中提取的基因組dna用xhoi消化。通過6.2kbxhoi條帶的消失和4.1kbxhoi條帶的出現(xiàn)來(lái)識(shí)別正確的整合事件。在這些具有正確整合結(jié)果的菌株中，選擇稱作nn059183的菌株。實(shí)施例3.在兩個(gè)基因座中通過flp進(jìn)行同時(shí)位點(diǎn)特異性整合構(gòu)建構(gòu)巢曲霉pyrg基因表達(dá)質(zhì)粒phuda794基于embl:m19132中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)以下引入paci位點(diǎn)的引物pyr-f以及pyr-r，以分離構(gòu)巢曲霉pyrg基因的啟動(dòng)子和編碼區(qū)：pyr-f(seqidno:31)：ttaattaaactaaatgacgtttgtgaacapyr-r(seqidno:32)：ctaccgccaggtgtcagtcaccctcaaagtccaactcttttc基于embl:am270061和dj052242中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)引入sphi位點(diǎn)的以下引物tamg-f和tamg-r，以分離融合有frt-f3識(shí)別位點(diǎn)的黑曲霉淀粉葡糖苷酶(tamg)基因的終止子區(qū)域：tamg-f(seqidno:33)：agagttggactttgagggtgactgacacctggcggtagtamg-r(seqidno:34)：gcatgcactagctagttgaagttcctatactatttgaagaataggaactcggaataggaacttcaacctagaggagagagttg使用引物對(duì)pyr-f和pyr-r，以構(gòu)巢曲霉菌株nrrl1092的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除1.4kb的產(chǎn)物條帶。使用引物對(duì)tamg-f和tamg-r，以黑曲霉nn059095的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除0.8kb的產(chǎn)物條帶。使用引物對(duì)pyr-f和tamg-r，對(duì)1.4kb和0.8kb的擴(kuò)增dna片段進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除2.2kb的產(chǎn)物條帶。使用試劑盒，按照操作指南，將2.2kb的擴(kuò)增dna片段包裝到invitrogen提供的topo克隆載體(pcr2.1topo)中，以產(chǎn)生phuda794。phuda794中具有側(cè)翼序列的構(gòu)巢曲霉pyrg基因的核苷酸序列，連同所用引物的特征和位置顯示于seqidno:35；所編碼的pyrg的氨基酸序列顯示于seqidno:36。構(gòu)建flp基因合成版本的表達(dá)質(zhì)粒phuda996基于embl:z49892中的核苷酸序列信息，分別設(shè)計(jì)引入sphi位點(diǎn)和bamhi位點(diǎn)的以下引物xln-f和xln-r，來(lái)分離構(gòu)巢曲霉xlna基因的啟動(dòng)子區(qū)(pxlna)：xln-f(seqidno:37)：gcatgcttaattaatggaagtgcgttgatcattxln-r(seqidno:38)：ggatcccctgtcagttggg使用引物對(duì)xln-f和xln-r，以構(gòu)巢曲霉菌株nrrl1092的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除0.7kb的產(chǎn)物條帶。將0.7kb的擴(kuò)增dna片段用bamhi和sphi消化，并連接到用bamhi和sphi消化的曲霉表達(dá)盒phuda966中，以產(chǎn)生phuda966-pxlna。通過bamhi和xhoi消化，從pjal1008中回收含有flp基因合成版本(sflp)的1.3kbdna片段。將回收的1.3kb片段連接到bamhi和xhoi消化的phuda966-pxlna。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒phuda996。phuda996中flp表達(dá)部分的合成版本的核苷酸序列，與所用引物的特征和位置一起顯示于seqidno:39；所編碼的sflp的氨基酸序列顯示于seqidno:40。構(gòu)建用于在nn059183的中性淀粉酶1(na1)和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座處同時(shí)進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合的phuda1000基于pjal790和embl:dj052242中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入ecori位點(diǎn)和bamhi位點(diǎn)的以下引物pna-f和pna-r，以分離融合有frt-f識(shí)別位點(diǎn)的三重串聯(lián)的黑曲霉中性淀粉酶ii(na2)基因的啟動(dòng)子區(qū)(pna2)：pna-f(seqidno:41)：gaattcatcttgaagttcctattccgagttcctattctctagaaagtataggaacttcgctagccgagagcagcttgaagapna-r(seqidno:42)：ggatcccccagttgtgtatatagaggatt使用引物對(duì)pna-f和pna-r，以pjal790作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除1.7kb的產(chǎn)物條帶。將1.7kb的擴(kuò)增dna片段用ecori和bamhi消化，并連接到用ecori和bamhi消化的攜帶有來(lái)自瓣環(huán)栓菌的淀粉葡糖苷酶基因(t.c.ga)的曲霉表達(dá)盒phuda440，以產(chǎn)生phuda440-frt。通過paci和sphi消化，從phuda794中回收含有構(gòu)巢曲霉pyrg基因的2.2kbdna片段。將回收的2.2kb片段連接到paci和sphi消化的phuda440-frt。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒phuda440-frt-pyrg。通過paci和xbai消化，從phuda996中回收含有由xlna啟動(dòng)子和niad終止子驅(qū)動(dòng)的flp基因的2.4kbdna片段。將回收的2.4kb片段連接到paci和xbai消化的phuda440-frt-pyrg。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒phuda1000。質(zhì)粒圖譜顯示于圖4。通過flp進(jìn)行的同時(shí)位點(diǎn)特異性整合將phuda1000引入到黑曲霉菌株nn059183中。從補(bǔ)充有1％d-木糖的cove-n(tf)中選擇轉(zhuǎn)化子。將隨機(jī)選擇的轉(zhuǎn)化子接種到cove-n平板上。將在cove-n平板上生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行純化，并進(jìn)行southern印跡分析，以確認(rèn)phuda1000中的表達(dá)部分是否正確引入。使用用于非放射性探針的以下引物組來(lái)分析所選擇的轉(zhuǎn)化子。對(duì)于t.c.ga編碼區(qū)：正向引物(seqidno:43)：tcgagtgcggccgacgcgtacgtc反向引物(seqidno:44)：cagagagtgttggtcacgta將從所選擇的轉(zhuǎn)化子中提取的基因組dna用hindiii消化，并使用上述探針進(jìn)行southern印跡分析。通過2.8kbncoi條帶的消失和3.1kbncoi條帶的出現(xiàn)來(lái)識(shí)別目標(biāo)菌株。通過正確的整合事件，觀察到分別在na1和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座處引入的7.2kb和5.7kb大小的兩個(gè)雜交信號(hào)。圖5示出當(dāng)phuda1000正確引入到nn059183中時(shí)的示意性na1(上圖)和酸穩(wěn)定性淀粉基因座(下圖)。實(shí)施例4.nn059183中黑曲霉ku70基因的破壞構(gòu)建黑曲霉ku70基因破壞載體phuda801基于embl:am270339的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入ecori位點(diǎn)和spei位點(diǎn)的以下引物3ku-f和3ku-r，以分離黑曲霉ku70基因的3’側(cè)翼區(qū)：3ku-f(seqidno:45)：actagttctagaagccgtgggtatttttatgaa3ku-r(seqidno:46)：gaattcgtttaaacttggcggctgccaagcttcc使用引物對(duì)3ku-f和3ku-r，以黑曲霉菌株nn059183的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除2.0kb的產(chǎn)物條帶。將2.0kb的擴(kuò)增dna片段用ecori和spei消化，并連接到用ecori和spei消化的ptk中，以產(chǎn)生ptk-3ku?；趀mbl:am270339的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入noti位點(diǎn)和spei位點(diǎn)的以下引物5ku-f和5ku-r，以分離黑曲霉ku70基因的5’側(cè)翼區(qū)：5ku-f(seqidno:47)：gcggccgctcattcagagagctacccgt5ku-r(seqidno:48)：actagttaattaagaggaccgcatctttga使用引物對(duì)5ku-f和5ku-r，以黑曲霉菌株nn059183的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除1.3kb的產(chǎn)物條帶。將1.3kb的擴(kuò)增dna片段用noti和spei消化，并連接到用noti和spei消化的ptk-3ku中，以產(chǎn)生ptk-3ku-5ku。通過spei和xbai消化，從phuda794中回收含有構(gòu)巢曲霉pyrg基因的2.2kbdna片段。將回收的2.2kb片段連接到spei和xbai消化的ptk-3ku-5ku。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒phuda801。phuda801中黑曲霉ku70基因和側(cè)翼序列的核苷酸序列顯示于seqidno:49；ku70所編碼多肽的氨基酸序列顯示于seqidno:50；質(zhì)粒圖譜顯示于圖6。nn059183中ku70基因破壞將phuda801引入到黑曲霉菌株nn059183中。從cove-n(tf)中選擇轉(zhuǎn)化子。將隨機(jī)選擇的轉(zhuǎn)化子接種到具有2.5μm5-氟-2-脫氧尿苷(fdu)(一種殺死對(duì)在phuda801中攜帶的單純皰疹病毒(hsv)胸苷激酶基因(tk)進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞的試劑)的cove-n平板上。將在具有2.5μmfdu的cove-n平板上生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行純化，并進(jìn)行southern印跡分析，以確認(rèn)ku70基因是否正確地破壞。使用用于非放射性探針的以下引物組來(lái)分析所選擇的轉(zhuǎn)化子。對(duì)于3’ku70側(cè)翼區(qū)：正向引物(seqidno:51)：acggtatgcgtacaatgatca反向引物(seqidno:52)：atttgagggcaccagcacccc將從所選擇的轉(zhuǎn)化子中提取的基因組dna用spei消化。通過正確的基因破壞事件，經(jīng)spei消化的8.3kb大小的雜交信號(hào)變換至被上述探針探測(cè)的5.1kb。在這些具有正確整合事件的菌株中，選擇稱作c1997的菌株。實(shí)施例5.在c1997中的兩個(gè)基因座處通過flp進(jìn)行同時(shí)位點(diǎn)特異性整合c1997中的pyrg基因拯救首先，如下對(duì)c1997中ku70基因座處引入的pyrg基因進(jìn)行拯救。將菌株c1997接種一次到含有10mm尿苷和1g/l5-氟-乳清酸(5-foa)的cove-n培養(yǎng)基中。在5-foa的存在下，pyrg基因已經(jīng)缺失的菌株將會(huì)生長(zhǎng)；那些保留該基因的菌株會(huì)將5-foa轉(zhuǎn)化為有毒中間體5-氟-ump。分離出生長(zhǎng)更加迅速的菌落。所分離的菌株命名為m1117。在m1117中通過flp進(jìn)行的同時(shí)位點(diǎn)特異性整合將phuda1000引入到黑曲霉菌株m1117中。從補(bǔ)充有1g/ld-木糖的cove-n(tf)中選擇轉(zhuǎn)化子。將隨機(jī)選擇的轉(zhuǎn)化子接種到cove-n平板上。將在cove-n平板上生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行純化，并進(jìn)行southern印跡分析，以證實(shí)phuda1000中的表達(dá)部分是否正確引入。使用用于非放射性探針的以下引物組來(lái)分析所選擇的轉(zhuǎn)化子。對(duì)于t.c.ga編碼區(qū)：正向引物(seqidno:53)：tcgagtgcggccgacgcgtacgtc反向引物(seqidno:54)：cagagagtgttggtcacgta將從所選擇的轉(zhuǎn)化子中提取的基因組dna用hindiii消化。通過正確的整合事件，觀察到分別在na1和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座處引入的7.2kb和5.7kb大小的兩個(gè)雜交信號(hào)。ku70基因破壞(m1117)的同時(shí)整合頻率為約20％，而ku70基因沒有破壞(nn059183)的為約4～5％。這表明，ku70基因破壞在改善經(jīng)由flp的基因座特異性整合頻率中發(fā)揮重要作用。實(shí)施例6.nn059183中黑曲霉fcy1基因破壞構(gòu)建黑曲霉(胞嘧啶脫氨酶)fcy1基因破壞載體phuda1043基于embl:am269962中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入xbai位點(diǎn)和pmei位點(diǎn)的以下引物3fcy-f和3fcy-r，以分離黑曲霉fcy1基因的3’側(cè)翼區(qū)：3fcy-f(seqidno:55)：tctagaattgaaagctagttctggtcgcat3fcy-r(seqidno:56)：gtttaaactccttgcttcgcatacatgcccac以黑曲霉菌株nn059183的基因組dna作為模板，使用引物對(duì)3fcy-f和3fcy-r，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除2.0kb的產(chǎn)物條帶。將2.0kb的擴(kuò)增dna片段用xbai和pmei消化，并連接到用xbai和pmei消化的phuda801中，以創(chuàng)建phuda801-3fcy?；趀mbl:am269962中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入noti位點(diǎn)和spei位點(diǎn)的以下引物5fcy-f和5fcy-r，以分離黑曲霉fcy1基因的5’側(cè)翼區(qū)：5fcy-f(seqidno:57)：gcggccgccgccgccgaagaactgagcaaa5fcy-r(seqidno:58)：actagtatatcttcttatcgcagagattg以黑曲霉菌株nn059183的基因組dna作為模板，使用引物對(duì)5fcy-f和5fcy-r，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除2.1kb的產(chǎn)物條帶。將2.1kb的擴(kuò)增dna片段用noti和spei消化，并連接到用noti和spei消化的phuda801-3fcy中，以創(chuàng)建phuda1043。phuda1043中黑曲霉fcy1基因的核苷酸序列和側(cè)翼序列顯示于seqidno:59；fcy1所編碼多肽的氨基酸序列顯示于seqidno:60。質(zhì)粒圖譜顯示于圖7。nn059183中fcy1基因破壞將phuda1043引入到黑曲霉菌株nn059183中。從cove-n(tf)中選擇轉(zhuǎn)化子。將隨機(jī)選擇的轉(zhuǎn)化子接種到具有2.5μmfdu(一種殺死對(duì)在phuda1043中攜帶的單純皰疹病毒(hsv)胸苷激酶基因(tk)進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞的試劑)的cove-n平板上。將在具有2.5μmfdu的cove-n平板和具有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n平板上生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行純化，并進(jìn)行southern印跡分析，以確認(rèn)fcy1基因是否正確地被破壞。使用用于非放射性探針的以下引物組來(lái)分析所選擇的轉(zhuǎn)化子。對(duì)于3’fcy1側(cè)翼區(qū)：正向引物(seqidno:61)：gaaagctagttctggtcgcattgagc反向引物(seqidno:62)：gaagttgaaggagatgggtctgga將從所選擇的轉(zhuǎn)化子中提取的基因組dna用nhei和xhoi消化，并使用上述探針進(jìn)行southern印跡分析。通過3.1kbnhei-xhoi條帶的消失和2.0kbnhei-xhoi條帶的出現(xiàn)來(lái)識(shí)別目標(biāo)菌株。在這些具有正確整合事件的菌株中，選擇菌株nn059186。實(shí)施例7.在黑曲霉nn059186的中性淀粉酶ii(na2)基因座處引入frt位點(diǎn)和黑曲霉fcy1基因nn059186中pyrg基因拯救首先，如下對(duì)nn059186中在fcy1基因座處引入的pyrg基因進(jìn)行拯救。將菌株nn059186接種一次到含有10mm尿苷和1g/l5-氟-乳清酸(5-foa)的cove-n培養(yǎng)基中。在5-foa的存在下，pyrg基因已經(jīng)缺失的菌株將會(huì)生長(zhǎng)；那些保留該基因的菌株會(huì)將5-foa轉(zhuǎn)化為毒性中間體5-氟-ump。分離出生長(zhǎng)更加迅速的菌落。所分離的菌株命名為nn059200。構(gòu)建用于在na2基因座處引入frt位點(diǎn)和黑曲霉fcy1的phuda1078基于embl:am270278和dj052242中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入xbai位點(diǎn)和pmei位點(diǎn)的以下引物3na2-f和3na2-r，以分離融合有frt-f3位點(diǎn)的黑曲霉na2基因的3’側(cè)翼區(qū)：3na2-f(seqidno:63)：tctagattgaagttcctattccgagttcctattcttcaaatagtataggaacttcatgtctccatgtttcttgagcggaagtact3na2-r(seqidno:64)：gtttaaacgaagactgatattatggcggaa以黑曲霉菌株nn059183的基因組dna作為模板，使用引物對(duì)3na2-f和3na2-r，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除2.1kb的產(chǎn)物條帶。將2.1kb的擴(kuò)增dna片段用xbai和pmei消化，并連接到用xbai和pmei消化的phuda801，以創(chuàng)建phuda801-3na2?；趀mbl:am270278和dj052242中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入noti位點(diǎn)和spei位點(diǎn)的以下引物5na2-f和5na2-r，以分離融合有frt-f位點(diǎn)的黑曲霉na2基因的5’側(cè)翼區(qū)：5na2-f(seqidno:65)：gcggccgcaagagtcaaaagatagcagagc5na2-r(seqidno:66)：actagtgctagcgaagttcctatacttgaataggaactcggaataggaacttcaagatgaattcgcggccggccgcatg以黑曲霉菌株nn059183的基因組dna作為模板，使用引物對(duì)5na2-f和5na2-r，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除2.0kb的產(chǎn)物條帶。將2.0kb的擴(kuò)增dna片段用noti和spei消化，并連接到用noti和spei消化的phuda801-3na2中，以創(chuàng)建phuda801-3na2-5na2。通過nhei和xbai消化，從phuda440-frt中回收含有由三重串聯(lián)na2啟動(dòng)子(pna2)和amg終止子(tamg)驅(qū)動(dòng)的t.c.ga基因的4.3kbdna片段。將回收的4.3kb片段連接到nhei和xbai消化的phuda801-3na2-5na2。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，以創(chuàng)建表達(dá)質(zhì)粒phuda801-3na2-5na2-tc。通過speii和xbai消化，從phuda794中回收含有構(gòu)巢曲霉pyrg基因的2.1kbdna片段。將回收的2.1kb片段連接到xbai部分消化的phuda801-3na2-5na2-tc。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，以創(chuàng)建表達(dá)質(zhì)粒phuda801-3na2-5na2-tc-pyrg?；趀mbl:am269962中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)在兩個(gè)位點(diǎn)處均引入nhei位點(diǎn)的以下引物fcy-f和fcy-r，以分離黑曲霉fcy1基因的整個(gè)區(qū)域：fcy-f(seqidno:67)：gctagcgcgaggctatcacggaggctgtggfcy-r(seqidno:68)：gctagcttctgtggttcttgccatgatcgt以黑曲霉菌株nn059183的基因組dna作為模板，使用引物對(duì)fcy-f和fcy-r，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除1.5kb的產(chǎn)物條帶。將1.5kb的擴(kuò)增dna片段用nhei消化，并連接到用nhei消化的phuda801-3na2-5na2-tc-pyrg，以創(chuàng)建phuda1078。phuda1078中黑曲霉na2基因及側(cè)翼序列的核苷酸序列顯示于seqidno:69；na2所編碼多肽的氨基酸序列顯示于seqidno:70。phuda1078&1067(見下)中黑曲霉fcy1的核苷酸序列顯示于seqidno:71，且fcy1編碼的氨基酸序列顯示于seqidno:72。phuda1078的質(zhì)粒圖譜顯示于圖8。在黑曲霉nn059200的na2基因座處引入frt位點(diǎn)和黑曲霉fcy1基因及t.c.ga將phuda1078引入到黑曲霉菌株nn059200中。從cove-n(tf)中選擇轉(zhuǎn)化子。將隨機(jī)選擇的轉(zhuǎn)化子接種到具有2.5μm5-氟-2-脫氧尿苷(fdu)的cove-n平板上。將在具有2.5μmfdu的cove-n平板上生長(zhǎng)良好并在具有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n平板上幾乎不生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行純化，并進(jìn)行southern印跡分析，以確認(rèn)frt位點(diǎn)和fcy1/t.c.ga基因是否正確引入在na2基因座上。使用用于非放射性探針的以下引物組來(lái)分析所選擇的轉(zhuǎn)化子。對(duì)于t.c.ga編碼區(qū)：正向引物(seqidno:73)：tcgagtgcggccgacgcgtacgtc反向引物(seqidno:74)：cagagagtgttggtcacgta將從所選擇的轉(zhuǎn)化子中提取的基因組dna用spei消化。通過正確的基因引入事件，觀察到如上所述被探針探測(cè)到的spei消化的4.4kb大小的雜交信號(hào)。在具有正確整合事件的菌株中，選擇菌株nn059203。實(shí)施例8.在黑曲霉nn059203的中性淀粉酶i(na1)和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座處引入frt位點(diǎn)和黑曲霉fcy1基因以及t.c.ga基因nn059203中pyrg基因拯救如下對(duì)nn059203中na2基因座處引入的pyrg基因進(jìn)行拯救。將菌株nn059203接種一次到含有10mm尿苷和1g/l5-氟-乳清酸(5-foa)的cove-n培養(yǎng)基中。在5-foa的存在下，pyrg基因已經(jīng)缺失的菌株將會(huì)生長(zhǎng)；那些保留該基因的菌株會(huì)將5-foa轉(zhuǎn)化為毒性中間體5-氟-ump。分離出生長(zhǎng)更加迅速的菌落。分離菌株命名為nn059207。構(gòu)建用于在na1和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座處引入frt位點(diǎn)和黑曲霉fcy1的phuda1067設(shè)計(jì)在兩個(gè)位點(diǎn)處均引入xbai位點(diǎn)的以下引物bac-f和bac-r，以分離融合有frt-f和frt-f3位點(diǎn)的pbluescriptiisk-的載體序列：bac-f(seqidno:75)：tctagagaataggaactcggaataggaacttcaagatgaattcgcggccgcgbac-r(seqidno:76)：tctagattgaagttcctattccgagttcctattcttcaaatagtataggaacttcagcatgcaagcttggcctccgc以pbluescriptiisk-作為模板，使用引物對(duì)bac-f和bac-r進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除2.7kb的產(chǎn)物條帶。將2.7kb的擴(kuò)增dna片段用xbai消化，并連接到用xbai消化的phuda1078，以創(chuàng)建phuda1078-na2。設(shè)計(jì)在兩個(gè)位點(diǎn)處均引入paci位點(diǎn)的以下引物flp-f和flp-r，分離由構(gòu)巢曲霉木聚糖酶啟動(dòng)子(pxlna)和米曲霉niad終止子(tniad)驅(qū)動(dòng)的flp表達(dá)盒：flp-f(seqidno:77)：ttaattaatggaagtgcgttgatcattattflp-r(seqidno:78)：ttaattaaactagtggagcgaaccaagtga以phuda996作為模板，使用引物對(duì)flp-f和flp-r，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除2.4kb的產(chǎn)物條帶。將2.4kb的擴(kuò)增dna片段用paci消化，并連接到用paci消化的phuda1078-na2中，以創(chuàng)建phuda1067。質(zhì)粒圖譜顯示于圖9。在黑曲霉nn059207的na1和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座處引入frt位點(diǎn)和黑曲霉fcy1基因和t.c.ga基因?qū)huda1067引入到黑曲霉菌株nn059207中。從補(bǔ)充有1％d-木糖的cove-n(tf)中選擇轉(zhuǎn)化子。將隨機(jī)選擇的轉(zhuǎn)化子接種到cove-n平板上。將在cove-n平板上生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行純化，并進(jìn)行southern印跡分析，以確認(rèn)phuda1067中的frt位點(diǎn)和fcy1基因是否在na1和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座處正確引入。使用用于非放射性探針的以下引物組來(lái)分析所選擇的轉(zhuǎn)化子。對(duì)于t.c.ga編碼區(qū)：正向引物(seqidno:79)：tcgagtgcggccgacgcgtacgtc反向引物(seqidno:80)：cagagagtgttggtcacgta將從所選擇的轉(zhuǎn)化子中提取的基因組dna用hindiii消化。通過正確的基因引入事件，當(dāng)如上所述用探針探測(cè)時(shí)，觀察到hindiii消化的8.7kb(na1)、7.2kb(酸穩(wěn)定性淀粉酶)和5.6kb(na2)大小的雜交信號(hào)。在具有正確的3個(gè)拷貝整合事件的菌株中，選擇稱作nn059208的菌株。圖10示出nn059208中的示意性na1基因座(上)、na2基因座(中)和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座(下)。將分別具有1個(gè)拷貝和3個(gè)拷貝t.c.ga基因的nn059203和nn059208在搖瓶中發(fā)酵，并按照上述材料和方法測(cè)量其酶活(agu活性)；結(jié)果示于以下表1。通過用phuda1000轉(zhuǎn)化nn059183或c1997而生成的雙拷貝t.c.ga菌株(1000-7、1000-18)也進(jìn)行發(fā)酵。菌株宿主質(zhì)粒t.c.ga拷貝agu相對(duì)活性nn059203nn059183phuda107811.001000-7nn059183phuda100021.98～2.081000-18c1997phuda100021.96～2.10nn059208nn059203phuda106732.87～3.00表1.1個(gè)、2個(gè)和3個(gè)拷貝菌株的agu活性，其中將nn059203標(biāo)準(zhǔn)化為1.00。實(shí)施例9.通過flp在nn059208的3個(gè)基因座(na1、na2和酸穩(wěn)定性淀粉酶)中將t.c.ga基因同時(shí)基因交換為ja126淀粉酶基因nn059208中pyrg基因拯救首先，如下對(duì)在nn059208的na1和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座處引入的pyrg基因進(jìn)行拯救。將菌株nn059208接種一次到含有10mm尿苷和1g/l5-氟-乳清酸(5-foa)的cove-n培養(yǎng)基中。在5-foa的存在下，pyrg基因已經(jīng)缺失的菌株將會(huì)生長(zhǎng)；那些保留該基因的菌株會(huì)將5-foa轉(zhuǎn)化為毒性中間體5-氟-ump。分離出生長(zhǎng)更加迅速的菌落。分離的菌株命名為nn059209。構(gòu)建用于在三個(gè)基因座處引入ja126淀粉酶基因的prika147通過nhei消化，從phuda1067中移除含有黑曲霉fcy1基因的1.5kbdna片段。將回收的1.5kb片段重連。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，以創(chuàng)建表達(dá)質(zhì)粒phuda1067-fcy。設(shè)計(jì)分別引入bamhi位點(diǎn)和pmli位點(diǎn)的以下引物126-f和126-r，來(lái)分離ja126淀粉酶的編碼區(qū)，該編碼區(qū)包含黑曲霉酸穩(wěn)定性淀粉酶的分泌信號(hào)序列、微小根毛霉(rhizomucorpusillus)淀粉酶的催化結(jié)構(gòu)域和黑曲霉葡糖淀粉酶的接頭和淀粉結(jié)合域：126-f(seqidno:81)：ggatccaccatgcggctctccacatcc126-r(seqidno:82)：cacgtgtgattacggacacaatccgttattja126淀粉酶基因的核苷酸序列顯示于seqidno:83，且所編碼的氨基酸序列顯示于seqidno:84。以pja126an作為模板，使用引物對(duì)126-f和126-r進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并從凝膠上切除1.9kb的產(chǎn)物條帶。將1.9kb的擴(kuò)增dna片段用bamhi和pmli消化，并連接到用bamhi和pmli消化的phuda1067-fcy，以創(chuàng)建prika147。質(zhì)粒圖譜示于圖11。在nn059209中三個(gè)基因座(na1、na2和酸穩(wěn)定性淀粉酶)中同時(shí)引入ja126淀粉酶基因?qū)rika147引入到黑曲霉菌株nn059209中。從補(bǔ)充有1％d-木糖和10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n(tf)中選擇轉(zhuǎn)化子。將隨機(jī)選擇的轉(zhuǎn)化子接種到補(bǔ)充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n平板上。將在補(bǔ)充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n平板上生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行純化，并進(jìn)行southern印跡分析，以確認(rèn)prika147中的ja126基因是否正確引入到na1、na2和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座處。使用用于非放射性探針的以下引物組來(lái)分析所選擇的轉(zhuǎn)化子。對(duì)于ja126編碼區(qū)：正向引物(seqidno:85)：tcgaacttcggcgacgagtcgcagttgaa反向引物(seqidno:86)：cccaacatctcggaaatcctggagaaaccc將從所選擇的轉(zhuǎn)化子中提取的基因組dna用hindiii和pmli消化。通過正確的基因引入事件，當(dāng)用上述探針探測(cè)時(shí)，觀察到hindiii和pmli消化的8.0kb(na1)、6.5kb(酸穩(wěn)定性淀粉酶)和4.8kb(na2)大小的雜交信號(hào)。圖12示出在prika147正確整合到nn059208中之后的示意性na1(上)、na2(中)和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座(下)。通過補(bǔ)充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n平板的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生頻率是通過不含5fc的cove-n平板的頻率的約1/10,000。但是，通過補(bǔ)充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n平板產(chǎn)生的菌株的50％給出在三個(gè)基因座的正確整合，而通過不含5fc的cove-n平板隨機(jī)選擇的所有菌株最多給出在一個(gè)基因座處的正確整合，而沒有5fc時(shí)所產(chǎn)生的菌株均不顯示出正確的整合事件。這表明使用fcy1基因的逆選擇效果非常好。將在三個(gè)基因座處引入ja126淀粉酶的三個(gè)菌株(r147-17、r147-26、r147-34)在搖瓶中發(fā)酵，并按照上述的材料和方法測(cè)量其酶活(afau活性)；結(jié)果示于以下表2。作為參照，對(duì)通過常規(guī)同源重組產(chǎn)生的單拷貝ja126淀粉酶菌株c2325(未示出)也加以發(fā)酵。菌株ja126拷貝afau相對(duì)活性c232511.00r147-1732.75～2.96r147-2632.82～3.00r147-3433.15～3.18表2.單拷貝菌株和3拷貝菌株的afau活性，其中c2325標(biāo)準(zhǔn)化為1.00。實(shí)施例10.在米曲霉jal1338的淀粉酶b(amyb)基因座處引入frt位點(diǎn)和tk基因構(gòu)建ligd破壞質(zhì)粒pjal1123分別破壞pdv8中bamhi和bglii的兩個(gè)限制識(shí)別位點(diǎn)。首先將pdv8用bamhi消化，然后通過用klenow酶和四種dntp處理來(lái)將末端完全補(bǔ)平。將得到的6030bp片段再連接，得到質(zhì)粒pjal504。第二步，將pjal504用bglii消化，然后通過用klenow酶和四種dntp處理將末端完全補(bǔ)平。將得到的6034bp片段再連接，得到質(zhì)粒pjal504-δ-bglii。通過使用引物172450和172449進(jìn)行的pcr，擴(kuò)增出含有兩側(cè)為構(gòu)巢曲霉gpd啟動(dòng)子和trpc終止子的hsv-tk基因的2522bp片段。然后將pcr片段克隆到質(zhì)粒4blunt載體中，得到pjal574。引物172449(seqidno:87)：gacgaattccgatgaatgtgtgtcctg引物172450(seqidno:88)：gacgaattctctagaagatctctcgaggagctcaagcttctgtacagtgaccggtgactc將來(lái)自pjal554的米曲霉pyrg基因分離成2403bpstui-ecori片段，其中ecori位點(diǎn)通過用klenow酶和4種dntp處理而完全補(bǔ)平。將片段克隆到pjal574中的唯一pmei位點(diǎn)中，得到質(zhì)粒pjal1022。將質(zhì)粒pjal1022用sspb1消化，并將8574bp片段分離并再連接，得到質(zhì)粒pjal1025。將質(zhì)粒pjal1025用ecori消化，將8559bp片段分離并再連接，得到質(zhì)粒pjal1027。通過用bamhi部分消化，然后用klenow酶和四種dntp處理從而將末端完全補(bǔ)平，破壞兩個(gè)bamhi位點(diǎn)中的一個(gè)位點(diǎn)。將8563bp片段再連接，得到質(zhì)粒pjal1029。根據(jù)公開可得的米曲霉rib40基因組序列(nite數(shù)據(jù)庫(kù)，http://www.bio.nite.go.jp/dogan/project/view/ao)，設(shè)計(jì)出引物，以pcr擴(kuò)增ligd基因(ao090120000322)的5’側(cè)翼和3’側(cè)翼序列。將用于5’側(cè)翼部分的引物x4407c0和x4407c07分別用bamhi和ecori位點(diǎn)作為尾部：引物x4407c0(seqidno:89)：cagggatccgtctaggctgcaataggc引物x4407c07(seqidno:90)：ggagaattcggtcacatc用于3’側(cè)翼部分的引物x7164d09和x7164d10分別以hindiii和spei位點(diǎn)結(jié)尾：引物x7164d09(seqidno:91)：gacactagtcgtcggcagcaccggtg引物x7164d10(seqidno:92)：cagaagcttcagagtgaaatagacgcgg使用來(lái)自toc1512的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將1114bp和914bp的所擴(kuò)增5’和3’片段用bamhi-ecori和hindiii-spei消化，分別得到1102bp片段和902bp片段。將3’側(cè)翼片段克隆到pjal1029的對(duì)應(yīng)部位中，產(chǎn)生pjal1120。然后將5’側(cè)翼片段克隆到pjal1120的對(duì)應(yīng)部位中，得到pjal1123。構(gòu)建ligd(-)米曲霉菌株jal1194如wo0168864中所述，將質(zhì)粒pjal1123用spei線性化，并用于轉(zhuǎn)化米曲霉toc1512，在補(bǔ)充有0.6mm5-氟-2’-脫氧尿苷(fdu)的基本培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。將多個(gè)轉(zhuǎn)化子再分離兩次，制備基因組dna。將來(lái)自各個(gè)轉(zhuǎn)化子的染色體dna用asp718消化，并使用來(lái)自pjal1123的含有米曲霉ligd基因5’側(cè)翼的1102bp32p-標(biāo)記的dnaecori-bamhi片段作為探針，通過dna印跡加以分析。通過3828bpasp718條帶的消失和2899bpasp718條帶的出現(xiàn)來(lái)識(shí)別目標(biāo)菌株。將具有上述特征的一個(gè)轉(zhuǎn)化子命名為jal1194。分離pyrg(-)米曲霉菌株jal1196將米曲霉菌株jal1194篩選對(duì)5-氟-乳清酸(foa)的抗性，以在補(bǔ)充有1.0m蔗糖作為碳源、10mm硝酸鈉作為氮源以及0.5mg/mlfoa的基本平板(coved.j.1966.biochem.biophys.acta.113:51-56)上識(shí)別自發(fā)的pyrg突變體。一菌株jal1196被鑒定為pyrg(-)。jal1196是尿苷依賴型，因此可以對(duì)其轉(zhuǎn)化野生型pyrg基因，并通過在缺乏尿苷的情況下的生長(zhǎng)能力來(lái)選擇轉(zhuǎn)化子。構(gòu)建aflatrem基因簇(atm)缺失質(zhì)粒pjal1202通過用引物t5483h12和t5483g10對(duì)pjal574進(jìn)行pcr，將米曲霉端粒序列引入到tk表達(dá)盒周圍：引物t5483h12(seqidno:93)：gcacatatgatttaaatccctaatgttgaccctaatgttgaccctaatgttgagcggccgcgtttaaacgaattcgccc引物t5483g10(seqidno:94)：cgtaagcttatttaaatccctaatgttgaccctaatgttgaccctaatgttgagaccggtgactctttctg將擴(kuò)增的2595bp片段用ndei和hindiii消化，將得到的2582bp片段克隆到pu19中的對(duì)應(yīng)部位處，產(chǎn)生pjal835。將質(zhì)粒pjal835用hindiii消化，通過用klenow酶和四種dntp處理將末端補(bǔ)平，然后再連接，生成pjal955。將質(zhì)粒pjal554用hindiii和asp718消化，將得到的編碼米曲霉pyrg基因的1994bp片段克隆到ptoc65中的對(duì)應(yīng)部位處，產(chǎn)生pjal1183。通過引物d5831f08和d5831f09從toc1512基因組dna中擴(kuò)增出1535bp的atm5’片段：引物d5831f08(seqidno:95)：gacgaattcggcgtgggaaattcctgg引物d5831f09(seqidno:96)：ccctacacctggggtacc將擴(kuò)增的片段用ecori和asp718消化，將得到的1514bp片段克隆到pjal1183中對(duì)應(yīng)部位處，產(chǎn)生pjal1194。將來(lái)自pjal1194的含有atm5’側(cè)翼和pyrg基因的3529bpecori-noti片段與來(lái)自pjal955的含有tk基因的3529bp片段連接在一起，產(chǎn)生pjal1202。質(zhì)粒pjal1202是用于使染色體atm基因簇缺失的質(zhì)粒。構(gòu)建atm(-)米曲霉菌株jal1268將質(zhì)粒pjal1202用spei線性化，并用于轉(zhuǎn)化米曲霉jal1196。如wo0168864中所述，在補(bǔ)充有0.6mm5-氟-2’-脫氧尿苷(fdu)的基本培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。將多個(gè)轉(zhuǎn)化子再分離兩次，并制備基因組dna。將來(lái)自各個(gè)轉(zhuǎn)化子的染色體dna用saci消化，并使用來(lái)自pjal1194的含有米曲霉atm基因簇5’側(cè)翼的1514bp32p標(biāo)記的dnaecori-asp718片段作為探針，通過southern印跡加以分析。通過3230bpsaci條帶的消失和4436bpsaci條帶的出現(xiàn)，識(shí)別出目標(biāo)菌株。將具有上述特征的一個(gè)轉(zhuǎn)化子命名為jal1268。分離pyrg(-)米曲霉菌株jal1338將米曲霉菌株jal1268篩選對(duì)5-氟-乳清酸(foa)的抗性，以在補(bǔ)充有1.0m蔗糖作為碳源、10mm硝酸鈉作為氮源以及0.5mg/mlfoa的基本平板(coved.j.1966.biochem.biophys.acta.113:51-56)上識(shí)別自發(fā)的pyrg突變體。一個(gè)菌株jal1338被識(shí)別為pyrg(-)。jal1338是尿苷依賴型的，因此可以對(duì)其轉(zhuǎn)化野生型pyrg基因，并通過在缺少尿苷的情況下的生長(zhǎng)能力來(lái)選擇轉(zhuǎn)化子。構(gòu)建用于在淀粉酶b基因座處整合的含有側(cè)翼為frt位點(diǎn)的tk基因的質(zhì)粒pjal1258根據(jù)公開可得的米曲霉rib40基因組序列(nite數(shù)據(jù)庫(kù)，http://www.bio.nite.go.jp/dogan/project/view/ao)，設(shè)計(jì)出引物，以擴(kuò)增淀粉酶b(amyb)基因(ao090023000944)的5’側(cè)翼和3’側(cè)翼序列。用于5’側(cè)翼部分的引物d5775f04和d5775d07分別以noti和hindiii位點(diǎn)結(jié)尾：引物d5775f04(seqidno:97)：gacgcggccgcgctttgctaaaactttgg引物d5775d07(seqidno:98)：gacaagcttatgctcgatggaaacgtgcac用于3’側(cè)翼部分的引物d5775d08和d5775f05分別以hindiii和noti位點(diǎn)結(jié)尾：引物d5775d08(seqidno:99)：gacaagcttacagtagttggactactttac引物d5775f05(seqidno:100)：gacgcggccgcgacgagcaactgacggc使用來(lái)自toc1512的基因組dna作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)。將1307bp和511bp的所擴(kuò)增5’和3’片段用noti和hindiii消化，分別得到1294bp片段和498bp片段。然后將5’和3’側(cè)翼片段克隆到ptoc65的noti位點(diǎn)，得到pjal1196。通過引物f3-1和f3-2的退火而形成具有用于克隆到puc19的限制性酶切位點(diǎn)bamhi和psti中的懸突的接頭，將酵母2μ質(zhì)粒frt位點(diǎn)f和f3(schlaket.andbodej.useofmutatedflprecognitiontarget(frt)sitesfortheexchangeofexpressioncassettesatdefinedchromosomalloci.biochemistry33:12746-12751)克隆到puc19中，得到pjal952：引物f3-1(seqidno:101)：gatccttgaagttcctattccgagttcctattcttcaaatagtataggaacttcactgca引物f3-2(seqidno:102)：tgaagttcctatactatttgaagaataggaactcggaataggaacttcaa通過測(cè)序來(lái)證實(shí)frtf3位點(diǎn)插入到puc19中。然后將引物f-1和f-2一起退火，形成具有用于克隆到pjal952的限制性酶切位點(diǎn)asp718的懸突的接頭：引物f-1(seqidno:103)：gtaccttgaagttcctattccgagttcctattctctagaaagtataggaacttca引物f-2(seqidno:104)：gtactgaagttcctatactttctagagaataggaagtcggaataggaacttcaa通過測(cè)序來(lái)證實(shí)frtf位點(diǎn)以與f3相同的方向插入pjal952中，正確的克隆命名為pjal953。通過從含有frt位點(diǎn)f和f3的pjal963中獲取142bpsaci-hindiii片段，并將其克隆到用saci-hindiii消化的pjal1196中，來(lái)將frtf-f3位點(diǎn)插入到amyb側(cè)翼之間，得到含有5’amyb側(cè)翼并接有frtf-f3位點(diǎn)和3’amyb側(cè)翼的pjal1249。然后，按照如下將pyrg和tk基因插入到frtf和frtf3位點(diǎn)之間。將末端通過用klenow酶和四種dntp處理而補(bǔ)平的pjal1029的4838bphindiii-sspbi片段克隆到pjal1249的smai位點(diǎn)中，得到具有以下不同元件的排列的質(zhì)粒：5’amyb側(cè)翼–frtf–pyrg–tk–ftrtf3–3’amyb側(cè)翼，將其命名為pjal1258。構(gòu)建frt、pyrg和tk整合在amyb基因座的米曲霉菌株jal1386將質(zhì)粒pjal1258用noti線性化，并用于轉(zhuǎn)化米曲霉jal1338；在基本培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。將多個(gè)轉(zhuǎn)化子再分離兩次，制備出基因組dna。將來(lái)自各個(gè)轉(zhuǎn)化子的染色體dna用xhoi消化，并使用來(lái)自pjal1196的含有米曲霉amyb基因5’側(cè)翼的1294bp32p標(biāo)記的dnanoti-hindiii片段作為探針，通過southern印跡加以分析。通過4164bpxhoi條帶的消失和8971bpxhoi條帶的出現(xiàn)，來(lái)識(shí)別目標(biāo)菌株。將具有上述特征的一個(gè)轉(zhuǎn)化子命名為jal1386。分離pyrg(-)米曲霉菌株jal1394將米曲霉菌株jal1386篩選對(duì)5-氟-乳清酸(foa)的抗性，以在補(bǔ)充有1.0m蔗糖作為碳源、10mm硝酸鈉作為氮源以及0.5mg/mlfoa的基本平板(coved.j.1966.biochem.biophys.acta.113:51-56)上識(shí)別自發(fā)的pyrg突變體。一菌株jal1394被識(shí)別為pyrg(-)。jal1394是尿苷依賴型的，因此可以用野生型pyrg基因?qū)ζ溥M(jìn)行轉(zhuǎn)化，并通過在缺乏尿苷的情況下的生長(zhǎng)能力來(lái)選擇轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例11.通過flp向jal1394的amyb基因座進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合構(gòu)建埃默森籃狀菌(talaromyceemersonii)amg表達(dá)盒prika99對(duì)含有內(nèi)含子的埃默森籃狀菌amg基因進(jìn)行優(yōu)化，提供用于在曲霉中表達(dá)的合成基因(seqidno:105)。出于克隆的目的，分別向5’端和3’端添加bamhi和xhoi限制性酶切位點(diǎn)?；谫|(zhì)粒pj241:13509-huda2的序列，獲得合成的基因。分別從質(zhì)粒pj241:13509-huda2和phuda1000中分離編碼埃默森籃狀菌amg基因的2085bpbamhi-xhoi片段和9510bpbamhi-xhoi片段。將兩個(gè)片段連接在一起，以創(chuàng)建prika99。通過flp將prika99位點(diǎn)特異性整合在jal1394中將prika99引入到米曲霉菌株jal1394中。在補(bǔ)充有1％d-木糖和0.6mm5-氟-2’-脫氧尿苷(fdu)的kcl-平板上選擇轉(zhuǎn)化子。將四個(gè)轉(zhuǎn)化子再分離兩次，制備出基因組dna。將來(lái)自各個(gè)四種轉(zhuǎn)化子的染色體dna用bglii-draiii和bglii-kspi消化，并首先使用來(lái)自prika99的含有amg基因的2095bp32p標(biāo)記的dnabamhi-xhoi片段作為探針，其次在去除濾器之后通過使用來(lái)自prika99的含有構(gòu)巢曲霉xlna啟動(dòng)子的731bp32p標(biāo)記的dnaafei-paci片段作為探針，通過southern印跡進(jìn)行分析。正確的整合事件通過以下來(lái)識(shí)別：1)使用amg探針：在bglii-draiii消化中的7145bp和3739bp條帶，以及bglii-kspi消化中的6845bp條帶；2)使用構(gòu)巢曲霉xlna啟動(dòng)子探針：bglii-draiii消化中的6845bp條帶，以及bglii-kspi消化中的4039bp條帶。實(shí)施例12.經(jīng)由5-氟胞嘧啶(5fc)的米曲霉生長(zhǎng)抑制以及胞嘧啶氨基酶的破壞為測(cè)試米曲霉生長(zhǎng)受5-氟胞嘧啶(5fc)的抑制，將bech2的孢子劃線接種在補(bǔ)充有不同濃度5fc(2.5、1.5和0.625μg/ml)的cove-n(tf)上。在最低的5fc濃度(0.625μg/ml)下，檢測(cè)不到生長(zhǎng)，表明米曲霉也具有胞嘧啶脫氨酶。在米曲霉中，僅有一種與黑曲霉fcy1基因(embl:am269962)直系同源的基因(公共基因組序列的ao090003000802)，因此將其破壞以證實(shí)該基因是導(dǎo)致細(xì)胞在5fc上生長(zhǎng)時(shí)死亡的胞嘧啶脫氨酶。通過使用在nielsen等人(2005)efficientpcr-basedgenetargetingwitharecyclablemarkerforaspergillusnidulans,fungalgentbiol43:54-64中記載的雙分基因(bipartitegene)靶向底物來(lái)破壞ao090003000802。通過pcr擴(kuò)增生成含有米曲霉ao090003000802基因5’側(cè)翼和部分pyrg基因(pyrg基因的啟動(dòng)子和2/3編碼區(qū))的2145bp片段。首先，以bech2基因組dna為模板，使用引物ojal132：cagatactggttccttacgg(seqidno:108)和ojal133：cgtccacgcggggattatgcgtagaatgcagagatagctg(seqidno:109)，通過pcr擴(kuò)增出含有ao090003000802的5’側(cè)翼的1036bp片段。然后，以pjal554為模板dna，使用引物x1111c07：gcataatccccgcgtggacg(seqidno:110)和ojal114：ccaacagccgactcaggag(seqidno:111)，通過pcr擴(kuò)增含有pyrg5’部分的1129bp片段。將所擴(kuò)增的產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并混合在一起，使用引物ojal132和ojal114進(jìn)行pcr，得到2145bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其在1.0％瓊脂糖凝膠上純化。通過pcr擴(kuò)增，生成含有米曲霉ao090003000802基因3’側(cè)翼和部分pyrg基因(pyrg基因的2/3編碼區(qū)和終止子)的2436bp片段。首先，以bech2基因組dna為模板，使用引物ojal134：cgataagctccttgacggggttgagcactgcttttggatc(seqidno:112)和ojal135：gctcacccggcataagttgc(seqidno:113)，通過pcr擴(kuò)增含有ao090003000802的5’側(cè)翼的1011bp片段。然后，以pjal554為模板dna，使用引物x1111c08：ccccgtcaaggagcttatcg(seqidno:114)和ojal113：gagctgctggatttggctg(seqidno:115)，通過pcr擴(kuò)增含有pyrg5’部分的1445bp片段。將擴(kuò)增的產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并混合在一起，使用引物ojal1135和ojal135進(jìn)行pcr，生成2436bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其在1.0％瓊脂糖凝膠上純化。為破壞ao090003000802基因，將上述兩種擴(kuò)增的2145bp和2436bp片段進(jìn)行混合，并轉(zhuǎn)化到米曲霉jal1398菌株中，從cove-n平板上選擇轉(zhuǎn)化子。使用southern印跡分析來(lái)證實(shí)ao090003000802基因的破壞。將提取自20個(gè)轉(zhuǎn)化子的基因組dna用pvui-spei消化，并使用32p標(biāo)記的上述擴(kuò)增pcr1036bp片段作為探針，進(jìn)行southern印跡分析。通過5.5kbpvui-spei條帶的消失和6.9kbpvui-spei條帶的出現(xiàn)，來(lái)識(shí)別目標(biāo)菌株。同時(shí)，測(cè)試菌株在含有0.625μg/ml5fc的cove-n平板上的生長(zhǎng)情況，僅有在6.9kb具有預(yù)計(jì)條帶的菌株顯示出生長(zhǎng)，這表明ao090003000802基因是胞嘧啶脫氨酶.。在這些菌株中，選擇一種并命名為jal1500。實(shí)施例13.在黑曲霉nn059209中pay(推定的烷基型硫酸酯酶)基因座處引入frt位點(diǎn)和黑曲霉fcy1基因構(gòu)建用于在pay基因座處引入frt位點(diǎn)和黑曲霉fcy1的phuda1174(圖13)基于embl:am270278中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別引入xbai位點(diǎn)和pmei位點(diǎn)的下列引物3pay-f和3pay-r，以分離黑曲霉pay基因的3'側(cè)翼區(qū)：3pay-f:ttgcttctagacttctatttcctaatat(seqidno:116)3pay-r:ttgtttaaacttaattaaccgcgccat(seqidno:117)使用3pay-f和3pay-r引物對(duì)，以黑曲霉菌株nn059183的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并將2.1kb產(chǎn)物條帶從凝膠上切離。2.1kb擴(kuò)增的dna片段用xbai和pmei消化，并連接到用xbai和pmei消化的phuda801以產(chǎn)生phuda801-3pay?；趀mbl:am270278和dj052242中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別地引入noti位點(diǎn)和spei位點(diǎn)的下列引物5pay-f和5pay-r，以分離融合有frt-f位點(diǎn)的黑曲霉pay基因的5'側(cè)翼區(qū)：5pay-f:ggtggcggccgcgccgacggtgctggagga(seqidno:118)5pay-r:tttactagtgaagttcctatactttctagagaataggaactcggaataggaacttcaagatgaattcctagtcgg(seqidno:119)使用5pay-f和5pay-r引物對(duì)，以黑曲霉菌株nn059183的基因組dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并將1.3kb產(chǎn)物條帶從凝膠上切離。該1.3kb擴(kuò)增的dna片段用noti和spei消化，并連接到用noti和spei消化的phuda801-3pay以產(chǎn)生phuda801-3pay-5pay。通過nhei和xbai消化，從phuda440-frt中回收包含t.c.ga基因的4.3kbdna片段，該t.c.ga基因由三重串聯(lián)na2啟動(dòng)子(pna2)和amg終止子(tamg)驅(qū)使。將該回收的4.3kb片段連接到nhei和xbai消化的phuda801-3pay-5pay。將連接混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌dh5a以構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒phuda801-3pay-5pay-tc?；趀mbl:embl:m19132和dj052242中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)分別地引入xbai位點(diǎn)和spei位點(diǎn)的下列引物pyrg-f和pyrg-r，以分離融合有frt-f3位點(diǎn)的構(gòu)巢曲霉pyrg基因。pyrg-f:ttagtactttgaagttcctattccgagttcctattcttcaaatagtataggaacttcaactagctagtgcatgcctagtggagcg(seqidno:120)pyrg-r:aagtctagaagcaagggcgaattccagca(seqidno:121)使用pyrg-f和pyrg-r引物對(duì)，以phuda794的基因組dna作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，且將2.1kb產(chǎn)物條帶從凝膠上切離。該2.1kb擴(kuò)增的dna片段用xbai和spei消化，并連接到用xbai消化的phuda801-3pay-5pay-tc以創(chuàng)造phuda801-3pay-5pay-tc-pyrg?；趀mbl:am269962中的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)在兩個(gè)位點(diǎn)都引入nhei位點(diǎn)的下列引物fcy-f和fcy-r，以分離黑曲霉fcy1基因的整個(gè)區(qū)域。fcy-f:gctagcgcgaggctatcacggaggctgtgg(seqidno:122)fcy-r:gctagcttctgtggttcttgccatgatcgt(seqidno:123)使用fcy-f和fcy-r引物對(duì)，以黑曲霉菌株nn059183的基因組dna作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，且將1.5kb產(chǎn)物條帶從凝膠上切離。該1.5kb擴(kuò)增的dna片段用nhei消化，并連接到用nhei消化的phuda801-3pay-5pay-tc-pyrg以產(chǎn)生phuda1174(圖13)。在黑曲霉nn059209的pay基因座處引入frt位點(diǎn)和黑曲霉fcy1基因?qū)huda1174引入到黑曲霉菌株nn059209中。從cove-n(tf)選取轉(zhuǎn)化子。將隨機(jī)選取的轉(zhuǎn)化子接種至帶有2.5μm5-氟-2-脫氧尿苷(fdu)的cove-n平板上。將在具有2.5μμfdu的cove-n平板上生長(zhǎng)良好且在具有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n平板上幾乎不生長(zhǎng)的菌株純化，并對(duì)其采取southern印跡分析以確定frt位點(diǎn)和fcy1基因是否正確地引入到pay位點(diǎn)。使用用于制作非放射性探針的下列引物組來(lái)分析所選的轉(zhuǎn)化子。對(duì)于t.c.ga編碼區(qū)域，正向引物:tcgagtgcggccgacgcgtacgtc(seqidno:124)，反向引物:cagagagtgttggtcacgta(seqidno:125)。從所選轉(zhuǎn)化子中提取的基因組dna用pmli消化。通過正確的基因引入事件，如上所述，觀察探測(cè)到經(jīng)pmli消化的7.7kb大小的雜交信號(hào)。在給予正確的整合事件的這些菌株之中，選取菌株nn059280。實(shí)施例14.用于產(chǎn)生具有改變的ja126淀粉酶基因拷貝的菌株的競(jìng)爭(zhēng)性基因交換在nn059280中拯救pyrg基因?qū)υ趎n059280中pay基因座處引入的pyrg基因作如下拯救。將該菌株nn059280一次接種至含有10mm尿苷和1g/l5-氟-乳清酸(5-foa)的cove-n培養(yǎng)基。其中已缺失pyrg基因的菌株將在5-foa的存在下生長(zhǎng)；保留該基因的那些菌株會(huì)將5-foa轉(zhuǎn)化為有毒的中間體5-氟-ump。分離生長(zhǎng)更快的菌落。將分離的菌株命名為m1146?？蛰d體phuda1306(圖15)的構(gòu)建用nhei和pmli消化prika147。通過t4dna聚合酶補(bǔ)平并重連8.1kbdna片段。將生成的質(zhì)粒稱為phuda1306(圖15)。用prika147和phuda1306進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性基因交換以生成具有改變的ja126淀粉酶基因拷貝的菌株；參見圖16a-16c。將prika147和phuda1306共同引入到黑曲霉菌株m1146。從補(bǔ)充有1％d-木糖和10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n(tf)上選取轉(zhuǎn)化子。將隨機(jī)選取的轉(zhuǎn)化子接種至補(bǔ)充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n平板。純化在補(bǔ)充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n平板上生長(zhǎng)良好的菌株并對(duì)其采取southern印跡分析，以確定prika147中的ja126基因是否正確地引入到na1、na2、sp288或pay基因座。用制作非放射性探針的下列引物組來(lái)分析所選轉(zhuǎn)化子。對(duì)于ja126編碼區(qū)：正向引物:tcgaacttcggcgacgagtcgcagttgaa(seqidno:126)反向引物:cccaacatctcggaaatcctggagaaaccc(seqidno:127)從所選轉(zhuǎn)化子中提取的基因組dna用hindiii和pmli消化。通過正確的基因引入事件，如上所述，觀察探測(cè)到經(jīng)hindiii和pmli消化的8.0kb(na1)、6.5kb(sp288)、4.8kb(na2)和4.5kb(pay)大小的雜交信號(hào)。產(chǎn)生具有0～4個(gè)ja126基因拷貝的轉(zhuǎn)化子的頻率大部分是相同的。因此，通過表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒的共引入，很容易獲得具有不同目標(biāo)基因拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例15.通過flp及其熱穩(wěn)定變體flpe將nn059280中4個(gè)基因座(na1、na2、sp288和pay)處的t.c.ga基因同時(shí)基因交換成ja126淀粉酶基因熱穩(wěn)定flp變體(flpe)表達(dá)載體phuda1352的構(gòu)建基于文獻(xiàn)中flpe的序列信息(improvedpropertiesofflprecombinaseevolvedbycyclingmutagenesisf.buchholz,p.o.angrand,a.f.stewart.nat.biotechnol.,16(1998),657-662頁(yè))，制備如下引物。flpe1:ggatctaccatgtcccagttcgatatcctctgcaagaccccccccaaggtcctcgtccgccagttcgtcgagcgcttcgagcgcccctccggcgagaagatcgcctcctgcgccg(seqidno:128)flpe2:atgcttctggccgttgtaggggatgatggt(seqidno:129)flpe3:accatcatcccctacaacggccagaagcat(seqidno:130)flpe4:ttgatggcgaagatggggtagggggcgttc(seqidno:131)flpe5:gaacgccccctaccccatcttcgccatcaa(seqidno:132)flpe6:ttcggatcagatgcggcggttgatgtagga(seqidno:133)使用引物對(duì)flpe1和flpe2，flpe3和flpe4及flpe5和flpe6，以phuda996作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)。在1.0％瓊脂糖凝膠上分離反應(yīng)產(chǎn)物，并將0.3、0.6和0.5kb產(chǎn)物帶從凝膠上切離?；旌线@三個(gè)片段并用于運(yùn)用引物對(duì)flpe1和flpe6進(jìn)行的第二輪pcr反應(yīng)。在1.0％瓊脂糖凝膠上分離反應(yīng)產(chǎn)物，并將1.3kb產(chǎn)物帶從凝膠上切離。1.3kb擴(kuò)增的dna片段用bamhi和bstbi消化，并連接到用bamhi和bstbi消化的phuda996以產(chǎn)生phuda1352。構(gòu)建攜帶熱穩(wěn)定flp變體(flpe)的ja126淀粉酶表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)載體phuda1356。用bamhi和bstbi消化phuda1352。將1.3kbdna片段連接到用bamhi和bstbi消化的prika147以生成phuda1356(圖17)。flp和flpe之間同時(shí)基因交換效率的比較將prika147和phuda1356引入到黑曲霉菌株m1146。從補(bǔ)充1％d-木糖和10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n(tf)上選取轉(zhuǎn)化子。將隨機(jī)選取的轉(zhuǎn)化子接種至補(bǔ)充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n平板上。純化在補(bǔ)充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5fc)的cove-n平板上生長(zhǎng)良好的菌株，并對(duì)其進(jìn)行southern印跡分析，以確認(rèn)prika147中的ja126基因是否正確地引入到na1、na2、sp288或pay基因座。用制作非放射性探針的下列引物組來(lái)分析所選的轉(zhuǎn)化子。對(duì)于ja126編碼區(qū)：正向引物:tcgaacttcggcgacgagtcgcagttgaa(seqidno:134)反向引物:cccaacatctcggaaatcctggagaaaccc(seqidno:135)用hindiii和pmli消化從所選轉(zhuǎn)化子中提取的基因組dna。通過正確的基因引入事件，如上所述，觀察探測(cè)到經(jīng)hindiii和pmli消化的8.0kb(na1)、6.5kb(sp288)、4.8kb(na2)和4.5kb(pay)大小的雜交信號(hào)。使用flpe(phuda1356)進(jìn)行同時(shí)整合的頻率比使用flp(prika147)時(shí)的頻率高約3倍，因此熱穩(wěn)定flp變體flpe提供提高的基因座特異性整合頻率。實(shí)施例16.在米曲霉中amyb和#13基因座處引入frt位點(diǎn)和tk基因構(gòu)建米曲霉菌株jal1398niad-米曲霉菌株jal828的分離首先，對(duì)于米曲霉菌株5-58(wo20099106488)篩選氯酸鹽抗性，從而在補(bǔ)充有1.0m蔗糖作為碳源、10mm谷氨酸鈉作為氮源和5％氯酸鹽的基本平板(minimalplate)上鑒定自發(fā)的niad突變體(coved.j.1966.biochem.biophys.acta.113:51-56)。一個(gè)菌株jal828被鑒定為niad-。第二，對(duì)于米曲霉菌株jal828篩選5-氟-乳清酸(foa)抗性，從而在補(bǔ)充有1.0m蔗糖作為碳源、10mm硝酸鈉作為氮源和0.5mg/mlfoa的基本平板上鑒定自發(fā)pyrg突變體(coved.j.1966.biochem.biophys.acta.113:51-56)。一個(gè)菌株cols454被鑒定為pyrg-。cols454是尿苷依賴型，因此，可以對(duì)其轉(zhuǎn)化野生型pyrg基因，并根據(jù)在尿苷不存在的情況下的生長(zhǎng)能力選擇轉(zhuǎn)化子。第三，如在實(shí)施例10中所描述的，將米曲霉cols454菌株制成ligd-型，得到米曲霉菌株jal1390。第四，如前所述，將米曲霉菌株jal1390制成pyrg-型，得到米曲霉菌株jal1398。構(gòu)建具有在基因座amyb和#13處整合的frt::tk的米曲霉菌株jal1523為了整合側(cè)翼是frt位點(diǎn)的tk，用noti將質(zhì)粒pjal1258線性化，并將其用于轉(zhuǎn)化米曲霉jal1398；在基本培養(yǎng)基上選取轉(zhuǎn)化子。將若干個(gè)轉(zhuǎn)化子再分離兩次，并準(zhǔn)備基因組dna。用xhoi消化各個(gè)轉(zhuǎn)化子的染色體dna，并使用pjal1196的包含米曲霉amyb基因的5'側(cè)翼的1294bp32p標(biāo)記的dnanoti-hindiii片段作為探針，通過southern印跡對(duì)其進(jìn)行分析。用4164kbxhoi條帶的消失和8971kbxhoi條帶的出現(xiàn)來(lái)鑒定目標(biāo)菌株。將一個(gè)具有以上特征的轉(zhuǎn)化子命名為jal1450。分離pyrg-型米曲霉菌株jal1467對(duì)于米曲霉菌株jal1450篩選5-氟-乳清酸(foa)抗性，從而在補(bǔ)充有1.0m蔗糖作為碳源、10mm硝酸鈉作為氮源和0.5mg/mlfoa的基本平板上鑒定自發(fā)的pyrg突變體(coved.j.1966.biochem.biophys.acta.113:51-56)。一個(gè)菌株jal1467被鑒定為pyrg-型。jal1467是尿苷依賴型，因此，可以對(duì)其轉(zhuǎn)化野生型pyrg基因，并根據(jù)在尿苷不存在的情況下的生長(zhǎng)能力選擇轉(zhuǎn)化子。構(gòu)建包含側(cè)翼是frt位點(diǎn)用于在#13基因座進(jìn)行整合的tk基因的質(zhì)粒pjal1313在質(zhì)粒pjal835(us2010062491)中，通過用hindiii打開質(zhì)粒，然后通過用4dntp's和klenow處理將端部補(bǔ)平，接著進(jìn)行重連而破壞單個(gè)hindiii，生成質(zhì)粒pjal955。在米曲霉rib40基因組序列之外(www.bio.nite.go.jp/dogan/project/view/ao)，設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增基因座#13的5'側(cè)翼和3'側(cè)翼序列。5'側(cè)翼部分的引物，k6763e12:gacgcggccgccgcgtggaggtctaggac(seqidno:136)和k6763f01:gacaagcttacaaacccgtgacactcc(seqidno:137)，分別以noti和hindiii位點(diǎn)結(jié)尾。3'側(cè)翼部分的引物，k6763f02:gacaagcttacgcatgtatgtatgtgtc(seqidno:138)和k6763f03:gacgtttaaacggatgggtttgccatac(seqidno:139)，分別以hindiii和pmei位點(diǎn)結(jié)尾。將toc1512的基因組dna用作pcr反應(yīng)的模板。分別用noti-hindiii和hindiii-pmei消化1065bp和1032bp的擴(kuò)增的5'和3'片段，分別得到1052bp片段和1021bp片段。然后將5'和3'側(cè)翼片段克隆到pjal955中的noti-pmei位點(diǎn)中，得到pjal968。用nhei-pmei消化質(zhì)粒pjal968，并通過dntp's和klenow的處理對(duì)端部完全補(bǔ)平。將4548bp片段純化并自連，得到質(zhì)粒pjal1285。通過引物f3-1(seqidno:15)和f3-2(seqidno:16)的第一退火處理，形成具有懸突的用于克隆到puc19的限制酶切位點(diǎn)bamhi和psti的接頭，將酵母2μ質(zhì)粒frt位點(diǎn)f和f3(schlaket.andbodej.useofmutatedflprecognitiontarget(frt)sitesfortheexchangeofexpressioncassettesatdefinedchromosomalloci.biochemistry33:12746-12751)克隆到puc19，得到pjal952。通過測(cè)序來(lái)檢驗(yàn)frtf3位點(diǎn)插入到puc19中。第二，將引物f-1和f-2一起退火，以形成具有懸突的接頭用于克隆到pjal952的限制酶切位點(diǎn)asp718。通過測(cè)序來(lái)檢驗(yàn)frtf位點(diǎn)以與f3的方向相同的正確方向插入pjal952，并將正確的克隆命名為pjal953。用saci-scai消化質(zhì)粒pjal953，并將生成的1866bp片段連接到pic19h的920bpsaci-scai片段，得到質(zhì)粒pjal1289。為了在frt位點(diǎn)之間插入hsv-tk基因，將4839bphindiii-bsrgi克隆到用smai消化的pjal1289中，其中4839bphindiii-bsrgi的端部通過dntp's和klenow的處理被完全補(bǔ)平。按以下方式具有不同元件的質(zhì)粒被命名為pjal1293：frtf_pyrg_hsv-tk_frtf3。將攜帶pjal1293的frtf_pyrg_hsv-tk_frtf3部分的4984bphindiii片段連接到來(lái)自pjal1285的4548bphindiii片段。按以下方式具有不同元件的質(zhì)粒被命名為pjal1313：5'#13側(cè)翼_frtf_pyrg_hsv-tk_frtf3_3'#13側(cè)翼。構(gòu)建具有在#13基因座處整合的frt、pyrg和tk的米曲霉菌株jal1523用noti將質(zhì)粒pjal1313線性化，用于轉(zhuǎn)化米曲霉jal1467，在基本培養(yǎng)基上選取轉(zhuǎn)化子。將多個(gè)轉(zhuǎn)化子再分離兩次，制備基因組dna。將各個(gè)轉(zhuǎn)化子的染色體dna用nhei-ndei消化，并使用pjal1313的包含米曲霉#13基因座的3'側(cè)翼的893bp32p標(biāo)記的dnancoi-hindiii片段作為探針，通過southern印跡對(duì)其進(jìn)行分析。通過3896kbnhei-ndei條帶的消失和5607kbnhei-ndei條帶的出現(xiàn)來(lái)鑒定目標(biāo)菌株。將一個(gè)具有以上特征的轉(zhuǎn)化子命名為jal1523。分離pyrg-型米曲霉菌株jal1540對(duì)于米曲霉菌株jal1523篩選5-氟-乳清酸(foa)抗性，從而在補(bǔ)充有1.0m蔗糖作為碳源、10mm硝酸鈉作為氮源和0.5mg/mlfoa的基本平板上鑒定自發(fā)的pyrg突變體(coved.j.1966.biochem.biophys.acta.113:51-56)。一個(gè)菌株jal1540被鑒定為pyrg-型。菌株jal1540是尿苷依賴型，因此，可以對(duì)其轉(zhuǎn)化野生型pyrg基因，并根據(jù)在尿苷不存在的情況下的生長(zhǎng)能力選擇轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例17.利用frt/flp重組體系在里氏木霉中進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合培養(yǎng)基和試劑使用以下培養(yǎng)基和試劑：lb液體培養(yǎng)基+100μg/ml氨芐青霉素：每升10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5gnacl和1ml100mg/ml氨芐青霉素。2ytamp：每升16g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5gnacl，15g細(xì)菌瓊脂和1ml100mg/ml氨芐青霉素。cove：每升342.3g蔗糖，20mlcove鹽溶液，10ml1m乙酰胺，10ml1.5mcscl及25g諾布爾瓊脂。cove2+10mm尿苷：每升30g蔗糖，20mlcove鹽溶液，10mm乙酰胺，15mmcscl及25g諾布爾瓊脂。cim：每升20garbocel天然纖維素纖維(j.rettenmaierusalp)，10g玉米漿固體(sigma)，1.45g(nh4)2so4，2.08gkh2po4，0.28gcacl2，0.42gmgso4·7h20，0.42ml里氏木霉微量金屬，2滴pluronicl61消泡劑，ph6.0。cove鹽溶液：每升26gkcl，26gmgso4·7h2o，76gkh2po4，50mlcove微量元素。cove微量元素：每升0.004gna2b4o7·10h2o，0.4gcuso4·5h2o，1.2gfeso4·7h2o，0.7gmnso4·h2o，0.8gna2moo2·2h2o和10gznso4·7h2o。里氏木霉微量金屬：216gfecl3·6h2o，58znso4·7h2o，27gmnso4·h2o，10gcuso4·5h2o，2.4gh3bo，336g檸檬酸。peg：每升500g聚乙二醇，10ml1mtrisph7.5，10ml1mcacl2。stc：每升0.5l1m山梨醇，10ml1mtrisph7.5，10ml1mcacl2。trmm：每升30g葡萄糖，0.6gcacl2，6g(nh4)2so4，20mlcove鹽溶液，25g諾布爾瓊脂。ypg2％：每升10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖。質(zhì)粒構(gòu)建構(gòu)建了frt位點(diǎn)整合載體pjfys147且展示于圖18。構(gòu)建了包含β-葡糖苷酶的frt/flp表達(dá)載體pjfys150且展示于圖19。里氏木霉原生質(zhì)體形成和轉(zhuǎn)化如wo11/075677先前描述的那樣產(chǎn)生里氏木霉菌株tv11的原生質(zhì)體。在冰上解凍原生質(zhì)體并將5×100μl原生質(zhì)體小份轉(zhuǎn)移到4×14mlfalcon2059管中。將pmei線性化的凝膠純化的dna(約3μg)加至每個(gè)加有250μl60％peg的管中。輕輕地倒置5次來(lái)輕柔混合管中的內(nèi)容物并在34℃溫育30分鐘。向每個(gè)管中加入3mlstc，向包含50mlpda+1m蔗糖的150mm平板中鋪布1.5ml該內(nèi)容物并用無(wú)菌的涂布器鋪開。將平板在28℃溫育約18小時(shí)，其后，加入20mlpda+10mm尿苷+35μg/ml潮霉素b(invitrogencat#10687010)的覆蓋物。平板在28℃溫育6天直到挑選轉(zhuǎn)化子。挑選轉(zhuǎn)化子用10μl接種環(huán)挑選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)移到包含pda瓊脂的75mm直徑平板中，并在28℃溫育5天。在cim培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)化子搖瓶分析用10μl接種環(huán)收集孢子并轉(zhuǎn)移到125ml聚碳酸酯搖瓶，每個(gè)搖瓶含有25mlcim培養(yǎng)基并在28℃振蕩下溫育5天。修復(fù)hpt/tk標(biāo)記(curehpt/tkmarkers)將7天平板培養(yǎng)物的孢子收集到0.01％吐溫-20中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定孢子濃度。在無(wú)菌dih2o中稀釋孢子，以104、105和106鋪布到150mmtrmm+2％葡萄糖平板+1μμ5-氟脫氧尿苷(fdu)。平板在28℃溫育6天，用10μl接種環(huán)挑選孢子分離株，轉(zhuǎn)移到新的pda平板并在28℃溫育?；蚪Mdna分離/southern分析將孢子收集到5ml0.01％吐溫-20中，2ml用于接種至250ml帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的50mlypg2％培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在28℃170rpm振蕩下溫育40小時(shí)。去除瓊脂塊(agarplug)，通過miraclothtm過濾培養(yǎng)物。用液氮冷凍所收獲的生物質(zhì)，并用研缽和研杵研磨菌絲。根據(jù)制造商的說(shuō)明書使用plantmaxikit(qiagen，valencia，ca，usa)分離基因組dna，不同在于65℃的裂解溫育期從10min延長(zhǎng)到1.5小時(shí)。用nanodrop1000分光光度計(jì)(thermofischerscientific，waltham，ma，usa)測(cè)定所得的含dna溶液的濃度。在37℃用44單位的ndei在50μl反應(yīng)體積中消化2.5μg基因組dna22小時(shí)。將消化產(chǎn)物在tae緩沖液中進(jìn)行0.9％瓊脂糖凝膠電泳。dna在凝膠中經(jīng)0.25mhcl處理而片段化，用1.5mnacl-0.5mnaoh變性，用1.5mnacl-1mtris(ph8)中和，然后在20×ssc中用turboblottertm試劑盒轉(zhuǎn)移到supercharge尼龍膜(兩者都來(lái)自whatman，kent，uk)。使用uvstratalinkertm(stratagene，lajolla，ca，usa)將dnauv交聯(lián)到膜上，并在42℃，在20mldigeasyhyb(rochediagnosticscorporation,indianapolis,in,usa)中預(yù)雜交1小時(shí)。用以下示出的正向和反向引物，根據(jù)制造商的說(shuō)明書使用pcrdig探針合成試劑盒(rochediagnosticscorporation，indianapolis，in，usa)產(chǎn)生雜交到里氏木霉cbh2基因的3'側(cè)翼的探針。pcr反應(yīng)包括反應(yīng)緩沖液(stratagene，lajolla，ca)，400nm各引物，200μμdig標(biāo)記的含dutp的dntp，125ngtv10基因組dna和1.5單位dna聚合酶。循環(huán)參數(shù)如下：1個(gè)循環(huán)：在95℃2分鐘；25個(gè)循環(huán)：每個(gè)在95℃30秒，55℃30秒，和72℃40秒；和1個(gè)循環(huán)：在72℃7分鐘。正向(069083):aaaaaacaaacatcccgttcataac(seqidno:140)反向(069084):aacaaggtttaccggtttcgaaaag(seqidno:141)將探針反應(yīng)物在tae緩沖液中進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，切除對(duì)應(yīng)于探針的條帶，并用凝膠提取試劑盒(qiageninc.，valencia，ca，usa)進(jìn)行瓊脂糖提取。將探針煮沸5分鐘并加入到10mldigeasyhyb以產(chǎn)生雜交液。在42℃進(jìn)行雜交15-17小時(shí)。然后在室溫下高等嚴(yán)格條件下在2×ssc加0.1％sds中洗滌膜5分鐘，接著在65℃下在0.1×ssc加0.1％sds中洗滌兩次，每次15分鐘。根據(jù)制造商的說(shuō)明書使用化學(xué)發(fā)光檢定(rochediagnostics,indianapolis，in，usa)檢測(cè)探針-靶標(biāo)雜交體。里氏木霉原生質(zhì)體形成和flp載體的轉(zhuǎn)化如先前描述的那樣(14)產(chǎn)生里氏木霉菌株tv11的原生質(zhì)體。在冰上解凍原生質(zhì)體并將5×100μl原生質(zhì)體各自轉(zhuǎn)移到4×14mlfalcon2059管中。將pmei線性化的凝膠純化的dna(大約2μg)加入到每個(gè)管中并加入250μl60％peg。輕輕地將管倒置5次來(lái)輕柔混合管中的內(nèi)容物并在34℃溫育30分鐘。向每個(gè)管中加入3mlstc，向包含50mlpda+1m蔗糖的150mm平板中鋪布1.5ml內(nèi)容物并用一個(gè)無(wú)菌涂布器涂布開。將平板在28℃溫育約18小時(shí)，其后加入20mlpda+10mm尿苷+35μg/ml潮霉素b(invitrogencat#10687010)的覆蓋物。平板在28℃溫育6天直到挑選轉(zhuǎn)化子。孢子pcr為了篩選用于flp/frt載體整合的轉(zhuǎn)化子，通過孢子pcr來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。這通過用無(wú)菌的1μl接種環(huán)來(lái)收集孢子并將它們轉(zhuǎn)移到0.6mleppendorf管中的25μlte緩沖液中來(lái)完成。用高功率微波處理孢子1分鐘并立即將1μl加至advantagegcgenomiclapolymerasepcrmix中，advantagegcgenomiclapolymerasepcrmix包含以下組分：1×反應(yīng)緩沖液，200μμdntp，400nm各引物，1.25u聚合酶。使用以下循環(huán)參數(shù)和下文所述的正向引物和反向引物擴(kuò)增pcr產(chǎn)物用于5'整合或3'整合：95℃-10分鐘，30個(gè)95℃-30秒，56℃-30秒，72℃-1分鐘40秒的循環(huán)，和最后的72℃-7分鐘的循環(huán)。5'重組正向(#0611526):ttcccttcctctagtgttgaat(seqidno:142)反向無(wú)整合(#0611527):tcgtcgaatactaacatcttgc(seqidno:143)反向整合(#0611528):cacggacctcgaacctttatat(seqidno:144)3'重組正向(#999661):cagcgagagcctgacctattgcatc(seqidno:145)反向無(wú)整合(#069084):aacaaggtttaccggtttcgaaaag(seqidno:146)反向整合(#0611648):gtggctgccgaggtgtgtatacca(seqidno:147)將整個(gè)pcr反應(yīng)體系在1％瓊脂糖膠上在包含500ng/ml溴化乙錠的50mltae緩沖液中跑膠并用uv光使產(chǎn)物可視化。結(jié)果設(shè)計(jì)frt位點(diǎn)整合載體，pjfys147(圖18)，從而使位點(diǎn)能cbh1基因座處整合到基因組中。兩個(gè)frt位點(diǎn)略微不同，試圖防止它們之間發(fā)生不希望的重組，它們分別被命名為用于5'和3'位點(diǎn)的frt-f和frt-f3。用于將載體靶向基因座的5'cbh1側(cè)翼被選擇為，使得cbh1編碼序列以及啟動(dòng)子的1kb部分也會(huì)被缺失，因?yàn)閱?dòng)子也被引入到隨后使用的表達(dá)載體中并且成功的整合會(huì)修復(fù)啟動(dòng)子。由于載體在正確整合到cbh1基因座時(shí)還缺失了cbh1基因，這樣可以進(jìn)行簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選，因?yàn)閟ds-page圖譜會(huì)隨著cbh1的去除而實(shí)質(zhì)性改變。當(dāng)用pjfys147轉(zhuǎn)化菌株tv11的原生質(zhì)體時(shí)，得到133個(gè)轉(zhuǎn)化子。挑取所有這些轉(zhuǎn)化子并在纖維素酶誘導(dǎo)條件下進(jìn)行搖瓶分析。在所分析的133個(gè)轉(zhuǎn)化子中，兩個(gè)表現(xiàn)出與cbh1缺失一致的蛋白組圖譜。預(yù)期顯示出改變的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜的兩個(gè)轉(zhuǎn)化子在cbh1基因座具有frt整合質(zhì)粒。兩個(gè)菌株jfys147-20和jfys147-73被鋪布到含5-氟脫氧尿苷(fdu)的木霉屬基本培養(yǎng)基平板，以試圖促進(jìn)hpt/tk盒的切除。在平板上從菌株jfys147-20得到72個(gè)抗fdu菌落并從菌株jfys147-73得到一個(gè)菌苔。從菌株jfys147-20挑取8個(gè)菌落，命名為jfys147-20a～jfys147-20h，并從jfys147-73挑取菌苔的一部分，所得的菌株命名為jfys147-73a。通過southern對(duì)4個(gè)jfys147-20的分離株和jfys147-73的一個(gè)分離區(qū)域進(jìn)行分析，以確定frt盒是否已經(jīng)明確整合且hpt/tk標(biāo)記已被正確切除。southern分析顯示，一個(gè)轉(zhuǎn)化子即jfys47-20如預(yù)期的一樣在cbh1基因座處具有刪除盒，且生成的孢子后代已經(jīng)切除了hpt/tk標(biāo)記。另一個(gè)轉(zhuǎn)化子jfys47-73未顯示任何雜交。從jfys147-20b的基因組dna通過pcr擴(kuò)增包含frtf和frtf3位點(diǎn)的區(qū)域，并進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)兩個(gè)位點(diǎn)的存在。生成該菌株的原生質(zhì)體，并用flp/frt整合載體pjfys150(圖19)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。表達(dá)載體pjfys150是帶有用于潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的包含cbh1啟動(dòng)子和終止子的木霉屬表達(dá)載體的衍生物。pjfys150與其母體不同的是，它還包含存在于jfys147-20b的基因組中的frt-f和frtf3位點(diǎn)以及內(nèi)含子優(yōu)化的衍生自prika147(從huda獲得)的翻轉(zhuǎn)酶基因(flp)盒。所運(yùn)用的報(bào)告子是煙曲霉bg。用pmei將載體線性化以去除質(zhì)粒的細(xì)菌繁殖部分，所得的凝膠純化的片段用于轉(zhuǎn)化jfys147-20b原生質(zhì)體，得到20個(gè)轉(zhuǎn)化子。所得的20個(gè)轉(zhuǎn)化子在此代表2.5/μg的效率。通過擴(kuò)增插入位點(diǎn)的5'區(qū)域，通過孢子pcr來(lái)分析20個(gè)轉(zhuǎn)化子，以確定盒是否已經(jīng)整合到期望的基因座。如果盒的整合是異位的，則產(chǎn)生1kb片段，如果整合發(fā)生在frt位點(diǎn)，則結(jié)果為1.8kbpcr產(chǎn)物。在得到的20個(gè)轉(zhuǎn)化子中，18個(gè)似乎具有異位整合，而2個(gè)顯示出與在cbh1基因座的整合一致的pcr條帶，但是條帶大小小于預(yù)期。當(dāng)對(duì)pcr片段進(jìn)行測(cè)序時(shí)，結(jié)果表明重組已經(jīng)在基因座處的frtf位點(diǎn)之間和cbh1啟動(dòng)子內(nèi)的兩個(gè)不同區(qū)域發(fā)生。在轉(zhuǎn)化之前，向原生質(zhì)體儲(chǔ)液中加入1％木糖，試圖使需要的細(xì)胞反應(yīng)事件加速。用與之前一樣的表達(dá)載體pjfys150來(lái)轉(zhuǎn)化帶有額外木糖的原生質(zhì)體，得到19個(gè)轉(zhuǎn)化子。與之前一樣，通過對(duì)5'端進(jìn)行pcr篩選，還通過雜交至3'整合區(qū)域的額外引物組，來(lái)分析19個(gè)轉(zhuǎn)化子。結(jié)果表明，19個(gè)轉(zhuǎn)化子中有5個(gè)在5'區(qū)內(nèi)的frtf位點(diǎn)處整合入盒。而且，2個(gè)轉(zhuǎn)化子在pcr篩選中沒有給出條帶，意味著基因座的區(qū)域已經(jīng)在轉(zhuǎn)化期間重排，顯示出一定程度的不精確的基因座特異性靶向，如在先前的轉(zhuǎn)化子集合中看到的那樣。對(duì)轉(zhuǎn)化整合載體3'端進(jìn)行frtf3位點(diǎn)區(qū)域pcr篩選，表明5個(gè)轉(zhuǎn)化子已經(jīng)經(jīng)歷了在3'端的flp介導(dǎo)的必要整合，且5個(gè)轉(zhuǎn)化子中有3個(gè)已經(jīng)經(jīng)歷了兩個(gè)必要的重組。當(dāng)單獨(dú)分析每個(gè)區(qū)域時(shí)，一些轉(zhuǎn)化子已經(jīng)僅一個(gè)frt位點(diǎn)經(jīng)歷了期望的重組，但在另一個(gè)位點(diǎn)經(jīng)歷了非特異性重組。3個(gè)轉(zhuǎn)化子在兩個(gè)位點(diǎn)經(jīng)歷了所需的重組，這與沒有添加木糖到原生質(zhì)體存儲(chǔ)培養(yǎng)基的過程相比具有改進(jìn)。因此，在里氏木霉中成功地運(yùn)用了flp/frt體系，以向里氏木霉的cbh1基因座引入表達(dá)質(zhì)粒。具體地，生成菌株jfys147-20b，并且在cbh1基因座處包含frt位點(diǎn)。還產(chǎn)生了新的表達(dá)載體，其并入有cbh1啟動(dòng)子和終止子、作為選擇標(biāo)記的hpt基因、作為報(bào)告子的煙曲霉bg基因及體系所需的frt位點(diǎn)和flp基因。這個(gè)新載體，pjfys150，被用來(lái)運(yùn)用flp/frt體系將煙曲霉bg盒插入在cbh1基因座處，插入頻率為15.7％(或者為至少10.5％，因?yàn)槠渲幸粋€(gè)菌株在搖瓶繁殖過程中顯示出bg盒不穩(wěn)定性)。當(dāng)前第1頁(yè)12