本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和病毒檢測鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的熒光RT-RPA特異性檢測方法、其相應(yīng)的引物和探針組合以及包含該引物和探針組合的試劑盒。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)主要引起懷孕母豬的繁殖障礙和所有日齡豬的呼吸道癥狀，被認為是影響世界養(yǎng)殖業(yè)最重要的傳染病之一。引起該病的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于尼多病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒屬。PRRSV于1987年首次分離于北美，然后于1990年分離于西歐。目前，PRRSV遍布全球，成為造成經(jīng)濟損失最嚴重的豬病之一。根據(jù)PRRSV基因和抗原差異，目前將之分為兩個基因型，即歐洲型(基因1型)和美洲型(基因2型)。

我國自1986年首次分離到PRRSV以來，目前該病毒已經(jīng)遍及全國，并且部分地區(qū)豬群的感染率達到90％。2006年，以Nsp2基因出現(xiàn)30個不連續(xù)氨基酸缺失為特征的高致病性PRRSV在我國的爆發(fā)，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。2006年6月到9月，高致病性PRRSV造成約2,120,000頭豬感染，400,000頭豬死亡，而2007年1月到7月，造成約143,221頭豬的感染，39,455頭豬死亡。截至目前，我國豬群主要流行美洲型PRRSV，并且經(jīng)典毒株(C-PRRSV)和高致病性毒株(HP-PRRSV)同時存在。隨著我國大型養(yǎng)豬場和集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展，對豬病的現(xiàn)場、快速診斷將極大有益于豬場疫病控制，尤其是大型養(yǎng)豬場多位于邊遠地區(qū)的情況下。

上述事實清晰表明，對PRRSV的快速、現(xiàn)場診斷極大有益于我國豬場中PRRS的防控。傳統(tǒng)的PRRSV檢測技術(shù)，主要是病毒分離、免疫組化和免疫熒光技術(shù)，費時費力，對檢測人員技術(shù)要求較高，靈敏性低，無法滿足目前快速檢測的需要。

目前對PRRSV的實驗室分子診斷技術(shù)主要包括RT-PCR、同時檢測美洲型和歐洲型PRRSV、特異性檢測HP-PRRSV和同時檢測C-PRRSV和HP-PRRSV的熒光RT-PCR，以及特異性針對美洲型PRRSV的RT-LAMP方法。但是，PRRSV快速進化和基因變異使得建立長期有效的RT-PCR方法異常復(fù)雜，設(shè)計保持足夠敏感性的LAMP引物異常困難，從而導(dǎo)致假陰性檢測結(jié)果。同時，RT-PCR和RT-LAMP試劑需要冷鏈運輸、價格高昂的設(shè)備和經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員，從而難以應(yīng)用于現(xiàn)場檢測。因此，需要建立一種能夠用于PRRSV現(xiàn)場檢測的操作簡單、快速、準確和成本較低的檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明建立了一種能夠用于現(xiàn)場檢測，操作簡單、快速、特異性強、靈敏性高的PRRSV熒光RT-RPA檢測方法、其相應(yīng)的引物和探針組合以及包含該引物和探針組合的試劑盒。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的熒光RT-RPA特異性檢測的引物和exo探針組合，其關(guān)鍵技術(shù)在于，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示；反向引物序列如SEQ ID No.2所示；exo探針序列如SEQ ID No.3所示。

一種美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒熒光RT-RPA特異性檢測的方法，其關(guān)鍵技術(shù)在于，提取待測樣品的RNA為模板，利用上述的引物及exo探針組合進行擴增及實時熒光檢測。

檢測方法中，向50μL實時RT-RPA反應(yīng)體系中加入濃度均為10μM的正向引物和反向引物各2.1μL；濃度為10μM的exo探針0.6μL；RNA模板1μL；擴增程序為：使用RPA擴增儀于42℃下反應(yīng)20分鐘，并在擴增過程中實時收集檢測熒光信號。

一種用于美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒熒光RT-RPA特異性檢測的試劑盒，其關(guān)鍵技術(shù)在于，該試劑盒包含上述的引物和exo探針組合。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明根據(jù)美洲型PRRSV ORF7保守序列設(shè)計引物和exo探針，基于能夠?qū)崿F(xiàn)等溫擴增且收集熒光信號的設(shè)備，建立了能夠用于現(xiàn)場檢測，操作簡單、快速、特異性強、靈敏性高的PRRSV熒光RT-RPA檢測方法。

附圖說明

圖1 PRRSV熒光RT-RPA方法的特異性檢測I。

圖1中，1：PRRSV(JXA1-R)；2：FMDV；3：CSFV；4：PRV；5：PPV；6：PCV-2；7：豬基因組DNA。

圖2 PRRSV熒光RT-RPA方法的特異性檢測II。

圖2中，1：JXA1-R；2：VR-2332；3：HuN4-F112；4：TJM-F92；5：R98；6：Ch-1R；7：豬基因組DNA。

圖3 PRRSV熒光RT-RPA方法的敏感性檢測結(jié)果。

圖4 PRRSV real-time RT-PCR方法的敏感性檢測結(jié)果。

圖3和圖4中，1：10⁶copies RNA；2：10⁵copies RNA；3：10⁴copies RNA；4：10³copies RNA；5：10²copies RNA；6：10¹copies RNA；7：10⁰copies RNA。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。本發(fā)明保護范圍不限于實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員在權(quán)利要求限定的范圍內(nèi)做出任何改動也屬于本發(fā)明保護的范圍。

下述各實施例中，未注明具體條件的實驗方法，按照通常的常規(guī)條件或一起和試劑盒制造廠商所建議的條件。

下述各實施例中，需要的材料和設(shè)備如下。

病毒株與臨床樣品

6株P(guān)RRSV毒株，均來自商業(yè)化弱毒疫苗，其中3株C-PRRSV毒株，VR-2332、CH-1R和R98，分別來自德國勃林格殷格翰公司、維科生物技術(shù)開發(fā)公司和瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司；3株HP-PRRSV毒株，JXA1-R、HuN4-F112和TJM-F92，分別來自普萊柯生物工程股份有限公司、維科生物技術(shù)開發(fā)公司和青島易邦生物工程有限公司。

豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV,AV1412)，來自瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司商業(yè)化弱毒疫苗；O型口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease virus，F(xiàn)MDV，TypeO)，來自蘭州獸醫(yī)研究所商業(yè)化液相阻斷ELISA試劑盒；偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)和豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus-2，PCV-2)，均為本實驗室保存。

60份臨床樣品，包括淋巴結(jié)、肺臟、脾臟和肝臟，均來自河北省不同養(yǎng)豬場。取10mg樣品在1mL無菌PBS中研磨處理，4℃，3000g離心10min收集上清用于病毒RNA/DNA提取。

主要試劑和設(shè)備

TwistAmpTM RT exo kit，購自英國TwistDx公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit、NdeI酶、PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit均購自寶生物工程(大連)有限公司；pGEM-T-EASY載體、Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7均購自美國Promega公司。

等溫擴增熒光檢測儀(OptigeneⅢ，型號Genie III)，英國Optigene公司；實時熒光定量PCR儀(ABI 7500)，美國ABI公司；EPS梯度PCR儀，為美國Eppendorf公司產(chǎn)品；核酸蛋白測定儀(Nanodrop ND-2000)，為美國Thermo公司產(chǎn)品。

實施例1引物及exo探針的設(shè)計

參考GenBank中美洲型PRRSV ORF7序列(EF112445)，選擇特異性保守區(qū)域，設(shè)計RPA引物和exo探針，目的片段大小為178bp。引物和exo探針的序列見SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，如表1。

表1引物及exo探針序列

實施例2熒光實時RT-RPA檢測PRRSV

(一)病毒DNA/RNA提取

按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明，提取病毒株和臨床樣品上清液中核酸，并使用核酸蛋白測定儀(Nanodrop ND-2000)測定提取病毒核酸的濃度。所有提取的病毒RNA或DNA保存于-80℃，備用。

(二)實時RT-RPA反應(yīng)體系及條件

使用TwistAmp^TM RT exo kit配制50μL實時RT-RPA反應(yīng)體系。擴增反應(yīng)的50μL反應(yīng)體系中加入濃度10μM的正向引物序列(RPA-Forward)2.1μL(終濃度420nM)，濃度10μM的反向引物序列(RPA-Reverse)2.1μL(終濃度420nM)，濃度10μM的exo探針(RPA-Probe)0.6μL(終濃度120nM)，Buffer 29.5μL，蒸餾水12.2μL，混勻后轉(zhuǎn)入含有聚合酶、重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和外切核酸酶III等凍干制劑的0.2mL反應(yīng)管中，將1μLRNA模板、2.5μL濃度為280mM的MgAc(終濃度14mM)加入該反應(yīng)管中。將反應(yīng)管蓋緊后瞬時離心并渦旋后，放入Genie III中，42℃反應(yīng)20min。在擴增過程實時收集檢測熒光信號，目的基因擴增后熒光信號會明顯增加。

實施例3特異性

以C-PRRSV，HP-PRRSV，CSFV，F(xiàn)MDV，PRV，PPV和PCV-2的病毒RNA或DNA，通過實施例2的方法進行實時熒光RT-RPA檢測，確定是否出現(xiàn)特異性擴增曲線。結(jié)果如圖1和圖2所示。

結(jié)果表明C-PRRSV毒株(VR-2332，R98and CH-1R)和HP-PRRSV毒株(JXA1-R，HuN4-F112and TJM-F92)均出現(xiàn)特異性擴增曲線(見圖2)，而其他病毒則沒有出現(xiàn)擴增(見圖1)，說明該方法具有良好的特異性，能過實現(xiàn)對不同C-PRRSV毒株和HP-PRRSV的特異性檢測，而不能擴增豬場常見的其他病原。這對于我國豬場中C-PRRSV和HP-PRRSV同時存在的現(xiàn)實具有重要意義。

需要說明的是，在本發(fā)明建立的針對美洲型PRRSV的熒光RT-RPA方法中，在反應(yīng)即將結(jié)束時出現(xiàn)了熒光的急劇升高(見圖1和圖2)。其原因在于，在TwistAmp^TM RT exo反應(yīng)中，聚合酶和外切核酸酶III處于競爭關(guān)系，當反應(yīng)即將結(jié)束，能量耗盡時，外切核酸酶III占據(jù)主導(dǎo)地位，進而導(dǎo)致exo探針的大量切割而出現(xiàn)熒光的突然升高。

實施例4敏感性

(I)PRRSV體外轉(zhuǎn)錄RNA的制備

以JXA1-R病毒RNA作為模板，以表2中N-forward和N-Reverse為引物進行RT-PCR，獲得433bpRT-PCR產(chǎn)物，涵蓋了PRRSV 3’端ORF7和3’非編碼區(qū)的部分區(qū)域。使用DNA純化回收試劑盒回收純化433bpRT-PCR產(chǎn)物，將之克隆到pGEM-T Easy載體中，并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞DH5α，獲得重組質(zhì)粒pGEM-T-PRRSV-N。

表2N-forward和N-Reverse引物序列

使用Nde I將pGEM-T-PRRSV-N線性化，使用Wizard SV Gel and PCR純化試劑盒進行純化回收后，使用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7進行體外轉(zhuǎn)錄。室溫下采用100μL體系：T7Transcription 5X Buffer 20μL，rNTPs(25mM ATP，CTP，GTP，UTP)30μL，linear DNA template(5–10？？g total)plus Nuclease-Free Water 40μL，Enzyme Mix(T7)10μL，輕輕充分混勻，37℃反應(yīng)2-4h。使用RNase-Free DNase I處理RNA，20-25℃孵育10min，以除去殘留的DNA，純化RNA。

所有體外轉(zhuǎn)錄PRRSV RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定大小均為433bp左右，并使用Nanodrop ND-2000測定濃度，通過公式計算拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(copies/μL)＝[RNA濃度(g/μL)/(RNA堿基數(shù)×340)]×6.02×10²³，并10倍系列稀釋至1.0copies/μL。

(II)敏感性分析

將體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA進行10倍倍比稀釋，使其濃度在10⁶-10⁰拷貝/μL之間，10⁶-10⁰拷貝/μL系列濃度的體外轉(zhuǎn)錄PRRSV RNA以1μL作為模板進行實時RT-RPA反應(yīng)，確定該方法的最低檢測濃度。與OIE參考方法進行比較。

OIE參考方法，即在ABI7500上進行美洲型PRRSV的熒光RT-PCR檢測。熒光RT-PCR檢測方法所用引物及序列如表3所示。在反應(yīng)體系配制中，使用One Step PrimeScript RT-PCR Kit代替原方法中使用的反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、dNTP混合液等試劑，其他試劑濃度不變。反應(yīng)條件為：42℃5min；95℃10s；95℃5s，60℃34s，40個循環(huán)。

結(jié)果表明，熒光RT-RPA最低可以檢測到10²拷貝病毒RNA(見圖3)，同OIE推薦熒光RT-PCR方法一致(見圖4)。熒光RT-RPA對10⁶-10²拷貝病毒RNA的檢測時間是5-15min，而熒光RT-PCR的檢測Ct值是21-37，所需時間則為40-60min。

表3熒光RT-PCR所用引物及序列

實施例5對臨床樣品的檢測

采用OIE推薦熒光RT-PCR方法及本發(fā)明實施例2中的熒光RT-RPA方法進行測試。在60份臨床實際樣品中，熒光RT-RPA對PRRSV的陽性檢出率為86.6％(52/60)，而熒光RT-PCR的陽性檢出率則為83.3％(50/60)(結(jié)果見表4)。對于陽性樣品的檢測時間，熒光RT-RPA為3-16min，而熒光RT-PCR則為1h左右。這說明，本發(fā)明建立的熒光RT-RPA的檢測效果要優(yōu)于熒光RT-PCR，就檢測時間而言，熒光RT-RPA為3-16min，遠遠小于熒光RT-PCR所需要的30-60min。

表4熒光RT-RPA和熒光RT-PCR對臨床樣品的檢測結(jié)果比較

綜合上述各實施例，本發(fā)明建立了一種特異性快速檢測美洲型PRRSV的熒光RT-RPA方法。聚合酶重組酶擴增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一種基于等溫擴增的分子檢測技術(shù)。RPA已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于疫病病原的檢測。相對于普通PCR和熒光PCR，RPA具有以下優(yōu)勢：1、RPA試劑以凍干粉形式存在，在運輸和保存過程中不需要冷鏈，可以在25℃下存放12周，45℃下存放3周；2、RPA能夠在5-20min內(nèi)獲得檢測結(jié)果，遠遠快于PCR方法(一般需要60min以上)；3、RPA所用的引物和探針可以耐受5-9個堿基的錯配，而對檢測結(jié)果沒有影響，從而可以耐受檢測對象的一定程度上的突變，而熒光PCR所用的探針的突變能夠造成檢測的失敗；4、RPA對常見的PCR抑制劑具有一定的耐受性，并且可以不同的生物樣品(如血清、糞便、尿液、血漿、動物組織、鼻拭子等)，從而降低了對樣品的制備需求；5、RPA具有多種結(jié)果呈現(xiàn)形式，可以通過瓊脂糖凝膠電泳、實時熒光檢測或試紙條形式進行結(jié)果判定；6、RPA屬于等溫擴增，無需復(fù)雜的升降溫控制。

目前，核酸等溫擴增技術(shù)由于其操作簡單、快速和成本低的特點，成為PCR檢測技術(shù)的代替者。相比較于其他等溫擴增技術(shù)，RPA無需在反應(yīng)開始時升溫解鏈模板DNA，一直處于等溫過程中實現(xiàn)對靶基因的指數(shù)擴增。由于RPA的簡便性(簡單的操作)、多樣性(用于核酸檢測的不同商業(yè)化試劑盒)和快速(5-20min)，RPA可能是最適于傳染病田間和現(xiàn)場檢測的方法。目前針對PRRSV的檢測，也建立了多個RT-LAMP方法。不同于RT-RPA，在RT-LAMP方法建立過程中需要設(shè)計特異性強、性能良好的4-6引物，這對于易于變異的PRRSV來說，是非常困難的。同時LAMP對引物堿基錯配的耐受性尚不明確。另外，上述建立的RT-LAMP方法反應(yīng)時間均為40-50min，遠遠長于RT-RPA反應(yīng)時間。

RPA屬于等溫擴增技術(shù)，除了可以應(yīng)用于環(huán)境設(shè)備良好的實驗室外，還可以被廣泛應(yīng)用于不發(fā)達地區(qū)實驗室，甚至是現(xiàn)場檢測。本研究中所使用檢測設(shè)備的小巧、輕便、便攜，結(jié)合熒光RT-RPA操作的簡便性、試劑無需冷鏈保存的特點，所建立的熒光RT-RPA方法具有田間應(yīng)用的巨大優(yōu)勢和潛力，可以應(yīng)用于現(xiàn)場診斷和田間監(jiān)測，特別是豬場所在的偏遠地區(qū)。

總之，本發(fā)明建立了一種基于exo探針的能夠有效檢測C-PRRSV和HP-PRRSV的熒光RT-RPA方法。綜合反應(yīng)敏感性和檢測時間而言，該方法要優(yōu)于OIE推薦的熒光RT-PCR方法。本發(fā)明建立針對PRRSV熒光RT-RPA方法的便攜性好(Genie III,規(guī)格：25cm×16.5cm×8.5cm，重量：1.75kg)，能夠使之在疫病發(fā)生現(xiàn)場、口岸和檢疫一線使用，對于我國PRRSV的防控具有重要意義。

根據(jù)上述的實施例對本發(fā)明作了詳細描述。需說明的是，以上的實施例僅為了舉例說明發(fā)明而已。在不偏離本發(fā)明的精神和實質(zhì)的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計出本發(fā)明的多種替換方案和改進方案，其均應(yīng)被理解為在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心

<120> 一種美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的熒光RT-RPA特異性檢測

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CGGAGAAGCC CCATTTCCCT CTAGCGACTG 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

TGCGTCGGCA AACTAAACTC CACAGTGTAA 30

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CAATTGTGTC TGTCGTCGAT CCAGACTGCC TTCATCAGGG CGCTGGAACC 50