本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種突變的α-淀粉酶及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：淀粉是自然界中僅次于纖維素的第二大多糖儲備物質(zhì)，是許多食品與非食品行業(yè)的重要組成部分。直到１９世紀之前，淀粉水解使用的是稀釋鹽酸的酸水解法，但因該法的糖含量較低且產(chǎn)生一些不必要的化合物，現(xiàn)在幾乎完全被酶水解法取代。α-淀粉酶，即α-１,４-葡聚糖水解酶，普遍分布在動物、植物和微生物中，能隨機作用于淀粉、糖原、寡糖或多聚糖分子內(nèi)部的α-１,４-糖苷鍵，將淀粉水解成糊精、麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等一系列小分子物質(zhì)。世界酶市場呈現(xiàn)一種高速增長現(xiàn)象，２００５年世界酶市場在３０億美元左右，２００９年在５１億美元，２０１０年已增長至５８億美元，同時預(yù)計２０２０年將達到１００億美元以上，其中淀粉酶產(chǎn)業(yè)約占３０％左右。α-淀粉酶是最早實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)并且是迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑品種，幾乎占淀粉酶制劑總產(chǎn)量的５０％以上。特別是微生物產(chǎn)α-淀粉酶已廣泛應(yīng)用于食品、飲料、制藥、紡織等行業(yè)。耐高溫α-淀粉酶廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，如洗滌劑產(chǎn)業(yè)、紡織業(yè)、釀酒與烘焙行業(yè)。這些產(chǎn)業(yè)在淀粉加工時往往需要在較高的溫度下進行，耐高溫α-淀粉酶最直接的效應(yīng)就是減少了冷卻步驟，降低能源消耗和成本。其次，在高溫環(huán)境下許多雜菌的生長受到抑制，降低了生產(chǎn)過程中的污染。耐高溫α-淀粉酶的開發(fā)對淀粉加工行業(yè)有巨大的經(jīng)濟效益。目前使用的α-淀粉酶最適溫度在９５℃左右、ｐＨ在５．８～６．８之間，而工業(yè)生產(chǎn)過程中自然淀粉漿的ｐＨ在３．２～４．５之間，因此α-淀粉酶不能適應(yīng)低ｐＨ的生產(chǎn)過程。為了調(diào)整其作用ｐＨ，往往需要將淀粉漿的ｐＨ從３．２～４．５調(diào)至５．８～６．２，且需添加Ｃａ２＋作為穩(wěn)定劑。而下一個糖化步驟的ｐＨ在４．２～４．５，同α-淀粉酶的使用，可以使淀粉漿液化糖化的步驟省去調(diào)節(jié)ｐＨ與脫去Ｃａ２＋的進一步純化，簡化工藝流程，降低生產(chǎn)成本?；谄胀é?淀粉酶往往存在熱穩(wěn)定差與ｐＨ不適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)等問題，目前研究者著重研究耐酸耐高溫α-淀粉酶，使更利于工業(yè)生產(chǎn)，對于節(jié)約能源、降低成本等有重要意義。古菌激烈火球菌生長環(huán)境特殊，其本身所含的基因蛋白抗逆性極強，其本身攜帶的淀粉酶（PFAMY）耐高溫、強酸。本發(fā)明將激烈火球菌的淀粉酶（PFAMY）進行優(yōu)化合成以及突變，最終獲得突變的、酶活穩(wěn)定性提高的具有更好的工業(yè)應(yīng)用前景的α-淀粉酶。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種酶活穩(wěn)定性提高的具有更好的工業(yè)應(yīng)用前景的突變型的α-淀粉酶。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種突變的α淀粉酶的耐高溫氨基酸序列，其氨基酸序列與激烈火球菌菌屬α-淀粉酶（PFAMY）SEQIDNO:1具有至少90％以上的同源性。所提供的氨基酸序列在SEQIDNO:1的氨基酸序列基礎(chǔ)上，有下列一個或多個位點的氨基酸被其它氨基酸所替換，被替換的氨基酸位點為：W65、C204、N366。優(yōu)選地，上述淀粉酶突變?yōu)榫哂蠸EQIDNO:2所示的氨基酸序列，即在野生型激烈火球菌菌屬α-淀粉酶（PFAMY）氨基酸序列SEQIDNO:1基礎(chǔ)上，在其氨基酸W65、C204、N366位置有突變。優(yōu)選地，上述突變的α-淀粉酶在SEQIDNO:1氨基酸序列基礎(chǔ)上，有一個或多個位點的氨基酸被所述氨基酸替換見SEQIDNO:2，所述氨基酸為：W65D、C204N、N366C。一種突變的α-淀粉酶，具有如SEQIDNO:3所示DNA序列。該序列具有以下特征：a.該基因序列為根據(jù)SEQIDNO:2氨基酸序列，針對宿主大腸桿菌表達所需的優(yōu)選密碼子和基因高效表達所需的G（鳥嘌呤）、C（胞嘧啶）堿基含量，進行全基因合成的全新DNA序列；b.該基因與野生型激烈火球菌屬α-淀粉酶（PFAMY）基因序列（SEQIDNO:4）相比，稀有密碼子從13個降到0個；同時刪除了原基因SEQIDNO:4內(nèi)部的NdeI、SacI酶切位點。進一步地，含有上述突變的α-淀粉酶氨基酸序列或DNA的重組載體、宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。一種含有權(quán)利要求1所述氨基酸序列或權(quán)利要求要求2所述DNA序列的重組載體。一種含有權(quán)利要求1所述氨基酸序列或權(quán)利要求要求2所述DNA序列的宿主菌。本發(fā)明依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，構(gòu)建了含有上述突變的α-淀粉酶基因（SEQIDNO:2）（《精編分子生物學(xué)實驗指南第四版》第8章方法和《分子克隆試驗指南第三版》第15章方案2方法構(gòu)建）；選擇誘導(dǎo)型載體如PET系列（Novagen公司購買）或其它誘導(dǎo)型載體，如：一種攜帶上述突變基因的誘導(dǎo)型表達載體PET30-PFAMY(見圖1)。本發(fā)明采用誘導(dǎo)型載體，其所述的的宿主菌優(yōu)選為E.coliBL21(DE3)(Promegea公司)或JM109（DE3）（生工生物工程（上海）有限公司）或其它適宜菌株為受體菌。上述含有PET30-PFAMY的受體構(gòu)建方法，參照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的氯化鈣或電穿孔轉(zhuǎn)移法（J.薩姆布魯克等，《分子克隆試驗指南第三版》第1章方案25或方案26）。本發(fā)明的工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達后，采用離心、超聲破壁、加熱、pH調(diào)整、鹽析等步驟進行純化，即可用于α-１,４-葡聚糖的水解。本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：（1）突變后的PFAMY基因在大腸桿菌中表達量達到了10000u/l，比之前的野生型的酶活有了大幅的提高，簡化該酶工業(yè)化后期處理，降低成本；（2）突變后的PFAMY熱穩(wěn)定性增加，由原來的最適溫度90℃變?yōu)?00℃，熱穩(wěn)定性更強，酶活更穩(wěn)定；（3）該酶在90℃高溫條件下，在實驗設(shè)計的4個小時內(nèi)，野生型與突變的的PFAMY酶活都沒有變低，高溫穩(wěn)定性強；在100℃時隨時間的延長野生型PFAMY酶活下降，而突變的PFAMY酶活穩(wěn)定，證明在100℃下，突變的PFAMY半衰期延長，熱穩(wěn)定性強，增強了其工業(yè)應(yīng)用潛力。附圖說明圖1質(zhì)粒PET30-PFAMY的圖譜。圖2溫度對野生型與突變的PFAMY的影響。圖3長時間高溫對野生型與突變的PFAMY的影響。具體實施方式為了更好的理解本發(fā)明，下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述和說明。實施例1基因設(shè)計及合成（1）基因設(shè)計：根據(jù)Genebank中古生菌PyrococcusfuriosusDSM3638蛋白序列（SEQIDNO：1，Genebank：AAL80601.1），在其W65、C204、N366位點引入突變位點，及得到如SEQIDNO:2所示氨基酸序列；利用在線設(shè)計工具Jcat（http://www.jcat.de/）反向設(shè)計基因序列。針對宿主大腸桿菌表達所需的優(yōu)選密碼子和基因高效表達所需的G＋C堿基含量，優(yōu)化上述設(shè)計的基因序列為SEQIDNO:3序列，該序列與野生型基因序列SEQIDNO:4相比：大腸桿菌稀有密碼子從野生型（SEQIDNO:4）的13個降低到了0個，同時在設(shè)計過程中去除NdeI、SacI酶切位點，有利后期基因操作。通過上述系列設(shè)計有利于宿主菌大腸桿菌高效表達該基因（SEQIDNO:3）。（2）基因合成：根據(jù)SEQIDNO:3所示基因序列，即PFAMY片段交由生工生物工程（上海）有限公司進行全基因合成。2表達載體PET30-PFAMY及轉(zhuǎn)化體BL21(DE3)/PET30-PFAMY的構(gòu)建（1）質(zhì)粒PET30-PFAMY的構(gòu)建：對步驟1獲得的基因片段PFAMY使用BamHI、HindIII雙酶切。酶切體系如下：酶切體系50μL，ASPGA片段5μL（2μg），BamHI、HindIII酶各1μL，緩沖液5μL，滅菌雙蒸水補足50μL。37℃保溫4小時。采用相同的體系酶切質(zhì)粒PET30（Novagen公司）。通過酶切得到線性片段，采用DNA凝膠回收試劑盒（生工生物工程（上海）有限公司）純化得到目的片段。使用T4連接酶對所得片段進行連接反應(yīng)，體系如下：T4DNA連接酶1μL，PFAMY酶切片段3μL，PET30酶切片段2μL，連接緩沖液1μL，滅菌雙蒸水補足10μL。16℃保溫4小時。將保溫后的產(chǎn)物，通過熱激方法（J.薩姆布魯克等，《分子克隆試驗指南第三版》第1章方案25或方案26）轉(zhuǎn)化到宿主菌E.coliDH5α中，涂布到LB培養(yǎng)抗性平板（配方見《分子克隆試驗指南第三版》第一章），37℃保溫過夜。隨機挑取陽性克隆，進行LB液體培養(yǎng)基（配方見《分子克隆試驗指南第三版》第一章）37℃，220rpm培養(yǎng)過夜。采用質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校ㄉど锕こ蹋ㄉ虾＃┯邢薰荆┨崛≠|(zhì)粒，即得到所構(gòu)建的質(zhì)粒PET30-PFAMY（見圖1）。(2)轉(zhuǎn)化體BL21(DE3)/PET30-PFAMY的構(gòu)建（參照J.薩姆布魯克等，《分子克隆試驗指南第三版》方法）挑取大腸桿菌BL21（DE3）單菌落到LB試管接種后在37℃振蕩過夜培養(yǎng)；在含50mlLB的三角瓶中加入0.5ml的過夜培養(yǎng)液，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)約2小時使菌體長到對數(shù)前期；.無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，冰上放置10分鐘；4℃，4000rpm離心，倒出上清，將管倒置，使殘余液盡量流出；加入6ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2重懸沉淀，放置冰上30分鐘；4℃，3000rpm離心，倒出上清，將管倒置，使殘余液盡量流出；加入1.2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2重懸沉淀（若要制備于-70°C保存?zhèn)溆玫母惺軕B(tài)細胞，則加入含有20%甘油的0.1mol/LCaCl2懸浮菌體），4℃放置5~24小時后轉(zhuǎn)化；吸200μl感受態(tài)細胞懸液，加DNA（體積<10μl,DNA<50ng）輕輕混勻，冰上放置30分鐘；42℃水浴靜止熱激90秒，立即放入冰上冷卻；加入500μl液體LB培養(yǎng)液，混勻，放入37℃搖床低速搖動復(fù)蘇45分鐘（也可加LB后直接放入37℃水浴復(fù)蘇1小時，中間振蕩管子使細胞懸?。晃∞D(zhuǎn)化的細胞涂布加有抗生素的平板上，放于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，生長出的菌落即為轉(zhuǎn)化體PET30-PFAMY/BL21(DE3)。3轉(zhuǎn)化體BL21(DE3)/PET30-PFAMY的誘導(dǎo)表達挑取單菌落于含50μg/mLKan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃250r/min培養(yǎng)過夜后成為活化種子，再以2%的接種量接種到M9培養(yǎng)基（裝液量為50mL/250mL,23℃250r/min培養(yǎng)14小時，加入終濃度為0.05mMIPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)中，進行誘導(dǎo)表達，繼續(xù)培養(yǎng)12小時，離心收集菌體。其中，M9培養(yǎng)基的配置方法為：（1）配制1M的MgSO4:MgSO4·7H2O2.46g加雙蒸水10mL溶解，高壓滅菌備用；（2）配制1M的Cacl2:Cacl2·6H2O2.191g加雙蒸水10mL溶解，高壓滅菌備用；（3）配制5×M9鹽溶液：Na2PO4·7H2O12.8g；KH2PO43.0g；Nacl0.5g；NH4cl1.0g；加雙蒸水200mL溶解，121度滅菌15分鐘；（4）配制20%的葡萄糖溶液：4g葡萄糖加雙蒸水20mL溶解，0.22微米濾器過濾除菌；（5）無菌操作配制M9培養(yǎng)基：5×M9鹽溶液200mL；1M的MgSO42mL；20%的葡萄糖溶液20mL；1M的Cacl20.1mL；加滅菌雙蒸水至1000m。4PFAMY淀粉水解酶酶活測定離心收集使用步驟3方法得到的菌體，加入等體積的0.02M，pH8.0的磷酸鹽緩沖液，使用超聲波細胞破壁儀進行破壁20分鐘；離心得到上清為粗制酶液。試劑和溶液1）碘。2）碘化鉀。3）原碘液：稱取11.0g碘和22.0g碘化鉀，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，貯存于棕色瓶中。4）稀碘液：吸取原碘液2.00mL，加20.0g碘化鉀用水溶解并定容至500mL，貯存于棕色瓶中。5）可溶性淀粉溶液(20g/L)：稱取2.000g（精確至0.001g）可溶性淀粉（以絕干計）于燒杯中，用少量水調(diào)成漿狀物，邊攪拌邊緩緩加入70mL沸水中，然后用水分次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液倒入其中，攪拌加熱至完全透明，冷卻定容至100mL。溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。（注：可溶性淀粉應(yīng)采用湖州展望化學(xué)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的酶制劑專用可溶性淀粉。）6）磷酸緩沖液（pH-5.0）：稱取36.88g磷酸氫二鈉(Na2HP04·12H20)和9.32g檸檬酸(C6H807.H2O)，用水溶解并定容至1000mL。用pH計校正后使用。7）鹽酸溶液[c(HCI)=0.1mol/L]：按GB/T601配制。儀器1）分光光度計。2）恒溫水?。嚎販鼐韧?.1℃。3）自動移液器。4）試管：25mm×200mm。5）秒表。分析步驟待測酶液的制備準確吸取酶液1.00mL，用少量磷酸緩沖液充分溶解，將上清液小心傾入100mL的容量瓶中，若有剩余殘渣，再加少量磷酸緩沖液充分研磨，最終樣品全部移入容量瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度，搖勻。用四層紗布過濾，濾液待用。測定吸取20.0mL可溶性淀粉溶液于試管中，加入磷酸緩沖液5.00mL，搖勻后，置于95℃土0.2℃恒溫水浴中預(yù)熱8min;加入1.00mL稀釋好的待測酶液，立即計時，搖勻，準確反應(yīng)5min;立即用自動移液器吸取1.00mL反應(yīng)液，加到預(yù)先盛有0.5mL鹽酸溶液和5.00mL稀碘液的試管中，搖勻，并以0.5mL鹽酸溶液和5.00mL稀碘液為空白，于660nm波長下，用10mm比色皿迅速測定其吸光度(A)。根據(jù)吸光度查國標GB/T601，求得測試酶液的濃度。耐高溫淀粉酶制劑的酶活力按下式計算：X=C×N×16.67式中：X:樣品的酶活力，u/mL或u/g;C:測試酶樣的濃度，u/mL或u/g；N:樣品的稀釋倍數(shù)；16.67:根據(jù)酶活力定義計算的換算系數(shù)。所得結(jié)果表示至整數(shù)。6突變的PFAMY在淀粉水解中的應(yīng)用。經(jīng)過突變的PFAMY在本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，誘導(dǎo)后48小時發(fā)酵單位達到10000u/l，與野生型的PFAMY2500u/l相比較，提高了3倍，突變位點顯著地提高了發(fā)酵單位，為后期處理提供了方便。表1突變的PFAMY與野生型的PFAMY發(fā)酵后的酶活發(fā)酵時間誘導(dǎo)后24小時誘導(dǎo)后48小時突變的PFAMY3500u/l10000u/l無突變的PFAMY1500u/l2500u/l突變后的PFAMY熱穩(wěn)定性有所增加，由原來的最適溫度90℃變?yōu)?00℃，熱穩(wěn)定性更強，酶活更穩(wěn)定，見圖2；將野生型PFAMY以及突變后的PFAMY的反應(yīng)體系分別置于60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃進行反應(yīng)，它們在90-100攝氏度時酶活達到最高點，然后隨溫度的上升酶活急速下降（見圖2.將最高值設(shè)定成為100，其余酶活按100進行折算）；該酶在90℃高溫條件下，在實驗設(shè)計的4個小時內(nèi)，野生型與突變的的PFAMY酶活幾乎沒有變化，穩(wěn)定性強；在100℃時隨時間的延長野生型PFAMY酶活下降，而突變的PFAMY酶活穩(wěn)定，證明在100℃下，突變的PFAMY半衰期延長，熱穩(wěn)定性強，增強了其工業(yè)應(yīng)用潛力（見圖3.將最高值設(shè)定成為100，其余酶活按100進行折算）。當(dāng)前第1頁1 2 3