本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)的油菜檢測方法。

背景技術(shù)：

HmgI/Y基因?yàn)橛筒吮旧砉逃谢?。利用油菜本身固有的基因HmgI/Y作為參照指示基因的檢測方法，主要集中在普通的定性及定量PCR方法和標(biāo)準(zhǔn)，尚無關(guān)于檢測油菜特定基因位點(diǎn)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光檢測技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是Notomi等，于2000年發(fā)明的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計(jì)4-6條特異性引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件下(60-65℃)反應(yīng)，在1h內(nèi)即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，目的片段可以擴(kuò)增10⁹倍。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增效率高、省時、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，在核酸檢測方面具有明顯優(yōu)勢。目前環(huán)介導(dǎo)等溫檢測技術(shù)的產(chǎn)物檢測方法主要有濁度法、染料法、電泳法以及核酸試紙條，但是這些方法都容易引起交叉污染。

核酶是一種具有類過氧化物酶活性、富含鳥嘌呤的單鏈DNA分子，在特定的條件下能夠折疊成G4重結(jié)構(gòu)，在H₂O₂存在下能夠催化無色底物2,2′-連氮基-雙-(3-乙基并二氫噻唑啉-6-磺酸)二價陰離子(ABTS^2-)氧化成藍(lán)綠色物質(zhì)ABTS^-·自由基。當(dāng)存在單鏈DNA分子的互補(bǔ)鏈時，這種類過氧化物酶的活性降低甚至消失。將折中顯色/消光技術(shù)結(jié)合到環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)上，利用引物顯色，產(chǎn)物消光的手段，來驗(yàn)證目的片段的存在。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一套用于檢測油菜的LAMP引物組合以及含有該引物組合的試劑盒。

本發(fā)明的另一目的是提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)的油菜檢測方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一套用于檢測油菜的LAMP引物組合，所述引物組合根據(jù)油菜的外源基因--抗草甘膦基因Epsps設(shè)計(jì)，包括(Seq ID No:1-4)：

外側(cè)正向引物HmgI/Y-F3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGCTAAGGCGAAAGGACCTTCC-3’；

外側(cè)反向引物HmgI/Y-B3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGGCACCATCGCAGGCTTC-3’；以及

內(nèi)側(cè)正向引物HmgI/Y-FIP：5’-TTCGGCGGTCGTCCACGTGCTGGGAGGGAGGGAGGGTCGGAGGTGGAGACGAAAGT-3’；

內(nèi)側(cè)反向引物HmgI/Y-BIP：5’-CAGAAGACGGAATCCGAGGCGGCTGGGAGGGAGGGAGGGGCCCTCTCCGCTCCCCAGCC-3’。

本發(fā)明還提供含有上述LAMP引物組合用于檢測油菜的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、甜菜堿、ABTS顯色液、hemin工作液、H₂O₂溶液(優(yōu)選30％H₂O₂溶液)、Thermopol緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板等中的至少一種。

其中，所述ABTS顯色液的濃度為36mM，配制溶劑為1×DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

所述hemin工作液的組成如下：50μM hemin、10mM NaH₂PO₄、100mM KCl、2mM MgCl₂和0.003％Triton X-100。

本發(fā)明中，Bst DNA聚合酶凍干在PCR管內(nèi)底部，于-20℃保存。dNTPs、ABTS顯色液、hemin工作液、ABTS粉劑、DMSO緩沖液、30％H₂O₂可常溫保存。反應(yīng)液需4℃保存。

本發(fā)明還提供所述LAMP引物組合或所述試劑盒在檢測油菜中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)的油菜檢測方法，包括以下步驟：

1)采集油菜籽，將樣品在液氮中研磨成粉末，稱100mg±10mg樣品，用CTAB法提取基因組，作為DNA模板；

2)顯色反應(yīng)，并通過肉眼觀察反應(yīng)混合液的顏色，或利用紫外分光光度計(jì)測定反應(yīng)混合液在419nm處的OD值：

3)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用所述LAMP引物組合，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光反應(yīng)：

4)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

步驟1)可采用CTAB法提取待測樣品中的DNA。

步驟2)具體為：將hemin工作液與所述LAMP引物組合混合，35-45℃孵育20-30min，然后添加ABTS顯色液和H₂O₂，立即用肉眼觀察顏色或利用紫外分光光度計(jì)測定OD_419nm值；

顯色反應(yīng)的反應(yīng)體系為：40-60μM hemin工作液90μL，10μM引物HmgI/Y-F3和HmgI/Y-B3各0.5μL，10μM引物HmgI/Y-FIP和HmgI/Y-BIP各3-4μL，30-40mM ABTS顯色液30μL，30％H₂O₂ 1μL，用dd H₂O補(bǔ)足至總體系130μL。

步驟3)具體為：向步驟2)顯色反應(yīng)所得混合液中添加16μL擴(kuò)增試劑，所述擴(kuò)增試劑包括1.8-3.0mM dNTP、6-9mM MgSO₄、1-2M甜菜堿、3.6-10.0U Bst DNA聚合酶、1×Thermopol緩沖液和2μL DNA模板，配制反應(yīng)體系，然后60-65℃孵育40-60min，80-85℃放置2-3分鐘，最后冰上終止反應(yīng)。

步驟4)具體為：目測判定反應(yīng)前后反應(yīng)混合液顏色變化，或利用紫外分光光度計(jì)測定步驟3)所得反應(yīng)混合液在419nm處的OD值；若顏色由反應(yīng)前的藍(lán)色變成淺藍(lán)色或無色，或者反應(yīng)后OD_419nm值變小，表明待測樣品中含有油菜成分。

本發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光反應(yīng)在水浴鍋或金屬浴內(nèi)進(jìn)行。

本發(fā)明通過對影響環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的因素(dNTPs、甜菜堿、引物、Mg²⁺、Bst DNA聚合酶、溫度、反應(yīng)時間等)進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了最佳的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。

在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中，基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)的油菜檢測方法包括以下步驟：

①采集油菜籽，將樣品在液氮中研磨成粉末，稱100mg±10mg樣品，用CTAB法提取基因組，作為DNA模板(例如將提取的基因組DNA稀釋至50ng/μL作為模板)；

②顯色反應(yīng)：將hemin工作液與LAMP引物組合混合，40℃孵育30min，然后添加ABTS顯色液和H₂O₂，立即用肉眼觀察顏色或利用紫外分光光度計(jì)測定OD_419nm值；

顯色反應(yīng)的反應(yīng)體系為：50μM hemin工作液90μL，10μM引物HmgI/Y-F3和HmgI/Y-B3各0.5μL，10μM引物HmgI/Y-FIP和HmgI/Y-BIP各4μL，36mM ABTS顯色液30μL，30％H₂O₂ 1μL，用dd H₂O補(bǔ)足至總體系130μL；

③環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光反應(yīng)：向步驟②顯色反應(yīng)所得混合液中添加16μL擴(kuò)增試劑，所述擴(kuò)增試劑包括2.5mM dNTP、7.8mM MgSO₄、1.6M甜菜堿、8.0U Bst DNA聚合酶、1×Thermopol緩沖液和2μL DNA模板，配制反應(yīng)體系，然后65℃孵育40min，85℃放置3分鐘，最后冰上終止反應(yīng)；

④目測判定反應(yīng)前后反應(yīng)混合液顏色變化，或利用紫外分光光度計(jì)測定步驟③所得反應(yīng)混合液在419nm處的OD值；若顏色由反應(yīng)前的藍(lán)色變成淺藍(lán)色或無色，或者反應(yīng)后OD_419nm值變小，表明待測樣品中含有油菜成分。

本發(fā)明利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)檢測油菜具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(一)反應(yīng)快速，一般情況下在15-30min即可有大量的擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生，為了保證檢測準(zhǔn)確度，本發(fā)明優(yōu)選反應(yīng)時長為40min，在此時間內(nèi)即可將模板擴(kuò)增10⁹倍，該方法操作簡便，適于核酸分子的快速檢測。

(二)特異性好，該方法對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計(jì)引物，引物具有更高的特異性。

(三)靈敏度高，該方法反應(yīng)速度快，對于痕量目的基因可以達(dá)到很好的檢測效果，靈敏度比PCR方法高1～2個數(shù)量級，該技術(shù)為油菜成分的監(jiān)測提供了技術(shù)支持。

(四)操作簡單，適于基層使用。本發(fā)明開發(fā)設(shè)計(jì)出檢測油菜的試劑盒，操作簡單，不需要專業(yè)人員操作，結(jié)果易于觀察，可供基層檢測使用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中環(huán)介導(dǎo)等溫消光擴(kuò)增反應(yīng)電泳結(jié)果；其中，泳道1為非轉(zhuǎn)基因油菜陽性擴(kuò)增，泳道2為轉(zhuǎn)基因油菜陽性擴(kuò)增，泳道3為陰性擴(kuò)增，M為D2000maker。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實(shí)施例1用于檢測油菜的LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成

通過日本榮巖株式會社環(huán)介導(dǎo)引物在線設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorerV5(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)針對油菜內(nèi)參基因HmgI/Y的部分區(qū)域(Seq ID No:5)設(shè)計(jì)引物，引物由上海英濰捷基有限公司合成，將引物稀釋至10μmol/L。引物序列如下：

外側(cè)正向引物HmgI/Y-F3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGCTAAGGCGAAAGGACCTTCC-3’；

外側(cè)反向引物HmgI/Y-B3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGGCACCATCGCAGGCTTC-3’；以及

內(nèi)側(cè)正向引物HmgI/Y-FIP：5’-TTCGGCGGTCGTCCACGTGCTGGGAGGGAGGGAGGGTCGGAGGTGGAGACGAAAGT-3’；

內(nèi)側(cè)反向引物HmgI/Y-BIP：5’-CAGAAGACGGAATCCGAGGCGGCTGGGAGGGAGGGAGGGGCCCTCTCCGCTCCCCAGCC-3’。

與普通LAMP引物相比，本發(fā)明的內(nèi)側(cè)引物由兩條引物以及DNAzyme序列構(gòu)成，要求F1c與F2之間不超過35bp，同理B1與B2c之間不超過35bp，否則，內(nèi)側(cè)引物則無法折疊成啞鈴狀結(jié)構(gòu)。

其中，外側(cè)正向引物HmgI/Y-F3與Seq ID No:5上的第459-478位堿基相匹配，外側(cè)反向引物HmgI/Y-B3與Seq ID No:5上的第640-656位堿基相匹配，內(nèi)側(cè)正向引物HmgI/Y-FIP分別與Seq ID No:5上的第479-498位堿基以及第525-543位堿基相匹配，內(nèi)側(cè)反向引物HmgI/Y-BIP分別與Seq ID No:5上的第548-569位堿基以及第601-620位堿基相匹配。

實(shí)施例2基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)檢測油菜的方法

1、實(shí)驗(yàn)方法

①采集油菜籽，將樣品在液氮中研磨成粉末，稱100mg±10mg樣品，用CTAB法提取基因組，作為DNA模板，將模板稀釋至50ng/μL；

②顯色反應(yīng)：將hemin工作液與實(shí)施例1的LAMP引物組合混合，40℃孵育30min，然后添加ABTS顯色液和H₂O₂，立即用肉眼觀察顏色或利用紫外分光光度計(jì)測定OD_419nm值；

顯色反應(yīng)的反應(yīng)體系為：50μM hemin工作液90μL，10μM引物HmgI/Y-F3和HmgI/Y-B3各0.5μL，10μM引物HmgI/Y-FIP和HmgI/Y-BIP各4μL，36mM ABTS顯色液30μL，30％H₂O₂ 1μL，用dd H₂O補(bǔ)足至總體系130μL；其中，配制ABTS顯色液的溶劑為1×DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配；所述hemin工作液的組成如下：50μM hemin、10mM NaH₂PO₄、100mM KCl、2mM MgCl₂和0.003％Triton X-100；

③環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光反應(yīng)：向步驟②顯色反應(yīng)所得混合液中添加16μL擴(kuò)增試劑，所述擴(kuò)增試劑包括2.5mM dNTP、7.8mM MgSO₄、1.6M甜菜堿、8.0U Bst DNA聚合酶、1×Thermopol緩沖液和2μL DNA模板，配制反應(yīng)體系，然后65℃水浴鍋中孵育40min，85℃放置3分鐘，最后冰上終止反應(yīng)；

④目測判定反應(yīng)前后反應(yīng)混合液顏色變化，或利用紫外分光光度計(jì)測定步驟③所得反應(yīng)混合液在419nm處的OD值；若顏色由反應(yīng)前的藍(lán)色變成淺藍(lán)色或無色，或者反應(yīng)后OD_419nm值變小，表明待測樣品中含有油菜成分。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

顯色反應(yīng)液呈藍(lán)色，OD_419nm值為0.71546，擴(kuò)增后反應(yīng)液接近無色，OD_419nm值為0.10268，陰性對照(模板用ddH₂O代替)反應(yīng)液呈藍(lán)色，OD_419nm值為0.69387，由此判定樣品中含有油菜成分。

經(jīng)過上述環(huán)介導(dǎo)等溫消光擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，非轉(zhuǎn)基因油菜和轉(zhuǎn)基因油菜(例如轉(zhuǎn)基因油菜GT73)表現(xiàn)出典型的LAMP-PCR產(chǎn)物條帶。該結(jié)果表明本發(fā)明引物組合的特異性強(qiáng)，且可直接用于油菜的檢測。

實(shí)施例3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化

為保證顯色體系最佳，本發(fā)明對下述各反應(yīng)因素進(jìn)行優(yōu)化。

1.顯色時間的優(yōu)化

配制試劑：10μM引物HmgI/Y-F3、HmgI/Y-B3、HmgI/Y-FIP和HmgI/Y-BIP，40μM hemin工作液，30mM ABTS顯色液，30％H₂O₂。

實(shí)驗(yàn)方法：向90μL hemin工作液，添加0.5μL引物HmgI/Y-F3和HmgI/Y-B3以及4μL引物HmgI/Y-FIP和HmgI/Y-BIP，35℃孵育20min。然后再添加30μL ABTS顯色液和1μL H₂O₂，利用紫外分光光度計(jì)測定所得反應(yīng)混合液在0s、30s、1min、2min、5min、10min、30min的OD_419nm值。陰性對照不添加引物，用ddH₂O替代。根據(jù)表1結(jié)果可知，隨著時間的延長，陽性和陰性的顯色都會顯著增加，通過陽性和陰性的比值發(fā)現(xiàn)，測量時間越早越好，本發(fā)明采用顯色后立即測定OD值。

表1不同顯色時間下的顯色結(jié)果

2.孵育溫度和時間的優(yōu)化

配制試劑：10μM引物HmgI/Y-F3、HmgI/Y-B3、HmgI/Y-FIP和HmgI/Y-BIP，40μM hemin工作液，30mM ABTS顯色液，30％H₂O₂。

實(shí)驗(yàn)方法：陽性反應(yīng)(+)向90μL hemin工作液，添加0.5μL引物HmgI/Y-F3和HmgI/Y-B3以及4μL引物HmgI/Y-FIP和HmgI/Y-BIP，35-45℃孵育20-30min。然后再添加30μL ABTS顯色液和1μL H₂O₂，利用紫外分光光度計(jì)立即測定所得反應(yīng)混合液的OD_419nm值。陰性對照(-)不添加引物，用ddH₂O替代。根據(jù)表2結(jié)果可知，隨著時間的延長，陽性和陰性的顯色都會逐漸增加，通過陽性和陰性的比值發(fā)現(xiàn)，后期結(jié)果差異不大，本發(fā)明采用的孵育條件為40℃，30min。

表2不同孵育溫度及時間下的顯色結(jié)果(OD_419nm值)

3.濃度的優(yōu)化

配制試劑：10μM引物HmgI/Y-F3、HmgI/Y-B3、HmgI/Y-FIP和HmgI/Y-BIP，40-50μM hemin工作液，30-40mM ABTS顯色液，30％H₂O₂。

實(shí)驗(yàn)方法：向90μL hemin工作液，添加0.5μL引物HmgI/Y-F3和HmgI/Y-B3以及4μL引物HmgI/Y-FIP和HmgI/Y-BIP，40℃孵育30min。然后再添加30μL ABTS顯色液和1μL H₂O₂，利用紫外分光光度計(jì)立即測定所得反應(yīng)混合液的OD_419nm值。陰性對照不添加引物，用ddH₂O替代。根據(jù)表3結(jié)果可知，隨著hemin濃度的增加，陽性(+)的顯色都會逐漸增加，這是由于與核酶結(jié)合的量增加了；隨著ABTS濃度的增加，陽性的顯色逐漸增加，但是陰性(-)的顯色也會逐漸增加，這是由于顯色底物本身的顏色增加了，背景值的增加造成陽性和陰性的比值下降，本發(fā)明采用的孵育條件為hemin濃度50μM，ABTS濃度36mM。

表3不同hemin工作液及ABTS顯色液的顯色結(jié)果(OD_419nm值)

實(shí)施例4基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光技術(shù)檢測油菜與普通PCR方法的比較

1、實(shí)驗(yàn)方法

①將樣品磨成粉末，稱100mg±10mg樣品，用CTAB法提取基因組，作為DNA模板，模板濃度稀釋到50ng/μL，然后按10倍稀釋至0.005pg/μL；

②顯色反應(yīng)：將hemin工作液與實(shí)施例1的LAMP引物組合混合，40℃孵育30min，然后添加ABTS顯色液和H₂O₂，立即用肉眼觀察顏色或利用紫外分光光度計(jì)測定OD_419nm值；

顯色反應(yīng)的反應(yīng)體系為：50μM hemin工作液90μL，10μM引物HmgI/Y-F3和HmgI/Y-B3各0.5μL，10μM引物HmgI/Y-FIP和HmgI/Y-BIP各4μL，36mM ABTS顯色液30μL，30％H₂O₂ 1μL，以dd H₂O配制；

③環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增消光反應(yīng)：向步驟②顯色反應(yīng)所得混合液130μL中添加16μL擴(kuò)增試劑，包括2.5mM dNTP、7.8mM MgSO₄、1.6M甜菜堿、8.0U Bst DNA聚合酶、1×Thermopol緩沖液和2μL DNA模板，配制反應(yīng)體系，然后65℃水浴鍋中孵育40min，85℃放置3分鐘，最后冰上終止反應(yīng)；

④利用紫外分光光度計(jì)測定步驟③所得反應(yīng)混合液在419nm處的OD值；若反應(yīng)后OD_419nm值變小，表明待測樣品中含有水稻HmgI/Y成分。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表4結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)組OD_419nm值隨著基因組濃度的增加而降低，陰性對照OD_419nm值與原OD值基本一致，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們認(rèn)定陽性O(shè)D_419nm/陰性O(shè)D_419nm的值大于2的情況下證明有擴(kuò)增，由此判定本方法的最低檢測限為1pg，約1拷貝。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(Weng H,Yang L,Liu Z,et al.Novel reference gene,high-mobility-group protein I/Y,used in qualitative and real-time quantitative polymerase chain reaction detection of transgenic rapeseed cultivars[J].Journal of AOAC International,2005,88(2):577-584.)，HmgI/Y基因可以作為油菜的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，用于轉(zhuǎn)基因油菜的對照檢測，PCR方法檢測油菜的靈敏度為13pg，約為10拷貝。

表4不同DNA模板濃度下的顯色結(jié)果

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。