本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及檢測(cè)白血病二氫葉酸還原酶融合基因的方法、引物及試劑盒。
背景技術(shù)：
白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，由于克隆的白血病細(xì)胞在骨髓和其它造血組織中大量增殖累積，使正常造血功能受到抑制，同時(shí)浸潤(rùn)其它組織和器官。白血病主要表現(xiàn)有白血病細(xì)胞的增生與浸潤(rùn)。非特異性病變則為出血及組織營(yíng)養(yǎng)不良和壞死、繼發(fā)感染等。白血病細(xì)胞的增生和浸潤(rùn)主要發(fā)生在骨髓及其他造血組織中，也可出現(xiàn)在全身其它組織中，致使正常的紅系細(xì)胞、巨核系細(xì)胞顯著減少。骨髓中可因某些白血病細(xì)胞增生明顯活躍或極度活躍，而呈灰紅色或黃綠色。淋巴組織也可被白血病細(xì)胞浸潤(rùn)，后期則淋巴結(jié)腫大，部分白血病患者有明顯中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病改變，或者為血管內(nèi)白細(xì)胞郁滯、血管周圍白細(xì)胞增生。最易發(fā)生白血病浸潤(rùn)的臟器是腎、肺、心臟及胸腺、睪丸等，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染以及肝、脾、淋巴結(jié)腫大和骨骼疼痛。
既往細(xì)胞形態(tài)學(xué)分型的診斷符合率及正確率受檢測(cè)者主觀成分影響較大，近兩年白血病分子特征的研究取得了明顯進(jìn)展，尤其是對(duì)染色體易位形成融合基因，有一些已作為診斷不同類型白血病的分子生物學(xué)特異性標(biāo)志和確定診斷的唯一依據(jù)，通過對(duì)白血病相關(guān)融合基因進(jìn)行檢測(cè)，不僅可以為白血病診斷、分型、臨床治療和預(yù)后判斷提供重要依據(jù)，同時(shí)也是白血病微小殘留病的檢測(cè)基礎(chǔ)。融合基因的檢測(cè)對(duì)白血病的診斷意義重大，能評(píng)價(jià)白血病的急性程度、克隆特性及分型，使白血病的診斷分型更加科學(xué)化和規(guī)范化；可檢出1×106個(gè)有核細(xì)胞中的一個(gè)白血病細(xì)胞，在白血病的早期診斷方面有著其它方法無可比擬的特異性和敏感性。細(xì)胞遺傳學(xué)分型與疾病的預(yù)后關(guān)系密切，因此融合基因的檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)臨床個(gè)性化治療方案的選擇和判斷預(yù)后具有十分重要的意義，初治時(shí)可指導(dǎo)科學(xué)合理選擇長(zhǎng)期治療方案，避免不必要的治療不足或過度治療。
甲氨蝶呤是臨床上治療各型急性白血病，尤其是急性淋巴細(xì)胞性白血病常用到的抗腫瘤藥物。甲氨蝶呤作為一種葉酸還原酶抑制劑，主要抑制二氫葉酸還原酶而使二氫葉酸不能還原成有生理活性的四氫葉酸，從而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成過程中一碳基團(tuán)的轉(zhuǎn)移作用受阻，導(dǎo)致dna的生物合成受到抑制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與繁殖。該藥選擇性地作用于細(xì)胞分裂的s期。
dhfr是甲氨蝶呤作用的靶目標(biāo)，甲氨蝶呤抗腫瘤作用的基本原理是競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合dhfr，使二氫葉酸不能被還原成四氫葉酸。研究表明，dhfr基因突變所導(dǎo)致dhfr構(gòu)型改變，致使其與甲氨蝶呤結(jié)合的親和力減弱，這可能是dhfr相關(guān)的甲氨蝶呤治療療效和耐藥的重要原因。基因變異的不同導(dǎo)致腫瘤治療反應(yīng)的不同，這提示dhfr基因的檢測(cè)可作為白血病治療監(jiān)測(cè)和隨訪的指標(biāo)。我們新近的研究顯示，白血病患者中dhfr-chr7融合基因的檢出預(yù)示著甲氨蝶呤化療藥物療效不佳或者容易耐藥，宜選用其它藥物治療。
融合基因檢測(cè)常用的方法主要包括白血病細(xì)胞染色體核型分析、染色體熒光原位雜交技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)。在實(shí)際操作中，染色體核型分析常常受到檢測(cè)技術(shù)條件和人為操作因素的影響，熒光原位雜交技術(shù)結(jié)果較為直觀，但是試驗(yàn)過程過于繁瑣，需要的試劑種類繁多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且試驗(yàn)結(jié)果需要經(jīng)驗(yàn)豐富的專家來判讀，結(jié)果判讀也存在較大的主觀性，因而一定程度上限制了這些方法的應(yīng)用。而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)中常見的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法有sybrgreeni染料法，雙探針雜交法以及taqman技術(shù)等。其中sybrgreeni染料法中使用的sybrgreeni由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種重復(fù)性好、高通量、靈敏、準(zhǔn)確和快速的篩選治療白血病的藥物的方法和系統(tǒng)，本發(fā)明還提供了用于該方法和系統(tǒng)的重復(fù)性好、特異性好、靈敏度高、檢測(cè)效率高和適用范圍廣的引物對(duì)和探針組合，以及含有該引物對(duì)和探針組合的試劑盒及其應(yīng)用。
本發(fā)明一方面提供了引物對(duì)和探針組合，包括兩組引物對(duì)和兩條探針，所述兩組引物對(duì)包括第一引物對(duì)和第二引物對(duì)，所述兩條探針包括第一探針和第二探針，所述第一探針與第一引物對(duì)相對(duì)應(yīng)，所述第二探針與第二引物對(duì)相對(duì)應(yīng)，所述第一引物對(duì)包含seqidno：1和seqidno：2所示的核苷酸序列，所述第一探針包含seqidno：3所示的核苷酸序列；所述第二引物對(duì)包含seqidno：4和seqidno：5所示的核苷酸序列，所述第二探針包含seqidno：6所示的核苷酸序列。
本發(fā)明第二方面提供了所述的引物對(duì)和探針組合在篩選治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明第三方面提供了一種試劑盒，包括所述的引物對(duì)和探針組合。
在一優(yōu)選例中，還包括熒光定量pcr擴(kuò)增試劑。
在一優(yōu)選例中，所述熒光定量pcr擴(kuò)增試劑包括來自roche公司的貨號(hào)為#6402682001的faststartessentialprobesmaster試劑盒中的試劑faststartessentialprobesmastermix(2×)。
在一優(yōu)選例中，還包括總rna提取試劑。
在一優(yōu)選例中，所述總rna提取試劑包括紅細(xì)胞裂解液、trizol、氯仿、異丙醇和乙醇中的至少一種。
在一優(yōu)選例中，還包括逆轉(zhuǎn)錄試劑。
在一優(yōu)選例中，所述逆轉(zhuǎn)錄試劑包括來自北京全式金生物技術(shù)有限公司的貨號(hào)為提au311-03的transscript-unione-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermixkit中所包含的試劑。
在一優(yōu)選例中，還包括陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。
在一優(yōu)選例中，所述陽性對(duì)照為含有二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因的溶液；所述陰性對(duì)照為不含二氫葉酸還原酶融合基因但含有g(shù)apdh內(nèi)參基因的溶液；所述空白對(duì)照為生理鹽水或去離子水。
本發(fā)明第四方面提供了所述的試劑盒在篩選治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明第五方面提供了一種篩選治療白血病的藥物的方法，包括：
提取從白血病患者分離出的生物樣品中的核酸樣本；
采用上述的引物對(duì)和探針組合對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)；
以及基于熒光定量pcr反應(yīng)的結(jié)果，判斷所述白血病患者對(duì)應(yīng)的藥物治療是否適用。
在一優(yōu)選例中，所述提取所述生物樣品中的核酸樣本是從生物樣品中提取rna樣本，然后對(duì)所述rna樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以便獲得cdna樣本，所述cdna樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
在一優(yōu)選例中，所述判斷所述白血病患者對(duì)應(yīng)的藥物治療是否適用的標(biāo)準(zhǔn)為：
當(dāng)熒光定量pcr反應(yīng)的結(jié)果顯示二氫葉酸還原酶融合基因呈陽性時(shí)，則表示不適用甲氨蝶呤的藥物治療；當(dāng)熒光定量pcr反應(yīng)的結(jié)果顯示二氫葉酸還原酶融合基因呈陰性時(shí)，則表示適用甲氨蝶呤的藥物治療。
在一優(yōu)選例中，所述熒光定量pcr反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：
faststartessentialprobesmastermix(2×)12.5μl
seqidno：1和seqidno：2終濃度均為0.8μm
seqidno：4和seqidno：5終濃度均為0.8μm
seqidno：3和seqidno：6終濃度均為0.4μm
cdna模板2ng
加超純水補(bǔ)足體系至25μl；
所述faststartessentialprobesmastermix(2×)為roche公司的貨號(hào)為#6402682001的faststartessentialprobesmaster試劑盒中的試劑。
在一優(yōu)選例中，所述熒光定量pcr反應(yīng)程序如下：95℃10min，1個(gè)循環(huán)；95℃10s，60℃30s(收集熒光)，45個(gè)循環(huán)；40℃10s，1個(gè)循環(huán)。
本發(fā)明第六方面提供了一種篩選治療白血病的藥物的系統(tǒng)，包括：
核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于提取從白血病患者分離出的生物樣品中的核酸樣本；
熒光定量pcr裝置，所述熒光定量pcr裝置與所述核酸提取裝置相連，適用于采用上述的引物對(duì)和探針組合對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)；以及
判斷裝置，所述判斷裝置與所述熒光定量pcr裝置相連，以便基于熒光定量pcr反應(yīng)的結(jié)果，判斷所述白血病患者對(duì)應(yīng)的藥物治療是否適用。
在一優(yōu)選例中，所述核酸提取裝置進(jìn)一步包括：
rna提取單元，所述rna提取單元用于從生物樣品中提取rna樣本；以及
逆轉(zhuǎn)錄單元，所述逆轉(zhuǎn)錄單元與所述rna提取單元相連，用于對(duì)所述rna樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以便獲得cdna樣本，所述cdna樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
在一優(yōu)選例中，所述判斷所述白血病患者對(duì)應(yīng)的藥物治療是否適用的標(biāo)準(zhǔn)為：
當(dāng)熒光定量pcr反應(yīng)的結(jié)果顯示二氫葉酸還原酶融合基因呈陽性時(shí)，則表示不適用甲氨蝶呤的藥物治療；當(dāng)熒光定量pcr反應(yīng)的結(jié)果顯示二氫葉酸還原酶融合基因呈陰性時(shí)，則表示適用甲氨蝶呤的藥物治療。
在一優(yōu)選例中，所述熒光定量pcr反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：
faststartessentialprobesmastermix(2×)12.5μl，引物seqidno：1和seqidno：2的終濃度均為0.8μm，引物seqidno：4和seqidno：5的終濃度均為0.8μm，探針seqidno：3和seqidno：6的終濃度均為0.4μm，cdna模板2ng，加超純水補(bǔ)足體系至25μl。
在一優(yōu)選例中，所述熒光定量pcr反應(yīng)程序如下：95℃10min，1個(gè)循環(huán)；95℃10s，60℃30s(收集熒光)，45個(gè)循環(huán)；40℃10s，1個(gè)循環(huán)。
本發(fā)明的“所述第一探針與第一引物對(duì)相對(duì)應(yīng)，所述第二探針與第二引物對(duì)相對(duì)應(yīng)”中的“相對(duì)應(yīng)”指的是第一探針與第一引物對(duì)可以單獨(dú)配套使用，同理，第二探針與第二引物對(duì)也可以單獨(dú)配套使用。
本發(fā)明的生物樣品為包含有dna和/或rna的血液、細(xì)胞或組織，或?yàn)橘|(zhì)粒，或?yàn)閐na、cdna、mrna或cdna片段，或?yàn)楹衐na、cdna、mrna或cdna片段的試劑。當(dāng)生物樣品為dna、cdna或cdna片段，或?yàn)楹衐na、cdna或cdna片段的試劑，或?yàn)橘|(zhì)粒時(shí)，將其直接作為核酸樣本與所述引物和探針對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)；當(dāng)生物樣品為含有dna和/或rna的血液、細(xì)胞或組織，或?yàn)閙rna，或?yàn)楹衜rna的試劑時(shí)，將其轉(zhuǎn)化為dna、cdna或cdna片段的核酸樣本再與所述引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)。
本發(fā)明中的“dhfr-chr7”代表二氫葉酸還原酶-7號(hào)染色體融合基因，也簡(jiǎn)稱二氫葉酸還原酶融合基因。
本發(fā)明的有益效果包括：
(1)本發(fā)明針對(duì)白血病二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因設(shè)計(jì)的多條多重引物、探針進(jìn)行了大量篩選，綜合其特異性、靈敏度、配對(duì)復(fù)合擴(kuò)增的相互影響、以及不同引物探針組合與熒光pcr擴(kuò)增試劑盒的適配性，最終篩選出特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好、適用性廣且可同時(shí)檢測(cè)白血病二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因的引物對(duì)和探針組合。
(2)本發(fā)明針對(duì)在前述引物對(duì)和探針組合的基礎(chǔ)上建立了白血病二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因的雙重?zé)晒鈖cr檢測(cè)方法，可同時(shí)對(duì)二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，且重復(fù)性好、高通量、靈敏、準(zhǔn)確和快速，為白血病的用藥篩選及預(yù)后判定提供了更有效的方法。
具體實(shí)施方式
除非特殊說明，本發(fā)明所用術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。
下面參考具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw，molecularcloning：alaboratorymanual，2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供了引物對(duì)和探針組合及其應(yīng)用。
引物對(duì)和探針組合的篩選方法為：針對(duì)白血病二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)不同的引物和探針組合并進(jìn)行了優(yōu)化篩選，綜合其穩(wěn)定性、特異性、靈敏度、配對(duì)復(fù)合擴(kuò)增的相互影響、以及不同引物探針組合與熒光pcr擴(kuò)增試劑盒的適配性，最終篩選出特異性好、重復(fù)性好且靈敏度高的如下可同時(shí)檢測(cè)白血病二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因的雙重?zé)晒鈖cr的引物對(duì)和探針組合。
所述二氫葉酸還原酶融合基因片段如下：
ttatgctacctttgcacggttagggtaccgcggccgttacatatgtcactgggcaggcggtgcctctaatactggtaatgctagaggtgatgtttttggtaaacaggcggggtaagatttgccgagttccttttactttttttaacctttccttataagcatgcctgtgttgggttaacagtatgggtagcaccggtttgtctaaaaccagccactctct(seqidno：7)。
所述gapdh內(nèi)參基因片段如下：
tggtatcgtggaaggactcatgaccacagtccatgccatcactgccacccagaagactgtggatggcccctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatcatc(seqidno：8)
所述的引物對(duì)和探針組合的核苷酸序列如下：
dhfr-chr7-f：：5’-acctttgcacggttagggta-3’(seqidno：1)；
dhfr-chr7-r：5’-tttagacaaaccggtgctacc-3’(seqidno：2)；
dhfr-chr7的探針序列為：5’-fam-ccgcggccgttacatatgtcactggg-tamra-3’(seqidno：3)
gapdh-f：5’-tggtatcgtggaaggactca-3’(seqidno：4)；
gapdh-r：5’-gatgatgttctggagagccc-3’(seqidno：5)；
gapdh的探針序列為：5’-hex-ccatgccatcactgccaccc-tamra-3’(seqidno：6)
其中hex、fam為熒光基團(tuán)，tamra為淬滅基團(tuán)。
利用上述引物對(duì)和探針可同時(shí)針對(duì)白血病二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因進(jìn)行雙重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增。
在應(yīng)用上，上述引物對(duì)和探針組合可應(yīng)用于篩選治療白血病的藥物上；還可以用來制備篩選治療白血病的藥物的產(chǎn)品。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供了一種試劑盒及其應(yīng)用，所述試劑盒包括：
(1)seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5和seqidno：6(來自實(shí)施例1)；
(2)總rna提取試劑；
(3)逆轉(zhuǎn)錄試劑；
(4)熒光定量pcr擴(kuò)增試劑；
(5)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。
所述總rna提取試劑包括紅細(xì)胞裂解液、trizol、氯仿、異丙醇和乙醇。
所述逆轉(zhuǎn)錄試劑包括來自北京全式金生物技術(shù)有限公司的貨號(hào)為提au311-03的transscript-unione-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermixkit中所包含的試劑。
所述熒光定量pcr擴(kuò)增試劑包括來自roche公司的貨號(hào)為#6402682001的faststartessentialprobesmaster試劑盒中的試劑faststartessentialprobesmastermix(2×)。
所述陽性對(duì)照為含有二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因的溶液；所述陰性對(duì)照為不含二氫葉酸還原酶融合基因但含有g(shù)apdh內(nèi)參基因的溶液；所述空白對(duì)照為生理鹽水或去離子水。
實(shí)驗(yàn)證明，上述總rna提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、熒光定量pcr擴(kuò)增試劑以及與seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5和seqidno：6的聯(lián)合使用，效果更加優(yōu)越，具體表現(xiàn)在特異性強(qiáng)、重復(fù)性好和靈敏度高。
在應(yīng)用上，上述試劑盒可應(yīng)用于篩選治療白血病的藥物上；還可以用來制備篩選治療白血病的藥物的產(chǎn)品。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供了一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)白血病二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因的方法，例如根據(jù)雙重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增的結(jié)果判斷生物樣品是否含有白血病二氫葉酸還原酶融合基因，該方法使用了實(shí)施例1的引物對(duì)和探針組合或?qū)嵤├?的試劑盒。
上述方法包括如下步驟：
步驟一：總rna的提取
在15ml離心管中加入5ml紅細(xì)胞裂解液，取edta-na2抗凝血(待測(cè)樣本)2ml加入離心管中，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，600×g離心5min，去掉上清，再加入2ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕重懸沉淀，室溫靜置5min，600×g離心5min，去掉上清，向管中加入1mltrizol，吹打混勻，使沉淀完全溶解，室溫放置5min后，加入0.2ml氯仿，振蕩混勻，將溶液全部轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，4℃13000×g離心10min，吸取上清并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等體積異丙醇后，充分振蕩，室溫靜置10min，4℃13000×g離心10min，去上清，輕輕加入1ml75％的乙醇，4℃13000×g離心10min，小心去上清，室溫干燥10-15min，加入20μlrnase-free水，冰上放置10min溶解沉淀，得到總rna。
步驟二：cdna的合成
使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的貨號(hào)為au311-03的transscript-unione-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermixkit的試劑盒并按照其說明書將總rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna，并除去基因組dna。
步驟三：雙重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增
以cdna為模板，采用引物對(duì)和探針進(jìn)行雙重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。所述陽性對(duì)照為含有二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因的溶液；所述陰性對(duì)照為不含二氫葉酸還原酶融合基因但含有g(shù)apdh內(nèi)參基因的溶液；所述空白對(duì)照為生理鹽水或去離子水。
雙重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增反應(yīng)體系：faststartessentialprobesmastermix(2×)12.5μl，引物seqidno：1和seqidno：2的終濃度均為0.8μm，引物seqidno：4和seqidno：5的終濃度均為0.8μm，探針seqidno：3和seqidno：6的終濃度均為0.4μm，cdna模板2μl(濃度為1ng/μl)，加超純水補(bǔ)足體系至25μl。陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照的模板的用量均為2μl。
雙重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃10min，1個(gè)循環(huán)；95℃10s，60℃30s(收集熒光)，45個(gè)循環(huán)；40℃10s，1個(gè)循環(huán)。
雙重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增反應(yīng)在roche公司的
步驟四：雙重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測(cè)
在每個(gè)循環(huán)的58℃30s階段結(jié)束后收集fam和hex的熒光信號(hào)。
所述雙重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增的結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)如下：
將閾值線調(diào)整至背景信號(hào)及陰性擴(kuò)增線以上，只有當(dāng)待測(cè)樣本的內(nèi)參基因gapdh結(jié)果陽性時(shí)，檢測(cè)結(jié)果才認(rèn)為有效。
陽性結(jié)果判定：fam通道和hex通道都有擴(kuò)增曲線，且ct值均小于或等于38.0。
陰性結(jié)果判定：hex通道有擴(kuò)增曲線且ct值≤38.0，fam通道ct值＞38.0。
如果hex通道無擴(kuò)增曲線，或ct值＞38.0，需重新進(jìn)行檢測(cè)。
所述陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照的雙重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增的結(jié)果應(yīng)與表1所示一致，以進(jìn)一步證明待測(cè)樣品的檢測(cè)結(jié)果的可信度。
表1
實(shí)施例4
本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例3建立的檢測(cè)或輔助檢測(cè)白血病二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因的方法進(jìn)行了特異性和重復(fù)性驗(yàn)證，所用的供試材料如下：白血病患者抗凝血83例樣本。
對(duì)白血病患者抗凝血83例樣本分別進(jìn)行總rna的提取、cdna的合成、雙重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增以及雙重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測(cè)，各步驟均按照實(shí)施例3的方法進(jìn)行，每個(gè)樣本做3次重復(fù)，每次實(shí)驗(yàn)均包括一份陽性對(duì)照，一份陰性對(duì)照和一份空白對(duì)照。
結(jié)果分析：
實(shí)施例3建立的檢測(cè)或輔助檢測(cè)白血病二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因的方法檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：批內(nèi)和批間重復(fù)性好，檢測(cè)結(jié)果ct值的變異系數(shù)＜10％。而且在83例樣本中，本發(fā)明實(shí)施例3的方法測(cè)得白血病二氫葉酸還原酶融合基因呈陽性的患者有9例，將這9例患者的cdna用dhfr-chr7融合基因的上下游引物(seqidno：1和seqidno：2)做普通pcr，然后送測(cè)序公司做sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與本發(fā)明實(shí)施例3的方法測(cè)得的結(jié)果的一致性為100％，且臨床病例資料分析表明，在83例患者中正好只有這9例患者用甲氨蝶呤治療后療效不佳，預(yù)后不良，結(jié)果與本發(fā)明實(shí)施例3的方法測(cè)得的結(jié)果一致，因此本發(fā)明實(shí)施例3的方法可用于白血病的用藥篩選及預(yù)后判定，為臨床診斷和治療提供分子診斷依據(jù)。
綜上，本發(fā)明建立的檢測(cè)或輔助檢測(cè)白血病二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因的方法能有效檢測(cè)二氫葉酸還原酶融合基因和gapdh內(nèi)參基因，特異性和重復(fù)性好，可用于白血病的用藥篩選及預(yù)后判定，為臨床診斷和治療提供分子診斷依據(jù)。
實(shí)施例5
本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例3建立的檢測(cè)或輔助檢測(cè)白血病二氫葉酸還原酶融合基因的方法進(jìn)行了靈敏度驗(yàn)證。分別提取經(jīng)實(shí)施例4檢測(cè)的白血病二氫葉酸還原酶融合基因呈陽性的患者的外周血淋巴細(xì)胞和陰性細(xì)胞hela(二氫葉酸還原酶融合基因陰性)(來源于atcc細(xì)胞庫)的rna，將融合基因陽性細(xì)胞的rna從1μg開始用陰性細(xì)胞hela細(xì)胞的rna進(jìn)行10倍梯度稀釋，最低稀釋至10-6。逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行雙重?zé)晒舛縫cr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例3，3次重復(fù)，每次實(shí)驗(yàn)均包括一份陽性對(duì)照，一份陰性對(duì)照和一份空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二氫葉酸還原酶融合基因的檢測(cè)靈敏度為10-3，即103個(gè)細(xì)胞中存在1個(gè)帶有dhfr-chr7陽性的細(xì)胞就能通過本發(fā)明的引物、試劑盒以及方法檢測(cè)到其融合基因。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。