本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)生組成型甘露聚糖酶的嗜堿芽孢桿菌NTT33C6，同時(shí)涉及嗜堿芽孢桿菌NTT33C6的分離篩選方法，還涉及該菌株在大麻生物脫膠及大麻生產(chǎn)中的用途。

背景技術(shù)：

大麻(Cannabis sativa L.)屬于桑科(Maraceae)、大麻屬植物，又稱漢麻、山絲苗、線麻、胡麻、野麻、火麻等，英文名hemp或true hemp或common hemp，為一年生直立草本植物，高1～4米。大麻具有耐貧瘠、抗逆性強(qiáng)、適生性廣，喜光照(尤其是短日照)、光合作用效率較高的生物學(xué)特性。

中國種植大麻和使用麻制品的歷史源遠(yuǎn)流長，在我國河南曾經(jīng)出土了商代的大麻殘片，甘肅東鄉(xiāng)林西出土的大麻籽實(shí)物距今也有5000多年。大麻可以說渾身是寶，有廣泛用途。如大麻纖維是紡織、造紙的重要原料，世界上第一張紙就是我國在公元100年用大麻纖維制作的。而且大麻籽可直接食用，加工食用油脂和各種類食品。其籽、枝、葉均可入藥，是中國傳統(tǒng)中草藥配方常用藥材，《本草綱目》中，關(guān)于大麻的醫(yī)藥和保健用途的記載多達(dá)數(shù)百條。

大麻亦是天然纖維中韌度最高、可自然分解的環(huán)保纖維，其表面有縱向縫隙和空洞，橫向有枝節(jié)，中心有細(xì)長的空腔，因此其纖維具有優(yōu)異的毛細(xì)效應(yīng)，同時(shí)由于大麻纖維結(jié)構(gòu)中空，可富含氧氣，大麻纖維還含有10多種對(duì)人體健康有益的微量元素。因此大麻纖維的形態(tài)與化學(xué)組分使大麻纖維、大麻紡織品具有良好的吸濕透氣、服用涼爽、抑菌消臭吸附異味、防紫外線輻射、消散聲波、抗靜電、潤膚爽身等天然保健功能(張祥文.關(guān)于大麻纖維性能及其可紡性的探究[J].廣西紡織科技，2010，39(2):20-22.)。并且大麻是各種麻纖維中最細(xì)軟的一種，細(xì)度僅為苧麻的三分之一，與棉纖維相當(dāng)，卻沒有苧麻的穿著刺癢感(全瓊瑛.大麻脫膠機(jī)理與脫膠方法的優(yōu)化[J].中國纖檢,2013(1):87-88.)。大麻纖維也可與棉毛及化纖混紡，所得織物具有挺括、質(zhì)地細(xì)膩、穿著涼爽、堅(jiān)牢耐用等其它紡織品不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。

我國大麻產(chǎn)量約占世界大麻產(chǎn)量的1/3，居世界首位。我國的纖維用大麻，最負(fù)盛名的均在北方，如河北蔚縣大麻，山西潞安大麻和山東萊蕪大麻等。但是，大麻紡織品目前仍處于中、低檔水平，其中一個(gè)重要原因是大麻纖維中膠質(zhì)含量高、纖維粗硬，難以達(dá)到高支紗的可紡性要求。

大麻原麻中，含有約55％左右的纖維素成分，還含有約45％左右的非纖維素(膠質(zhì))成分，比其他種類原麻的非纖維素含量都高，包括木質(zhì)素、半纖維素、蠟脂質(zhì)、果膠及部分水溶物和灰分等，其中含量最高的半纖維素類雜多糖(主要為含有甘露聚糖的雜多糖)。若使原麻具有可紡性，必須把這些非纖維素成分去除，得到脫去膠質(zhì)的精干麻，即脫膠工藝。更為關(guān)鍵的是大麻單纖維過短，一般為7～50mm，且纖維整齊度差，若將胞間層物質(zhì)全部脫去(即全脫膠)，勢(shì)必造成短絨，失去可紡性。因此必須生產(chǎn)出保留一定含量殘膠將單纖維粘連而成纖維束的工藝?yán)w維進(jìn)行紡紗，這就是所謂的“適度脫膠”工藝，獲得的纖維也稱為“工藝?yán)w維”。由于上述特點(diǎn)，使大麻脫膠難度增大(張金燕.大麻纖維的性能研究與產(chǎn)品開發(fā)[J].上海毛麻科技，2008(1):30-34.)。

可以說，脫膠是獲得大麻纖維的關(guān)鍵工藝，大麻纖維的優(yōu)良性能能否得到充分發(fā)揮，與其脫膠的好壞有直接關(guān)系。

根據(jù)脫膠機(jī)理，目前大麻纖維脫膠方法分為三大類，即化學(xué)脫膠法、物理脫膠法和生物脫膠法。

目前我國的大麻紡織企業(yè)主要采用化學(xué)脫膠工藝，工藝中以堿劑為主，輔以氧化劑、助劑和一定的機(jī)械作用達(dá)到脫膠目的。其原理是利用大麻纖維中的膠質(zhì)和纖維素對(duì)無機(jī)酸、堿、氧化劑作用的穩(wěn)定性不同，去除原麻中的膠質(zhì)，保留纖維素成分?；瘜W(xué)脫膠法主要存在的問題：一是工藝流程長，消耗的原料和能耗多，造成生產(chǎn)成本高；二是采用高濃度的酸、堿、氧化劑等處理，對(duì)纖維損傷較大，纖維質(zhì)量差，故而很難達(dá)到紡高支紗的要求；三是產(chǎn)生的脫膠污水其COD_Cr(化學(xué)需氧量)可高達(dá)15000-25000mg/mL，并且BOD₅/COD_Cr﹤0.3，屬于非常難于處理的污水，為了達(dá)標(biāo)排放，需要大量稀釋后處理，故而處理成本高，還很難達(dá)標(biāo)，因此會(huì)嚴(yán)重污染環(huán)境(吳君南，郝新敏，唐宗留，等.大麻纖維高溫—閃爆聯(lián)合脫膠技術(shù)[J]，紡織學(xué)報(bào)，2007，28(11):76－80.)。

物理脫膠法包括超聲波脫膠技術(shù)、蒸汽爆破(即“閃爆”)脫膠技術(shù)、旋輥式機(jī)械脫膠等，此類方法的最大優(yōu)點(diǎn)是無污染。物理脫膠機(jī)理，是在外力(超聲波、汽爆、機(jī)械作用等)作用下，使大麻纖維外包膠質(zhì)層產(chǎn)生大量的裂縫、原麻聚合體中纖維素分子鏈(同時(shí)還有半纖維素分子鏈、木質(zhì)素分子鏈以及果膠質(zhì)分于鏈)多次產(chǎn)生剪切等現(xiàn)象，使原麻中的脆性膠質(zhì)發(fā)生破碎、剝落，纖維與膠質(zhì)脫離，達(dá)到脫膠的目的。但是物理脫膠法只能作為一種預(yù)處理的方法，效果并不明顯，并且能耗很高，還需要與其他方法合理配合使用([1]金鋼.大麻脫膠方法的研究進(jìn)展[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，33(4)：140-144.[2]尹云雷，周永凱，張華.大麻纖維的蒸汽閃爆—化學(xué)聯(lián)合脫膠工藝技術(shù)[J].北京服裝學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，29(4)：20-26.)。

傳統(tǒng)天然水漚麻脫膠法、微生物脫膠、酶法脫膠都屬于生物脫膠法。生物脫膠法脫膠機(jī)理的實(shí)質(zhì)是，利用微生物產(chǎn)生的酶將韌皮中的各種膠質(zhì)分解為小分子化合物，使纖維膠質(zhì)分離。生物脫膠法具有快速高效，無污染，生產(chǎn)的精干麻質(zhì)量好的明顯優(yōu)勢(shì)。

但從目前來看，許多生物脫膠法還無法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，主要是酶活力太低，酶脫膠后的原麻還含有較多的膠質(zhì)，其作用也僅僅相當(dāng)于化學(xué)脫膠的預(yù)處理工藝的效果(俞春華，馮新星，賈長蘭等.大麻纖維高溫—酶聯(lián)合脫膠技術(shù)[J].紡織學(xué)報(bào)，2007，28(6)：79-82.蔡俠，熊和平，嚴(yán)理等.大麻微生物—蒸汽爆破聯(lián)合脫膠技術(shù)[J].紡織學(xué)報(bào)，2011,32(7)：75-79.)。因此直到目前，尚無大麻生物脫膠法成功利用于生產(chǎn)的例子。

因此直到目前為止，僅有本發(fā)明人的技術(shù)應(yīng)用于苧麻生物脫膠生產(chǎn)中(申請(qǐng)?zhí)枺篊N97.109044)，該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用其效果明顯：①比苧麻化學(xué)脫膠降低67.24％的化工原料消耗；②比苧麻化學(xué)脫膠節(jié)煤37.5％；③比苧麻化學(xué)脫膠技術(shù)節(jié)水40％以上；④需處理的廢水量比化學(xué)脫膠減少90％。未經(jīng)處理的廢水COD濃度小于4000～4500mg/l，比化學(xué)脫膠廢水降低10000～15000mg/l。廢水處理后COD濃度達(dá)到國家1級(jí)許可排放標(biāo)準(zhǔn)，并可循環(huán)利用(曹軍衛(wèi)，高效脫膠菌的成功選育和脫膠流程的優(yōu)化，《2014年紡織行業(yè)新技術(shù)(成果)推廣項(xiàng)目》江西新余，2014)。

本發(fā)明將一株產(chǎn)生組成型堿性甘露聚糖酶的嗜堿芽孢桿菌突變株應(yīng)用于除去麻皮的或未去麻皮的大麻原麻的脫膠工藝中，取得了良好的效果。

本發(fā)明是利用誘變育種的方法，篩選出一株產(chǎn)生組成型β-堿性甘露聚糖酶的嗜堿芽孢桿菌突變株，β-堿性甘露聚糖酶屬于誘導(dǎo)酶，該酶的產(chǎn)生取決于誘導(dǎo)物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的存在，此突變株其特征是解除了堿性β-甘露聚糖酶對(duì)誘導(dǎo)物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的依賴，也就是說，即使不存在誘導(dǎo)物或底物的結(jié)構(gòu)類似物，該突變株仍然可以產(chǎn)生堿性β-甘露聚糖酶，利用此突變菌株進(jìn)行生物脫膠，可以大大縮短生物脫膠周期，提高膠質(zhì)去除率；本發(fā)明利用此突變菌株先進(jìn)行除去麻皮的或未去麻皮的大麻原麻的生物脫膠，然后輔以低濃度的堿進(jìn)行化學(xué)補(bǔ)充脫膠，再經(jīng)過常規(guī)的水洗、打麻、漂白、水洗、酸洗、水洗、甩干、給油，甩干、干燥工藝處理，得到可滿足于高支紗紡織要求的精干麻；本發(fā)明用生物脫膠工藝代替了化學(xué)脫膠中的浸酸和使用高濃度化學(xué)藥劑煮煉工藝，僅以低濃度的堿進(jìn)行化學(xué)補(bǔ)充脫膠，減掉了大量的酸堿原料，因而與化學(xué)法相比，具有處理?xiàng)l件溫和，生產(chǎn)加工成本低，纖維質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)；特別是脫膠廢水的排出量僅為化學(xué)脫膠法的10％，并且BOD₅/COD_Cr接近1，屬于極容易利用生物法處理的污水，因此大大降低了污水處理成本；并且經(jīng)處理后，很容易達(dá)到國家的1級(jí)排放標(biāo)準(zhǔn)，完全可以做到“零排放”。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種用于大麻脫膠的嗜堿芽孢桿菌NTT33C6，該菌株為產(chǎn)生組成型堿性β-甘露聚糖酶的嗜堿芽孢桿菌突變株，并具有在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和發(fā)酵條件下，以高產(chǎn)率產(chǎn)生堿性β-甘露聚糖酶的能力。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6的分離篩選方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，將對(duì)降解膠質(zhì)成分中含量最高的甘露聚糖的β-甘露聚糖酶由誘導(dǎo)型，轉(zhuǎn)變成組成型，有利于提高其酶活力，在大麻生物脫膠應(yīng)用中，顯著縮短了生物脫膠周期，提高了膠質(zhì)組分去除率，提高了設(shè)備的利用率。

本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供了一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6在大麻生物脫膠中的應(yīng)用，利用此菌株對(duì)除去麻皮的或未除去麻皮的大麻原麻進(jìn)行生物脫膠，可顯著去除原麻的膠質(zhì)，降低其含量，而提高大麻的纖維素含量，與化學(xué)脫膠法相比，處理?xiàng)l件溫和，纖維質(zhì)量好，脫膠廢液屬于極易處理的污水。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6在大麻生產(chǎn)中的應(yīng)用，通過該菌株先對(duì)大麻進(jìn)行生物脫膠，并結(jié)合本發(fā)明提供的化學(xué)補(bǔ)充脫膠方法，再按照常規(guī)處理方法，可得到符合國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的精干麻。

為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6的分離篩選方法，其步驟是：

1、樣品采集：將土壤樣品1g懸于無菌水中，混合均勻，上清液接入葡萄糖固體分離培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24-48小時(shí)；葡萄糖培養(yǎng)基成分為：葡萄糖10g；蛋白胨5g；酵母膏5g；K₂HPO₄ 1g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；瓊脂18g；水1000mL；用Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH10-11。

2、分離純化：挑選分離培養(yǎng)基中單菌落轉(zhuǎn)入槐豆膠固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，選擇菌落周圍產(chǎn)生透明圈的菌株；將這些菌株在液體槐豆膠培養(yǎng)基中，28℃，振蕩培養(yǎng)24-48小時(shí)后，測(cè)定甘露聚糖酶活性；槐豆膠培養(yǎng)基成分為槐豆膠10g；酵母膏5g；蛋白胨5g；K₂HPO₄1g；MgSO₄·7H₂O 0.1g；水1000mL；用Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH10-11；如是固體培養(yǎng)基，另加入瓊脂18g。

3、菌株鑒定：該菌種的菌體呈桿狀，外形大小為0.5～0.65×2.6～3.4μm，美藍(lán)染色均勻，有運(yùn)動(dòng)力，鞭毛側(cè)生，內(nèi)生孢子呈橢圓形，孢子囊稍大，好氧；過氧化氫酶陽性，菌落呈圓形，表面光滑，有同心圓，生長于葡萄糖培養(yǎng)基中檢查不出酸的產(chǎn)生，該菌株分解淀粉，但不還原硝酸鹽。特別是該菌株在pH10-11的培養(yǎng)基中生長良好?；谶@些菌學(xué)特征和理化性質(zhì)，參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,9th Edition,the Williams&Wilkins Company,Baltimore,1992)，本發(fā)明人將該菌株確定為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)NTT33。

4、誘變：將嗜堿芽孢桿菌NTT33菌株接種至上述葡萄糖液體培養(yǎng)基中活化，于37℃振蕩，180rpm，培養(yǎng)24-48小時(shí)；將活化好的出發(fā)菌株NTT33涂布于平皿上，取約1mg的亞硝基胍(Nitrosoguanidine)點(diǎn)在平皿一側(cè)，于37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，待平皿上生長出菌苔。

5、初篩：在亞硝基胍顆粒產(chǎn)生的抑菌圈周圍挑取菌苔，接種于上述葡萄糖液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)后，再于槐豆膠平皿上涂布，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，獲得單菌落。

6、復(fù)篩：對(duì)獲得的單菌落突變株進(jìn)行復(fù)篩，其方法是挑取初篩槐豆膠平皿上周圍產(chǎn)生透明圈的單菌落，分別接種在槐豆膠液體培養(yǎng)基和葡萄糖液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，不同時(shí)間取樣，離心(8000rpm×10分鐘)，提取上清液為粗酶液，按Akino(Agr.Biol.Chem.,52:773-779，1988)的方法測(cè)定甘露聚糖酶活性，兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲取的粗酶液均測(cè)到甘露聚糖酶活性者，為產(chǎn)生組成型甘露聚糖酶的突變株；在測(cè)定多個(gè)單菌落的產(chǎn)酶進(jìn)程曲線后，篩選出一株能夠在槐豆膠液體培養(yǎng)基和葡萄糖液體培養(yǎng)基中同時(shí)產(chǎn)生甘露聚糖酶的嗜堿芽孢桿菌，本發(fā)明將該突變株記為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)NTT33C6。

分離篩選得到一種嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)NTT33C6，于2016年6月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO.M2016316。

該嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)NTT33C6具有產(chǎn)生組成型堿性甘露聚糖酶的特性；菌體呈桿狀，外形大小為0.5-0.65×2.6-3.4μm，美藍(lán)染色均勻，有運(yùn)動(dòng)力，鞭毛側(cè)生，內(nèi)生孢子呈橢圓形，孢子囊稍大；菌株為好氧型，過氧化氫酶呈陽性；菌落呈圓形，表面光滑，有同心圓；在含有葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，檢查不出酸的產(chǎn)生；該菌株分解淀粉，但不還原硝酸鹽；在pH10的培養(yǎng)基中生長良好；產(chǎn)生的組成型β-甘露聚糖酶分子量為38900Da，等電點(diǎn)PI為3.0，酶反應(yīng)最適pH為10.0～11.0，最適反應(yīng)溫度為80℃，穩(wěn)定溫度為60℃。

一株嗜堿芽孢桿菌NTT33C6在大麻纖維生物脫膠中的應(yīng)用，其步驟是：

1、獲得的突變株NTT33C6于槐豆膠液體培養(yǎng)基中，37℃活化培養(yǎng)36-48小時(shí)；

2、分別轉(zhuǎn)入含有大麻的培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)6-8小時(shí)；所述培養(yǎng)基大麻成分為除去麻皮或未除去麻皮的大麻原麻10g，(NH₄)₂SO₄ 1.5g，K₂HPO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，水150mL，并用Na₂CO₃調(diào)pH至10-11。

一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6在大麻生產(chǎn)中的應(yīng)用，其步驟是：

1、按照上述嗜堿芽孢桿菌NTT33C6的生物脫膠方法對(duì)大麻進(jìn)行生物脫膠；

2、生物脫膠后的大麻分散如棉花狀，大麻水洗后，在含0.2-0.4％質(zhì)量濃度的NaOH及0.1％質(zhì)量濃度的三聚磷酸鈉的溶液中，0.2Mpa，煮煉1-2小時(shí)。

3、按化學(xué)脫膠的一般處理方法(金鋼.大麻脫膠方法的研究進(jìn)展[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，33(4)：140-144.；彭源德亞麻、大麻脫膠技術(shù)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)，2007：29，89-91.)進(jìn)行水洗、打麻、漂白(有效氯0.5-0.8g/L)、水洗、酸洗(pH2.5)、水洗、甩干、給油后，甩干、干燥，得到符合國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)精干麻。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

1、該菌株的優(yōu)良特性及產(chǎn)酶優(yōu)點(diǎn)；

該突變株將對(duì)降解膠質(zhì)成分中含量最高的甘露聚糖的β-甘露聚糖酶由誘導(dǎo)型，轉(zhuǎn)變成組成型，提高了酶活力，在大麻生物脫膠應(yīng)用中，顯著縮短了生物脫膠周期，提高了膠質(zhì)組分去除率，提高了設(shè)備的利用率。

2、與現(xiàn)有的生物脫膠技術(shù)相比，該菌株在大麻生物脫膠中的優(yōu)點(diǎn)：

1)國內(nèi)外首創(chuàng)采用嗜堿芽孢桿菌組成型突變株進(jìn)行大麻生物脫膠研究，生產(chǎn)穩(wěn)定性極高，采用嗜堿細(xì)菌進(jìn)行脫膠可以保護(hù)好大麻纖維在整個(gè)脫膠過程中不受破壞，并且由于脫膠堿性環(huán)境的存在，降低了其它雜菌污染的可能，使菌種的長期穩(wěn)定培養(yǎng)成為可能。

2)其他生物脫膠技術(shù)對(duì)原麻刮質(zhì)有必須極優(yōu)的要求，麻皮、麻殼等雜質(zhì)對(duì)生物脫膠有極為不利的影響；而本發(fā)明得到的突變株用于生物脫膠，適用于市場(chǎng)上所有品種和品質(zhì)等級(jí)的大麻原麻，甚至可用于不必去掉麻皮等雜質(zhì)的原麻的生物脫膠工藝。

3)生物脫膠生產(chǎn)中，微生物生長所需碳源完全來自原麻膠質(zhì)，不需添加任何營養(yǎng)有機(jī)物，僅輔以少量無機(jī)鹽，克服了其他生物法脫膠培養(yǎng)細(xì)菌還需使用的大量有機(jī)原料(如黃豆粉、玉米淀粉、白糖等)，同時(shí)也避免了這些有機(jī)物沒完全降解被排放所帶來的“二次污染”。

4)脫膠菌種可反復(fù)使用10次以上，大大減低了菌種生產(chǎn)成本。

3、與現(xiàn)有的化學(xué)脫膠技術(shù)相比，該菌株在脫膠中的優(yōu)點(diǎn)：

1)比化學(xué)脫膠降低60％以上的化工原料消耗；

2)比化學(xué)脫膠技術(shù)節(jié)水40％以上；

3)需處理的廢水量比化學(xué)脫膠減少90％，廢水處理后COD_Cr濃度達(dá)到國家1級(jí)許可排放標(biāo)準(zhǔn)。

4、利用本發(fā)明提供的生物脫膠與化學(xué)脫膠聯(lián)合使用制得的精干麻，可根據(jù)生產(chǎn)需要控制工藝?yán)w維的殘膠率，脫膠均勻，纖維松散、柔軟，富有光澤，硬條、硬塊、夾生少。

附圖說明

圖1為一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6的顯微圖。

圖2為一種嗜堿芽孢桿菌NTT33C6在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)甘露聚糖酶的進(jìn)程曲線圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

嗜堿芽孢桿菌NTT33C6的分離篩選方法，其步驟是：

1)樣品采集

從中國內(nèi)蒙古自治區(qū)哲里木盟地區(qū)進(jìn)行土壤取樣，將土壤樣品1g懸于無菌水中，混合均勻；上清液接入分離培養(yǎng)基中，其成分為：葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，瓊脂18g，水1000mL，用Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH10-11；28℃培養(yǎng)24-48小時(shí)。

2)分離及純化

挑選分離培養(yǎng)基中單菌落轉(zhuǎn)入槐豆膠固體培養(yǎng)基中，其成分為槐豆膠10g，酵母膏5g，蛋白胨5g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，瓊脂18g，水1000mL，用Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH10-11；選擇菌落周圍產(chǎn)生透明圈的菌株，將這些菌株在液體槐豆膠培養(yǎng)基(培養(yǎng)基除不含瓊脂外，其他成分與槐豆膠固體培養(yǎng)基相同)中，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)36-48小時(shí)后，按Akino(Agr.Biol.Chem.,52:773-779，1988)的方法測(cè)定甘露聚糖酶活性。

3)菌株鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，該菌體呈桿狀，外形大小為0.5～0.65×2.6～3.4μm(圖1)，美藍(lán)染色均勻，有運(yùn)動(dòng)力，鞭毛側(cè)生，內(nèi)生孢子呈橢圓形，孢子囊稍大。

經(jīng)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該菌株好氧，過氧化氫酶為陽性；菌落呈圓形，表面光滑，有同心圓；生長于葡萄糖培養(yǎng)基中檢查不出酸的產(chǎn)生；該菌株分解淀粉，但不還原硝酸鹽；在pH10-11的培養(yǎng)基中生長良好。

該菌株產(chǎn)生的組成型β-甘露聚糖酶，經(jīng)純化后分析，分子量為38900Da，等電點(diǎn)PI為3.0，酶反應(yīng)最適pH為10.0～11.0，最適反應(yīng)溫度為80℃，穩(wěn)定溫度為60℃左右，金屬離子中Cu²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺、Al²⁺、Co²⁺對(duì)該酶有一定的激活作用，而Ag⁺、Hg²⁺、Mn²⁺對(duì)該酶有明顯的抑制作用，該酶水解魔芋粉后產(chǎn)生葡萄糖、甘露糖以及低聚糖。

基于上述菌學(xué)特征和理化性質(zhì)，并參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,9th Edition,the Williams&Wilkins Company,Baltimore,1992)，本發(fā)明人將該菌株確定為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)NTT33。

4)誘變

葡萄糖液體培養(yǎng)基的成分為每升含有葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨5g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，用Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH至10-11，滅菌冷卻后用于接種；葡萄糖固體培養(yǎng)基是在上述組分的基礎(chǔ)上每升添加瓊脂18g，滅菌后倒平皿；將嗜堿芽孢桿菌NTT33菌株接種至上述葡萄糖液體培養(yǎng)基中活化，于37℃振蕩，180rpm，培養(yǎng)36-48小時(shí)；將活化好的出發(fā)菌株NTT33涂布于葡萄糖固體平皿上，取約1mg的亞硝基胍(Nitrosoguanidine)點(diǎn)在平皿一側(cè)，于37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，待平皿上生長出菌苔。

5)突變株的初篩

在上述葡萄糖固體平皿中，亞硝基胍顆粒產(chǎn)生的抑菌圈的周圍挑取菌苔，接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，再于槐豆膠平皿上涂布，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，獲得單菌落；槐豆膠平板培養(yǎng)基成分為每升含有槐豆膠5g，酵母膏1g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，瓊脂18g，并用Na₂CO₃調(diào)pH至10-11。

6)突變株的復(fù)篩

對(duì)獲得的單菌落突變株進(jìn)行復(fù)篩，其方法是挑取初篩槐豆膠平皿上周圍產(chǎn)生透明圈的單菌落，分別接種在槐豆膠液體培養(yǎng)基和葡萄糖液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，每隔4小時(shí)取樣，離心(8000rpm×10分鐘)提取上清液為粗酶液，按Akino(Agr.Biol.Chem.,52:773-779，1988)的方法測(cè)定甘露聚糖酶活力；一個(gè)酶活力單位定義為在本實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘釋放1μg甘露糖的量，計(jì)算公式為：

U＝y(tǒng)×n×1/10

式中：U—酶活力單位；

y—還原糖的微克數(shù)；

n—酶液稀釋倍數(shù)；

10—反應(yīng)時(shí)間為10min。

根據(jù)上述方法測(cè)得的數(shù)據(jù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以酶活力為縱坐標(biāo)，繪制產(chǎn)酶進(jìn)程曲線；兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲取的粗酶液均測(cè)到甘露聚糖酶活性者，為產(chǎn)生組成型甘露聚糖酶的突變株；在測(cè)定多個(gè)單菌落的產(chǎn)酶進(jìn)程曲線后，篩選出一株能夠在槐豆膠液體培養(yǎng)基和葡萄糖液體培養(yǎng)基中同時(shí)產(chǎn)生甘露聚糖酶的嗜堿芽孢桿菌(圖1)，本發(fā)明將該突變株記為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)NTT33C6。

實(shí)施例2：

嗜堿芽孢桿菌NTT33C6在大麻生物脫膠中的應(yīng)用及效果分析，其步驟是：

1)獲得的突變株NTT33C6于槐豆膠液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，200rpm，36-48小時(shí)活化；

2)分別轉(zhuǎn)入含有大麻的培養(yǎng)基中，37℃振蕩，200rpm，培養(yǎng)6-8小時(shí)；所述培養(yǎng)基成分為除去麻皮或未去麻皮的大麻纖維10g，(NH₄)₂SO₄ 1.5g，K₂HPO₄0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，水150mL，并用Na₂CO₃調(diào)pH至10-11；

3)觀察培養(yǎng)基中纖維分散情況，測(cè)得殘膠率，分析大麻原麻和生物脫膠后纖維的脂蠟質(zhì)、水溶物、果膠物質(zhì)、半纖維素、木質(zhì)素及纖維素含量[中華人民共和國《苧麻化學(xué)成分定量分析方法》(GB5889-86)]。其測(cè)定方法與計(jì)算公式如下：

①原麻含水率的測(cè)定

將麻樣隨機(jī)分取，做成每個(gè)重約5g的試樣，共3個(gè)，稱量并記下每個(gè)試樣的質(zhì)量，原質(zhì)量記為G₀；然后分別將3個(gè)麻樣置于電熱恒溫干燥箱中，烘至恒重(先后兩次重量差不超過后一次重量的0.02％，下同)；取出迅速放于干燥器中冷卻30±5分鐘，分別精確稱取試樣與稱量瓶總重量并記錄，按式(1)計(jì)算：

式中：W₀——————試樣的含水率，％；

G₀——————最初的試樣質(zhì)量，g；

G₁——————烘干至恒重之后的試樣質(zhì)量，g；

②原麻脂蠟質(zhì)含量的測(cè)定

將測(cè)過含水率的試樣分別放入脂肪提取器內(nèi)，試樣高度低于溢流口約10～15mm；燒瓶中加入150mL苯乙醇(體積比2:1)溶液在恒溫下進(jìn)行提取，控制回流速度為4～6次/h；從提取液開始滴落起計(jì)時(shí)，提取3h；取出試樣在通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)千，然后放入已知重量的稱量瓶中，在105～110℃下烘至恒重；取出迅速放于干燥器中冷卻30±5min，分別精確稱取試樣與稱量瓶總重量并記錄。按式(2)計(jì)算:

式中：W₁——————試樣的脂蠟質(zhì)含量，％；

G₀——————試樣抽取脂蠟質(zhì)前(或測(cè)含水率后)的干重，g；

G₁——————試樣抽取脂蠟質(zhì)后的干重，g；

③原麻水溶物含量的測(cè)定

將提取脂蠟質(zhì)后的試樣分別放入加有150mL蒸餾水的三角燒瓶中，裝好球型冷凝管沸煮1h；更換新蒸餾水，重新沸煮2h；取出試樣在分樣篩中洗凈，放入已知重量的稱量瓶中烘至恒重，取出迅速放于干燥器中冷卻，稱重并記錄，按式(3)計(jì)算：

式中：W₂——————試樣的水溶物含量，％；

G₂——————試樣提取水溶物后的干重，g；

④原麻果膠物質(zhì)含量的測(cè)定

將提取水溶物后的試樣分別放入加有150mL濃度為5g/L的草酸銨溶液的三角燒瓶中，裝好球型冷凝管沸煮3h；取出在分樣篩中洗凈，放入已知重量的稱量瓶中烘至恒重，取出迅速放于干燥器中冷卻，稱重并記錄，按式(4)計(jì)算：

式中：W₃——————試樣的果膠物質(zhì)含量，％；

G₃——————試樣提取果膠物質(zhì)后的于重，g；

⑤原麻半纖維素含量的測(cè)定

將提取果膠物質(zhì)后的試樣分別放入加有150mL濃度為20g/L氫氧化鈉溶液的三角燒瓶中，裝好球型冷凝管沸煮3-5h，取出于分樣篩中洗凈，放入已知重量的稱量瓶中，烘至恒重，取出迅速放于干燥器中冷卻，稱重并記錄，按式(5)計(jì)算：

式中：W₄——————試樣的半纖維素含量，％；

G₄——————試樣提取半纖維素后的干重，g。

⑥原麻木質(zhì)素含量的測(cè)定

從麻樣中隨機(jī)選4-6點(diǎn)，取重約5g的樣品提取脂蠟質(zhì)后，風(fēng)干剪碎(長度不超過1.5mm)，稱取每個(gè)重約1g的試樣共3個(gè)，分別放于已知重量的有塞三角燒瓶中烘至恒重，取出迅速放于干燥器中冷卻，稱重記錄；然后緩緩加入30mL72％的硫酸溶液，在8～15℃下放置24h；然后移至三角燒瓶中用蒸餾水稀釋至300mL，裝好球型冷凝管沸煮1h；晾冷，用已知重量的玻璃砂芯濾器反復(fù)抽濾、洗滌直至濾液中不含硫酸根離子時(shí)為止(用10％氯化鋇溶液檢驗(yàn))；取下玻璃砂芯濾器烘至恒重，取出迅速放于干燥器中冷卻，稱重并記錄，按式(6)計(jì)算：

式中：W₅——————試樣的木質(zhì)素含量，％；

A——————試樣的木質(zhì)素與玻璃砂芯濾器總干重，g；

B——————玻璃砂芯濾器干重，g；

C——————試樣與有塞三角燒瓶總干重，g；

D——————有塞三角燒瓶干重，g；

⑦原麻含膠量的測(cè)定

將麻樣隨機(jī)分取做成每個(gè)重約5g的試樣共3個(gè)，分別放于已知重量的稱量瓶中烘至恒重，取出迅速放于干燥器中冷卻稱重并記錄；將其放于加有150mL、濃度為20g/L氫氧化鈉溶液的三角燒瓶中，裝好球型冷凝管沸煮1h；更換新氫氧化鈉溶液(濃度為20g/L)，重新沸煮2h；取出試樣在分樣篩中洗凈，分別放在已知重量的稱量瓶中烘至恒重，取出迅速放于干燥器中冷卻，稱重并記錄，按式(7)計(jì)算：

式中：W_j——————試樣的含膠率，％；

G₀——————試樣的干重，g；

G₀′——————測(cè)定含膠率后的試樣干重，g；

⑧精干麻殘膠率的測(cè)定

將烘干后的精干麻放置于已知重量的稱量瓶中，烘干至恒重，取出迅速放于干燥器中冷卻，稱重并記錄；然后將試樣分別放入加有150mL，濃度20g/L的氫氧化鈉溶液的三角瓶中，裝好球形冷凝管煮沸3h；取出試樣，在分樣篩中洗干凈，分別放于已知重量的稱量瓶中，烘干至恒重，取出迅速放于干燥器中冷卻，稱重并記錄數(shù)據(jù)，按式(8)計(jì)算：

Wc＝(G₀—G₀′)/G₀×100％ (8)

式中：Wc----試樣的殘膠率，％；

G₀----試樣的干重，g；

G₀′----提取殘膠后試樣的干重，g。

4)嗜堿芽孢桿菌NTT33C6對(duì)去麻皮大麻的生物脫膠效果分析如表1及表2所示：

表1去麻皮大麻含膠率和生物脫膠殘膠率分析

表2去麻皮大麻原麻及其生物脫膠后的纖維化學(xué)成分分析

從表1可見，僅生物脫膠法能夠脫去膠質(zhì)成分的66.19％；從表2可以看出，僅生物脫膠法能夠脫去脂蠟質(zhì)57.3％，水溶物83.56％，果膠物質(zhì)90.75％，半纖維素51.25％，木質(zhì)素62.55％，纖維素含量明顯比原麻含量提高，是原麻含量的1.558倍；對(duì)生物脫膠廢液進(jìn)行化學(xué)耗氧量COD_Cr值測(cè)定(國家環(huán)保局，水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法編委會(huì)，水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第四版)[M].北京：中國環(huán)境出版社，2002，210-213.)，結(jié)果表明COD_Cr值約為12000mg/mL，雖然廢液的COD_Cr值較高，但主要是含有高濃度菌體蛋白的污水，屬于極容易利用生物法處理的污水。

5)嗜堿芽孢桿菌NTT33C6對(duì)未去麻皮大麻的生物脫膠效果分析如表3及表4所示：

表3未去麻皮大麻的原麻化學(xué)成分分析

表4未去麻皮大麻含膠率及其生物脫膠后殘膠率分析

從表3可見，未去麻皮大麻的原麻含膠量很高，而纖維素含量僅為33.48％；表4顯示，即使使用未去麻皮大麻原麻為原料，生物脫膠效果依然明顯，可以去除膠質(zhì)含量的80％以上。

實(shí)施例3：

嗜堿芽孢桿菌NTT33C6在大麻生產(chǎn)中的應(yīng)用，其步驟是：

1)按照實(shí)施例2中步驟1)和2)所述方法對(duì)大麻進(jìn)行生物脫膠；

2)生物脫膠后的大麻分散如棉花狀，大麻水洗后1次，在含0.2-0.4％質(zhì)量濃度的NaOH及0.1％質(zhì)量濃度的三聚磷酸鈉的溶液中，0.2Mpa，煮煉1-2小時(shí)。

3)按化學(xué)脫膠的一般處理方法(金鋼.大麻脫膠方法的研究進(jìn)展[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，33(4)：140-144.)進(jìn)行水洗、打麻、漂白(有效氯0.5-0.8g/L)、水洗、酸洗(pH2.5)、水洗、甩干、給油后，甩干、干燥，得到符合國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)需要的精干麻工藝?yán)w維。