本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及一類具有靶向周期蛋白依賴性激酶(CDK)和DNA損傷雙重作用的β-咔啉類衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽，它們的制備方法，含有這些衍生物的藥用組合物以及它們的醫(yī)藥用途，特別是在制備針對(duì)惡性腫瘤和抗耐藥性惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤是僅次于心血管疾病的人類第二大致死病因，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，2012年有超過8百萬人死于癌癥。近三十年來，世界癌癥發(fā)病率以年均3-5％的速度遞增，預(yù)計(jì)到2020年前，全球癌癥發(fā)病率將比2008年增加50％，即每年將新增1500萬癌癥患者。臨床上雖有多種抗腫瘤藥物可供使用，但由于腫瘤病因的復(fù)雜性、腫瘤的耐藥性以及抗腫瘤藥物的毒副作用等因素，現(xiàn)有藥物仍然不能滿足治療的需要。因此，尋找藥效高、靶向性強(qiáng)、毒副作用小的新型抗腫瘤藥物具有重要意義。

大量研究表明，從天然產(chǎn)物中尋找新藥是防治腫瘤的一條重要途徑。天然產(chǎn)物特有的生物活性多樣性和良好的類藥性，奠定了其成藥的較高機(jī)率。據(jù)統(tǒng)計(jì)，從上世紀(jì)80年代到現(xiàn)在全世界上市的小分子抗腫瘤新藥中，約79.8％來源于天然產(chǎn)物或以其結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)行設(shè)計(jì)、合成的衍生物或類似物，正在臨床或臨床前研究的此類化合物為數(shù)更多。β-咔啉類化合物是一大類天然存在的吲哚類生物堿，具有結(jié)構(gòu)類似于咔唑的吡啶[3,4-b]并吲哚的平面三環(huán)結(jié)構(gòu)骨架。天然存在的β-咔啉類化合物分布廣泛，種類多樣，主要存在于多種陸地植物和海洋無脊椎動(dòng)物中。這些化合物一般具有抗腫瘤、抗病毒、抗錐蟲等多種生物活性，尤其在抗腫瘤活性方面，作用于多個(gè)生物靶點(diǎn)，且其毒性卻非常低，這些獨(dú)特的生物學(xué)特性與作用機(jī)制受到國(guó)內(nèi)外研究者越來越多的重視。天然產(chǎn)物harmine是駱駝蓬屬植物的種子和根中主要一種β-咔啉生物堿，研究發(fā)現(xiàn)在較低濃度下阻斷DNA復(fù)制來抑制癌細(xì)胞增殖。近年來研究發(fā)現(xiàn)，利用β-咔啉生物堿來設(shè)計(jì)新的藥物分子，通常在β-咔啉的1位和3位進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜〈軌蛟鰪?qiáng)其抗腫瘤活性，降低毒性，在β-咔啉的3位引入堿性基團(tuán)，能夠大大增強(qiáng)其與DNA的親和性等構(gòu)效關(guān)系信息，這也為β-咔啉類化合物在其它領(lǐng)域的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

化合物的設(shè)計(jì)將同時(shí)兼顧生物活性，成藥性，合成難易三個(gè)方面。結(jié)合β-咔啉生物堿骨架的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和分子生物學(xué)功能特點(diǎn)出發(fā)，并結(jié)合己經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道的β-咔啉衍生物構(gòu)效關(guān)系和藥物結(jié)構(gòu)脂水分布系數(shù)，本項(xiàng)目以β-咔啉芳雜環(huán)看做片狀疏水區(qū)，飽和的含氮雜環(huán)作為親水區(qū)，并通過酰胺或者脲等基團(tuán)連接到β-咔啉3位，從而設(shè)計(jì)并合成出具有的新型β-咔啉類衍生物，研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用，發(fā)現(xiàn)該類化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞(包括肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、子宮癌等)和耐藥腫瘤細(xì)胞(包括肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等)增殖都具有強(qiáng)烈的抑制效果，并能夠顯著阻滯腫瘤細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞周期蛋白CDK1、cycln B，考察β-咔啉芳香環(huán)與DNA嵌入結(jié)合引起的DNA損傷作用。深入研究這類化合物的藥物作用機(jī)制和生物學(xué)特性，本發(fā)明公開了一類具有靶向CDK和DNA損傷的新型β-咔啉類衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽，目前尚未見對(duì)此類化合物的任何報(bào)道。

本發(fā)明的目的在于提供一種靶向CDK和DNA損傷的β-咔啉衍生物及其制備方法和醫(yī)藥用途。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：

一種具有靶向CDK和DNA損傷的β-咔啉衍生物，具有下述通式Ⅰ的結(jié)構(gòu)：

通式Ⅰ中：R代表或者或者

R¹代表CH₃-，或者R¹代表H，對(duì)甲基苯基，4-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，3,4-二甲氧基苯基，3,5-二甲氧基苯基，3,4,5-三甲氧基苯基，4-氟苯基，4-溴苯基，4-硝基苯基，3-硝基苯基；

Y為形式，可為飽和或不飽和的環(huán)狀基團(tuán)，其中R²可以分別獨(dú)立地選自基團(tuán)選自H，或C1～C12的飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基,或帶有O,N,S，鹵素等雜原子的C1～C12的飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基,或苯基、取代苯基，及各種雜環(huán)基團(tuán)；X可以為O，或S，或CH₂，或NH，或含取代基團(tuán)的CH，或含取代基團(tuán)的N等。

根據(jù)上面所述的具有靶向CDK和DNA損傷雙重作用的β-咔啉衍生物，其特征是：Y基團(tuán)尤其特別優(yōu)選含有各種羥基、巰基、氨基、鹵素及烷基取代的飽和含氮雜環(huán)如哌啶環(huán)、哌啶基哌啶環(huán)、吡咯環(huán)、哌嗪環(huán)、高哌嗪環(huán)或嗎啉環(huán)等。

所述通式Ⅰ的結(jié)構(gòu)中的R、R¹和Y選自如下組合：

R¹＝4-甲氧基苯基，

或者R¹＝4-甲氧基苯基，

或者R¹＝4-甲氧基苯基，

或者R¹＝4-甲氧基苯基，

或者R¹＝4-甲氧基苯基，

或者R¹＝4-甲氧基苯基，

或者R¹＝4-甲氧基苯基，

或者R¹＝4-甲氧基苯基，

或者R¹＝4-甲氧基苯基，

或者R¹＝4-甲氧基苯基，

或者R¹＝3-甲氧基苯基，

或者R¹＝3-甲氧基苯基，

或者R¹＝3-甲氧基苯基，

或者R¹＝3,4-二甲氧基苯基，

或者R¹＝3,4-二甲氧基苯基，

或者R¹＝甲基，

或者R¹＝4-甲基苯基，

或者R¹＝4-甲基苯基，

或者R¹＝甲基，

或者R¹＝3-硝基苯基，

或者R¹＝4-硝基苯基，

或者R¹＝4-硝基苯基，

或者R¹＝3,5-二甲氧基苯基，

或者R¹＝3,5-二甲氧基苯基，

或者R¹＝4-氟苯基，

或者R¹＝4-溴苯基，

或者R¹＝H，

或者R¹＝H，

上述結(jié)構(gòu)通式Ⅰ優(yōu)選化合物代號(hào)及其對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)如表1所示

表1通式I優(yōu)選化合物代號(hào)及其對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)

本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明通式Ⅰ所述化合物的制備方法。

通式Ⅰ所示具有靶向CDK和DNA損傷雙重作用的β-咔啉類衍生物的合成路線如下所示：

由L-色氨酸與不同取代醛在酸或堿催化下通過Pictet–Spengler反應(yīng)得到的1-R¹-3-羧基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉(1)，直接KMnO₄氧化得到1-R¹-3-羧基-β-咔啉(2)，化合物(1)還可以在含有二氯亞砜催化下與甲醇溶劑進(jìn)行甲酯化得到化合物(3)，再經(jīng)過KMnO₄氧化得到化合物(4)，化合物(4)與水合肼通過酯交換反應(yīng)得到化合物(5)，化合物(5)和NaNO₂溶液在酸性環(huán)境下反應(yīng)得到含有?；B氮基團(tuán)的化合物(6)，化合物(6)在HAc和H₂O混合液中還原為化合物(7)；將對(duì)氯甲基苯甲酸(8)酰氯化后與化合物(7)反應(yīng)得到中間體(9)，中間體(9)再與各種氮雜環(huán)反應(yīng)得到目標(biāo)化合物I_a；

4-硝基溴芐(10)與各種氮雜環(huán)反應(yīng)得到中間體(11)，再經(jīng)過鈀碳催化氫氣下還原得到中間體(12)，中間體(12)與化合物(2)在在1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的二氯甲烷或DMF溶液中反應(yīng)得到縮合目標(biāo)產(chǎn)物I_b；

中間體(12)與含有?；B氮基團(tuán)的化合物(6)在DMF溶液縮合重排反應(yīng)得到目標(biāo)化合物I_c，具體合成路線如下：

其中，Ⅰ_a、Ⅰ_b和Ⅰ_c均屬于通式Ⅰ化合物。R¹代表CH₃-，或者R¹代表H，對(duì)甲基苯基，4-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，3,4-二甲氧基苯基，3,5-二甲氧基苯基，3,4,5-三甲氧基苯基，4-氟苯基，4-溴苯基，4-硝基苯基，3-硝基苯基；

Y為形式，可為飽和或不飽和的環(huán)狀基團(tuán)，其中R²可以分別獨(dú)立地選自基團(tuán)選自H，或C1～C12的飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基,或帶有O,N,S，鹵素等雜原子的C1～C12的飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基,或苯基、取代苯基，及各種雜環(huán)基團(tuán)；X可以為O，或S，或CH₂，或NH，或含取代基團(tuán)的CH，或含取代基團(tuán)的N等。

一種藥物組合物，由治療上有效劑量的通式Ⅰ化合物或其醫(yī)學(xué)上可接受的鹽與藥學(xué)上可接受的載體或輔料的藥物組成的組合物。

一種具有靶向CDK和DNA損傷雙重作用的β-咔啉類衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療普通敏感惡性腫瘤和耐藥惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

具有靶向CDK和DNA損傷雙重作用的β-咔啉類衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療普通敏感惡性腫瘤和耐藥惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述普通敏感惡性腫瘤是指肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、子宮癌等，耐藥惡性腫瘤是指肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等。

本發(fā)明化合物可以單獨(dú)或與一種或一種以上的藥學(xué)上可接受的載體組合制成制劑以供給藥。例如，溶劑、稀釋劑等，可以用口服劑型給藥，如片劑、膠囊、可分散粉末、顆粒劑等。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域中熟知的方法進(jìn)行制備。這些藥用制劑中可以含有與載體組合的例如0.05％～90％重量的活性成分，更常見約15％～60％之間重量的活性成分。本發(fā)明化合物劑量可以是0.005～5000mg/kg/天，也可根據(jù)疾病嚴(yán)重程度或劑型的不同使用劑量超出此劑量范圍。

本發(fā)明化合物可以與其他抗腫瘤藥物例如烷化劑(如環(huán)磷酰胺或順鉑)、抗代謝藥(如5-氟尿嘧啶或羥基脲)、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(如喜樹堿)、有絲分裂抑制劑(如紫杉醇或長(zhǎng)春堿)、DNA插入劑(如阿霉素)聯(lián)合應(yīng)用，另外還可以與放射治療聯(lián)合應(yīng)用。這些其他抗腫瘤藥物或放射治療可以與本發(fā)明化合物同時(shí)或在不同時(shí)間給予。這些聯(lián)合治療可以產(chǎn)生協(xié)同作用從而有助于改善治療效果。

本發(fā)明化合物的部分藥理試驗(yàn)結(jié)果如下：

(1)四甲基氮唑藍(lán)比色法(MTT)體外抗腫瘤試驗(yàn)

藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明化合物Ⅰ₁-Ⅰ₂₈對(duì)人類腫瘤細(xì)胞的增殖具有不同程度的抑制作用，大部分化合物抗腫瘤活性顯示出比陽性對(duì)照藥系系他濱(Gem)稍強(qiáng)或相當(dāng)。多數(shù)化合物抗腫瘤活性經(jīng)過一系列腫瘤細(xì)胞測(cè)試，尤其表2中和化合物在12.5μmol/L濃度下抑制率均超過陽性對(duì)照藥。隨后將活性較好β-咔啉類衍生物進(jìn)行對(duì)人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株HCT-8/5-FU和人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel-7402/FU抗腫瘤活性測(cè)試，從表3的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物在12.5μmol/L濃度下均有較好的抗增殖抑制活性，尤其是化合物Ⅰ_8-10和Ⅰ₁₂-22的抑制率均顯著超過陽性對(duì)照藥。由此說明本發(fā)明化合物不僅能夠顯著抑制普通敏感性腫瘤細(xì)胞增殖，而且能夠有效抑制耐藥性腫瘤細(xì)胞增殖。

表2本發(fā)明部分化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率％(12.5μmol/L)

ND:未檢測(cè).

表3本發(fā)明部分化合物對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率％(12.5μmol/L)

ND:未檢測(cè).

3、Western blot檢測(cè)活性較好的β-咔啉類衍生物I₈、Ⅰ₁₂和Ⅰ₂₂對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞周期蛋白CDK1和Cyclin B以及DNA損傷標(biāo)志蛋白H2AX(S139ph)表達(dá)的影響，結(jié)果表明，在1.0μM和2.5μM濃度下，化合物I₈、Ⅰ₁₂和Ⅰ₂₂抑制能夠劑量依賴性地抑制細(xì)胞周期蛋白CDK1和Cyclin B的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)DNA損傷蛋白H2AX(S139ph)的表達(dá)，由此說明化合物I₈、Ⅰ₁₂和Ⅰ₂₂抑制細(xì)胞增殖的方式是通過抑制細(xì)胞周期蛋白CDK1和Cyclin B，以及通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞DNA損傷來發(fā)揮抗腫瘤作用的。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為本發(fā)明通式Ⅰ化合物中優(yōu)選化合物I₈、Ⅰ₁₂和Ⅰ₂₂的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)本發(fā)明符合通式Ⅰ結(jié)構(gòu)的其他化合物的藥理藥效亦有指導(dǎo)意義，由于本發(fā)明通式Ⅰ化合物具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，因而具有相同或相似的藥理藥效作用，經(jīng)過上述藥理實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，說明通式Ⅰ化合物具有顯著抗腫瘤活性。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例，這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對(duì)本發(fā)明具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1N-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺(Ⅰ₁)的制備

1-(4-甲氧基苯基)-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸(1a)

將L-色氨酸(10.20g,50mmol)溶解于80ml CH₃COOH溶液中，加入6.8ml4-甲氧基苯甲醛(55mmol)，90℃下攪拌3h。反應(yīng)完畢，用2M的NaOH溶液將反應(yīng)液調(diào)至PH＝5-6，析出大量白色固體，抽濾，用水洗滌，真空干燥得到白色固體13.50g，產(chǎn)率84％。

1-(4-甲氧基苯基)-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸甲酯(3a)

將1a(16.10g,50mmol)溶于140ml甲醇中，-5℃低溫劇烈攪拌下緩慢滴加10.90ml SOCl₂(17.85g,150mmol)，半小時(shí)后加熱回流4h，反應(yīng)完畢減壓濃縮除去溶劑，濃縮物中加入適量水溶解，用1M NaOH溶液調(diào)PH至8，析出白色固體，抽慮，濾餅減壓干燥得到白色固體16.40g，產(chǎn)率97％。

1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸甲酯(4a)

將3a(16.80g,50mmol)溶于150ml DMF溶劑中，-5℃機(jī)械攪拌下，分批加入KMnO₄(11.05g,70mmol)，繼續(xù)攪拌1h后，抽濾，反應(yīng)液加入到200ml冷水中，析出沉淀，抽慮得淡棕色固體10.80g，總收率65％。

1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰酰肼(5a)

將4a(16.60g,50mmol)溶于130ml甲醇中，再向其中加入88.20ml 85％水合肼(75.00g,1500mmol)，加熱回流4h，反應(yīng)完畢后冷卻至0℃，抽濾得到淡棕色固體。再向?yàn)V液中加入大量冷水，會(huì)繼續(xù)析出固體，抽濾，濾餅減壓干燥總共得到固體14.30g，產(chǎn)率86％。

1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-疊氮化羰基(6a)

將5a(16.60g,50mmol)溶于100ml 2M HCl溶液中，再將NaNO₂(10.35g,150mmol)溶于80ml H₂O中，-5℃機(jī)械攪拌下，將NaNO₂溶液緩緩滴入5a溶液中，繼續(xù)攪拌1h后，用1M NaOH溶液條PH至8，析出淡黃色固體，抽濾得到淡黃色固體16.30g，總收率95％。

1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7a)

將6a(17.15g,50mmol)溶于150ml H₂O和冰醋酸(1:1)的混合液中，90℃下回流5h，反應(yīng)完畢后，減壓濃縮去除溶劑，柱層析得到9.80g淡黃色固體，總收率68％。MS(ESI)m/z:290[M+H]⁺.

4-(氯甲基)-N-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(9a)的制備

將7a(0.58g,2mmol)溶于5ml無水二氯甲烷中，加入1.10ml三乙胺(0.81g,8mmol)，再將酰氯化的對(duì)氯甲基苯甲酸(0.38g,2mmol)溶于3ml無水二氯甲烷中，并在-5℃冰浴下緩緩滴加入7a中，0.5h后，反應(yīng)完畢。蒸除反應(yīng)液中的二氯甲烷溶劑，加入100mL水，乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有機(jī)層，清水洗(30mL×2)，飽和食鹽水(30mL)洗，干燥，過濾，濃縮得淡黃色固體0.81g，收率91％。N-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺(Ⅰ₁)的制備

將9a(0.44g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入N-甲基哌嗪(0.15g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.47g淡黃色固體，收率93％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.42(s,1H,NH),10.58(s,1H,NH),8.74(s,1H,Ar-H),8.25(s,1H,Ar-H),8.22(m,4H,J＝6.0Hz,Ar-H),7.65(d,1H,Ar-H),7.57(t,1H,J＝6.0Hz,Ar-H),7.48(d,2H,Ar-H),7.28(d,1H,Ar-H),7.20(d,2H,Ar-H),3.89(s,3H,OCH₃),3.63(s,2H,Ar-CH₂),3.45(m,4H,CH₂),3.43(m,4H,CH₂),2.85(s,3H,CH₃).MS(ESI)m/z:506[M+H]⁺.HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₁H₃₁N₅O₂,505.2478；found,506.2511[M+H]⁺.

實(shí)施例2 1-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-3-(4-(嗎啉基甲基)苯基)脲(Ⅰ₂)的制備

4-(4-硝基芐基)嗎啉(11a)

將4-硝基溴芐(4.30g,20mmol)溶于40ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(5.52g,40mmol)，KI(0.33g,2mmol)，然后向其中加入嗎啉(1.91g,22mmol)，5h后，反應(yīng)完全。將反應(yīng)液濃縮旋干，再向其中加入100ml H₂O，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，收集有機(jī)層，濃縮，得到4.17g固體，產(chǎn)率94％。

4-(嗎啉基甲基)苯胺(12a)

將11a(2.22g,10mmol)溶于甲醇溶劑中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入200mg Pd/C，然后通入H₂反應(yīng)，6h后反應(yīng)完全。過濾，收集濾液，濃縮，得到1.83g固體。產(chǎn)率95％。

1-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-3-(4-(嗎啉基甲基)苯基)脲(Ⅰ₂)的制備

將6a(0.34g,1mmol)溶于10ml無水甲苯中，并加入少量無水DMF助溶，然后向反應(yīng)瓶中加入12a(0.19g,1mmol)，130℃回流3-4h，反應(yīng)完全。濃縮，柱層析得到0.35g淡黃色固體，收率69％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.42(s,1H,NH),10.58(s,1H,NH),8.74(s,1H,Ar-H),8.24(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.07(m,4H,Ar-H),7.55(m,4H,Ar-H),7.23(m,3H,Ar-H),3.89(s,3H,OCH₃),3.60(m,4H,CH₂),3.56(s,2H,Ar-CH₂),2.39(s,4H,CH₂).MS(ESI)m/z:508[M+H]⁺.實(shí)施例3N-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-4-(哌嗪-1-亞甲基)苯甲酰胺(Ⅰ₃)的制備

將9a(0.44g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入哌嗪(0.34g,4mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.44g淡黃色固體，收率90％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.43(s,1H,NH),10.60(s,1H,NH),8.74(s,1H,Ar-H),8.24(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.10(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.06(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.64(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.56(m,1H,Ar-H),7.49(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.26(t,1H,Ar-H),7.19(d,2H,J＝0.60Hz,A-r),3.89(s,3H,OCH₃),3.65(s,2H,Ar-CH₂),3.10(m,4H,CH₂),2.55(m,4H,CH₂),2.00(s,1H,NH).MS(ESI)m/z:492[M+H]⁺.HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₀H₂₉N₅O₂,491.2321；found,492.2355[M+H]⁺.

實(shí)施例4 4-((4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基)甲基)-N-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₄)的制備

將9a(0.44g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入N-羥乙基哌嗪(0.19g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.51g淡黃色固體，收率95％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.42(s,1H,NH),10.58(s,1H,NH),8.74(s,1H,Ar-H),8.24(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.07(m,4H,Ar-H),7.63(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.55(s,1H,Ar-H),7.45(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.25(t,1H,Ar-H),7.18(d,2H,J＝0.60Hz,A-r),4.39(s,1H,OH),3.89(s,3H,OCH₃),3.55(s,2H,Ar-CH₂),3.49(d,2H,J＝0.60Hz,CH₂),2.39(m,10H,CH₂).MS(ESI)m/z:536[M+H]⁺.HRMS(ESI)m/zcalcd for C₃₂H₃₃N₅O₃,535.2583；found,536.2617[M+H]⁺.

實(shí)施例5 4-((4-羥基哌啶-1-基)甲基)-N-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₅)的制備

將9a(0.44g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入4-羥基哌啶(0.15g,1.5mmol)，10h后濃縮，柱層析得到0.48g淡黃色固體，收率94％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.42(s,1H,NH),10.57(s,1H,NH),8.74(s,1H,Ar-H),8.24(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.06(m,4H,Ar-H),7.63(d,1H,Ar-H),7.55(m,1H,Ar-H),7.44(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.24(t,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.18(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),3.88(s,3H,OCH₃),3.52(s,2H,Ar-CH₂),3.47(s,1H,OH),2.67(s,2H,CH₂),2.07(s,2H,CH₂),1.72(d,2H,CH₂),1.41(m,2H,CH₂).MS(ESI)m/z:507[M+H]⁺.HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₁H₃₀N₄O₃,506.2318；found,507.2351[M+H]⁺.

實(shí)施例6 1-(4-甲氧基苯基)-N-(4-(吡咯烷-1-亞甲基)苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(Ⅰ₆)的制備

1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸(2a)

將1a(16.10g,50mmol)溶于150ml DMF溶劑中，-5℃機(jī)械攪拌下，分批加入KMnO₄(11.05g,70mmol)，繼續(xù)攪拌1h后，抽濾，反應(yīng)液加入到200ml冷水中，析出沉淀，抽慮得淡棕色固體11.00g，收率69％。

4-(4-硝基芐基)吡咯烷(11b)

將4-硝基溴芐(4.30g,20mmol)溶于40ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(5.52g,40mmol)，KI(0.33g,2mmol)，然后向其中加入吡咯烷(1.56g,22mmol)，5h后，反應(yīng)完全。將反應(yīng)液濃縮旋干，再向其中加入100ml H₂O，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，收集有機(jī)層，濃縮，得到3.83g固體，產(chǎn)率93％。

4-(嗎啉基甲基)苯胺(12b)

將11b(2.06g,10mmol)溶于甲醇溶劑中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入200mg Pd/C，然后通入H₂反應(yīng)，6h后反應(yīng)完全。過濾，收集濾液，濃縮，得到1.67g固體。產(chǎn)率95％。

1-(4-甲氧基苯基)-N-(4-(吡咯烷-1-亞甲基)苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(Ⅰ₆)

將2a(0.32g,1mmol)溶于10mml無水二氯甲烷中，再向其中加入EDCI(0.38g,2mmol)和DMAP(0.06g,0.5mmol),然后向其中加入12b(0.18g,1mmol),10h后，反應(yīng)結(jié)束，濃縮，柱層析得到0.46g淡黃色固體，收率97％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.43(s,1H,NH),10.61(s,1H,NH),8.75(s,1H,Ar-H),8.24(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.05(m,4H,Ar-H),7.64(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.55(m,3H,Ar-H),7.26(t,1H,Ar-H),7.19(d,2H,J＝0.60Hz,A-r),3.89(s,3H,OCH₃),3.70(s,2H,Ar-CH₂),2.54(s,4H,CH₂),1.73(s,4H,CH₂).MS(ESI)m/z:477[M+H]⁺.

實(shí)施例7 1-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-3-(4-(哌啶-1-亞甲基)苯基)脲(Ⅰ₇)的制備

4-(4-硝基芐基)嗎啉(11c)

將4-硝基溴芐(4.30g,20mmol)溶于40ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(5.52g,40mmol)，KI(0.33g,2mmol)，然后向其中加入哌啶(1.87g,22mmol)，5h后，反應(yīng)完全。將反應(yīng)液濃縮旋干，再向其中加入100ml H₂O，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，收集有機(jī)層，濃縮，得到4.09g固體，產(chǎn)率93％。

4-(嗎啉基甲基)苯胺(12c)

將11c(2.20g,10mmol)溶于甲醇溶劑中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入200mg Pd/C，然后通入H₂反應(yīng)，6h后反應(yīng)完全。過濾，收集濾液，濃縮，得到1.75g固體。產(chǎn)率92％。

1-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-3-(4-(哌啶-1-亞甲基)苯基)脲(Ⅰ₇)

將6a(0.34g,1mmol)溶于10ml無水甲苯中，并加入少量無水DMF助溶，然后向反應(yīng)瓶中加入12c(0.19g,1mmol)，130℃回流3-4h，反應(yīng)完全。濃縮，柱層析得到0.33g淡黃色固體，收率65％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.42(s,1H,NH),10.57(s,1H,NH),8.74(s,1H,Ar-H),8.24(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.06(m,4H,Ar-H),7.64(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.55(t,1H,Ar-H),7.45(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.25(t,1H,Ar-H),7.19(d,2H,J＝0.60Hz,A-r),3.89(s,3H,OCH₃),3.52(s,2H,Ar-CH₂),2.36(s,4H,CH₂),1.53(s,4H,CH₂),1.41(s,2H,CH₂).MS(ESI)m/z:506[M+H]⁺.

實(shí)施例8 4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)-N-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₈)的制備

將9a(0.44g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入4-哌啶基哌啶(0.25g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.54g淡黃色固體，收率94％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.43(s,1H,NH),10.59(s,1H,NH),8.74(s,1H,Ar-H),8.24(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.08(m,4H,Ar-H),7.64(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.56(m,1H,Ar-H),7.46(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.26(t,1H,Ar-H),7.19(d,2H,J＝0.60Hz,A-r),3.89(s,3H,OCH₃),3.60(s,2H,Ar-CH₂),3.17(s,2H,CH₂),2.96(s,4H,CH₂),2.00(m,4H,CH₂),1.82(s,2H,CH₂),1.68(s,6H,CH₂).MS(ESI)m/z:574[M+H]⁺.HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₆H₃₉N₅O₂,573.3104；found,574.3137[M+H]⁺.

實(shí)施例9 4-((1,4-二氮環(huán)庚烷-1-基)甲基)-N-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₉)的制備

將9a(0.44g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入高哌嗪(0.40g,4mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.46g淡黃色固體，收率91％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.43(s,1H,NH),10.59(s,1H,NH),8.74(s,1H,Ar-H),8.23(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.07(m,4H,Ar-H),7.63(d,1H,Ar-H),7.54(m,3H,Ar-H),7.25(t,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.18(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),3.88(s,3H,OCH₃),3.74(d,2H,Ar-CH₂),3.20(m,2H,CH₂),3.15(m,2H,CH₂),2.81(d,2H,CH₂),2.69(m,2H,CH₂),1.89(m,2H,CH₂),1.23(s,1H,NH).MS(ESI)m/z:506[M+H]⁺.

實(shí)施例10N-(1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-4-((4-甲基-1,4二氮環(huán)庚烷-1-基)甲基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₀)的制備

將9a(0.44g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入N-甲基高哌嗪(0.17g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.48g淡黃色固體，收率92％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.42(s,1H,NH),10.58(s,1H,NH),8.74(s,1H,Ar-H),8.23(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.08(m,4H,Ar-H),7.62(t,1H,Ar-H),7.54(m,3H,Ar-H),7.26(t,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.19(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),3.89(s,3H,OCH₃),3.79(d,2H,Ar-CH₂),2.82(s,4H,CH₂),2.71(s,2H,CH₂),1.97(s,2H,CH₂),1.21(d,3H,J＝0.60Hz,N-CH₃),0.83(m,2H,CH₂).MS(ESI)m/z:520[M+H]⁺.

實(shí)施例11 4-((4-異丙基哌嗪-1-基)甲基)-N-(1-(3-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₁)的制備

1-(3-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7b)的制備

參照1a-7a的制備方法，將L-色氨酸與間甲氧基苯甲醛經(jīng)過五步反應(yīng)，制備出化合物7b。MS(ESI)m/z:290[M+H]⁺.

1-(3-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7b)。

4-(氯甲基)-N-(1-(3-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(9b)的制備將7b(0.58g,2mmol)溶于5ml無水二氯甲烷中，加入1.10ml三乙胺，再將酰氯化的對(duì)氯甲基苯甲酸(0.38g,2mmol)溶于3ml無水二氯甲烷中，并在-5℃冰浴下緩緩滴加入7b中，0.5h后，反應(yīng)完畢。蒸除反應(yīng)液中的二氯甲烷溶劑，加入100mL水，乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有機(jī)層，清水洗(30mL×2)，飽和食鹽水(30mL)洗，干燥，過濾，濃縮得淡黃色固體0.79g，收率90％。

4-((4-異丙基哌嗪-1-基)甲基)-N-(1-(3-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₁)的制備

將9b(0.44g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入N-異丙基哌嗪(0.19g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.51g淡黃色固體，收率95％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.41(s,1H,NH),10.56(s,1H,NH),8.74(s,1H,Ar-H),8.24(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.07(m,4H,Ar-H),7.64(d,1H,Ar-H),7.55(t,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.45(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.26(t,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.19(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),3.89(s,3H,OCH₃),3.56(s,2H,Ar-CH₂),2.64(d,2H,CH₂),2.34(s,6H,CH₂),1.24(s,1H,CH),0.98(s,6H,CH₃).MS(ESI)m/z:534[M+H]⁺.

實(shí)施例12 4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)-N-(1-(3-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₂)的制備

將9b(0.44g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入4-哌啶基哌啶(0.25g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.53g淡黃色固體，收率92％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.45(s,1H,NH),10.59(s,1H,NH),8.80(s,1H,Ar-H),8.26(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.08(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.67(t,3H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.58(m,2H,Ar-H),7.45(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.28(t,1H,Ar-H),7.12(d,1H,J＝0.60Hz,A-r),3.90(s,3H,OCH₃),3.54(s,2H,Ar-CH₂),2.90(d,2H,J＝0.60Hz,CH₂),2.68(s,2H,CH₂),1.99(t,2H,J＝0.60Hz,CH₂),1.78(s,2H,CH₂),1.57(s,6H,CH₂),1.43(s,2H,CH₂),1.22(d,2H,CH₂).MS(ESI)m/z:574[M+H]⁺.

實(shí)施例13N-(1-(3-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-4-((4-甲基-1,4二氮環(huán)庚烷-1-基)甲基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₃)的制備

將9b(0.44g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入N-甲基高哌嗪(0.17g,1.5mmol)，反應(yīng)完濃縮，柱層析得到0.49g淡黃色固體，收率94％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.46(s,1H,NH),10.61(s,1H,NH),8.80(s,1H,Ar-H),8.26(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.11(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.66(t,3H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.58(m,4H,Ar-H),7.28(t,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.13(d,2H,J＝0.60Hz,A-r),3.91(s,3H,OCH₃),3.79(s,2H,Ar-CH₂),3.33(t,2H,CH₂),2.84(t,4H,CH₂),2.73(t,2H,CH₂),1.95(s,3H,CH₂),1.23(d,2H,J＝1.20Hz,CH₂).MS(ESI)m/z:520[M+H]⁺.

實(shí)施例14 4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)-N-(1-(3,4-二甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₄)的制備

1-(3,4-二甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7c)的制備

參照1a-7a的制備方法，將L-色氨酸與3,4-二甲氧基苯甲醛經(jīng)過五步反應(yīng)，制備出化合物7c。MS(ESI)m/z:320[M+H]⁺.

4-(氯甲基)-N-(1-(3,4-二甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(9c)的制備

將7c(0.63g,2mmol)溶于5ml無水二氯甲烷中，加入三乙胺(0.81g,8mmol)，再將酰氯化的對(duì)氯甲基苯甲酸(0.38g,2mmol)溶于3ml無水二氯甲烷中，并在-5℃冰浴下緩緩滴加入7c中，0.5h后，反應(yīng)完畢。蒸除反應(yīng)液中的二氯甲烷溶劑，加入100mL水，乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有機(jī)層，清水洗(30mL×2)，飽和食鹽水(30mL)洗，干燥，過濾，濃縮得淡黃色固體0.88g，收率93％。4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)-N-(1-(3,4-二甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₄)的制備

將9c(0.47g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入4-哌啶基哌啶(0.25g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.56g淡黃色固體，收率93％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.44(s,1H,NH),10.61(s,1H,NH),8.75(s,1H,Ar-H),8.24(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.09(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.59(m,4H,Ar-H),7.47(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.23(m,2H,Ar-H),3.92(s,3H,OCH3),3.89(s,3H,OCH₃),3.60(s,2H,Ar-CH₂),2.94(t,4H,CH₂),2.01(m,4H,CH₂),1.83(d,2H,CH₂),1.67(d,7H,CH₂),1.42(s,2H,CH₂).MS(ESI)m/z:604[M+H]⁺.

實(shí)施例15N-(1-(3,4-二甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-4-((4-甲基-1,4二氮環(huán)庚烷-1-基)甲基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₅)的制備

將9c(0.47g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入N-甲基高哌嗪(0.17g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.52g淡黃色固體，收率95％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.44(s,1H,NH),10.62(s,1H,NH),8.75(s,1H,Ar-H),8.24(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.10(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.64(d,3H,Ar-H),7.55(m,3H,Ar-H),7.24(m,2H,Ar-H),3.92(s,3H,OCH₃),3.89(s,3H,OCH₃),3.79(s,2H,Ar-CH₂),2.83(s,6H,CH₂),1.98(s,3H,N-CH₃),1.21(d,2H,CH₂).MS(ESI)m/z:550[M+H]⁺.

實(shí)施例16 4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)-N-(1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₆)的制備

1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7d)的制備

參照1a-7a的制備方法，將L-色氨酸與40％乙醛溶液經(jīng)過五步反應(yīng)，制備出化合物1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7d)。MS(ESI)m/z:198[M+H]⁺.

4-(氯甲基)-N-(1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(9d)的制備

將7d(0.41g,2mmol)溶于5ml無水二氯甲烷中，加入1.10ml三乙胺(0.81g,8mmol)，再將酰氯化的對(duì)氯甲基苯甲酸(0.38g,2mmol)溶于3ml無水二氯甲烷中，并在-5℃冰浴下緩緩滴加入7d中，0.5h后，反應(yīng)完畢。蒸除反應(yīng)液中的二氯甲烷溶劑，加入100mL水，乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有機(jī)層，清水洗(30mL×2)，飽和食鹽水(30mL)洗，干燥，過濾，濃縮得淡黃色固體0.66g，收率94％。4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)-N-(1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₆)的制備

將9d(0.35g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入4-哌啶基哌啶(0.25g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.45g淡黃色固體，收率94％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.53(s,1H,NH),10.55(s,1H,NH),8.66(s,1H,Ar-H),8.19(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.09(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.56(m,2H,Ar-H),7.44(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.23(m,1H,Ar-H),3.59(s,2H,Ar-CH₂),2.77(s,3H,Ar-CH₃),1.96(m,6H,CH₂),1.68(m,10H,CH₂),1.19(m,2H,CH₂).MS(ESI)m/z:482[M+H]⁺.

實(shí)施例17 4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)-N-(1-(對(duì)甲基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₇)的制備

1-(對(duì)甲基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7e)的制備

參照1a-7a的制備方法，將L-色氨酸與對(duì)甲基苯甲醛經(jīng)過五步反應(yīng)，制備出化合物(7e)。MS(ESI)m/z:274[M+H]⁺.

4-(氯甲基)-N-(1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(9e)的制備

將7e(0.55g,2mmol)溶于5ml無水二氯甲烷中，加入1.10ml三乙胺(0.81g,8mmol)，再將酰氯化的對(duì)氯甲基苯甲酸(0.38g,2mmol)溶于3ml無水二氯甲烷中，并在-5℃冰浴下緩緩滴加入7e中，0.5h后，反應(yīng)完畢。蒸除反應(yīng)液中的二氯甲烷溶劑，加入100mL水，乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有機(jī)層，清水洗(30mL×2)，飽和食鹽水(30mL)洗，干燥，過濾，濃縮得淡黃色固體0.80g，收率94％。4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)-N-(1-(對(duì)甲基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₇)的制備

將9e(0.43g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入4-哌啶基哌啶(0.25g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.54g淡黃色固體，收率97％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.41(s,1H,NH),10.58(s,1H,NH),8.76(s,1H,Ar-H),8.24(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.09(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.00(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.63(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.56(t,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.45(t,4H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.25(t,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),3.60(s,2H,Ar-CH₂),2.97(d,4H,CH₂),2.89(s,1H,CH),2.45(s,3H,Ar-CH₃),2.00(m,6H,CH₂),1.69(m,8H,CH₂).MS(ESI)m/z:558[M+H]⁺.

實(shí)施例18 4-((4-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷-1-基)甲基)-N-(1-(對(duì)甲基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₁₈)的制備

將9e(0.43g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入N-甲基高哌嗪(0.17g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.48g淡黃色固體，收率95％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ11.41(s,1H,NH),10.59(s,1H,NH),8.76(s,1H,Ar-H),8.24(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.10(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),8.00(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.63(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.56(d,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.52(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.44(d,2H,J＝0.60Hz,Ar-H),7.26(t,1H,J＝0.60Hz,Ar-H),3.78(s,2H,Ar-CH₂),2.82(d,6H,CH₂),2.70(m,2H,CH₂),2.45(s,3H,Ar-CH₃),1.97(s,3H,N-CH₃),1.20(d,2H,CH₂).MS(ESI)m/z:503[M+H]⁺.

實(shí)施例19 1-(4-((4-羥基哌啶-1-基)甲基)苯基)-3-(1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)脲(Ⅰ₁₉)的制備

1-(4-硝基芐基)哌啶-4-醇(11d)

將4-硝基溴芐(4.30g,20mmol)溶于40ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(5.52g,40mmol)，KI(0.33g,2mmol)，然后向其中加入4-羥基哌啶(2.22g,22mmol)，5h后，反應(yīng)完全。將反應(yīng)液濃縮旋干，再向其中加入100ml H₂O，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，收集有機(jī)層，濃縮，得到4.30g固體，產(chǎn)率91％。

1-(4-氨基芐基)哌啶-4-醇(12d)

將11d(2.36g,10mmol)溶于甲醇溶劑中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入200mg Pd/C，然后通入H₂反應(yīng)，6h后反應(yīng)完全。過濾，收集濾液，濃縮，得到1.94g固體。產(chǎn)率94％。

1-(4-((4-羥基哌啶-1-基)甲基)苯基)-3-(1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)脲(Ⅰ₁₉)

將6d(0.25g,1mmol)溶于10ml無水甲苯中，并加入少量無水DMF助溶，然后向反應(yīng)瓶中加入12d(0.21g,1mmol)，130℃回流3-4h，反應(yīng)完全。濃縮，柱層析得到0.30g淡黃色固體，收率70％。MS(ESI)m/z:430[M+H]⁺.

實(shí)施例20 4-((4-羥基哌啶-1-基)甲基)-N-(1-(3-硝基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₂₀)的制備

1-(3-硝基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7f)的制備

參照1a-7a的制備方法，將L-色氨酸與3-硝基苯甲醛經(jīng)過五步反應(yīng)，制備出化合物1-(3-硝基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7f)。MS(ESI)m/z:305[M+H]⁺.

4-(氯甲基)-N-(1-(3-硝基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(9f)的制備

將7f(0.61g,2mmol)溶于5ml無水二氯甲烷中，加入1.10ml三乙胺(0.81g,8mmol)，再將酰氯化的對(duì)氯甲基苯甲酸(0.38g,2mmol)溶于3ml無水二氯甲烷中，并在-5℃冰浴下緩緩滴加入7f中，0.5h后，反應(yīng)完畢。蒸除反應(yīng)液中的二氯甲烷溶劑，加入100mL水，乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有機(jī)層，清水洗(30mL×2)，飽和食鹽水(30mL)洗，干燥，過濾，濃縮得淡黃色固體0.79g，收率92％。4-((4-羥基哌啶-1-基)甲基)-N-(1-(3-硝基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₂₀)的制備

將9f(0.43g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入4-羥基哌啶(0.15g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.50g淡黃色固體，收率96％。MS(ESI)m/z:522[M+H]⁺.

實(shí)施例21 1-(4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)苯基)-3-(1-(4-硝基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)脲(Ⅰ₂₁)的制備

1-(4-硝基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7g)的制備

參照1a-7a的制備方法，將L-色氨酸與4-硝基苯甲醛經(jīng)過五步反應(yīng)，制備出化合物(7g)。MS(ESI)m/z:305[M+H]⁺.

1’-(4-硝基芐基)-1,4’-二哌啶(11e)

將4-硝基溴芐(4.30g,20mmol)溶于40ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(5.52g,40mmol)，KI(0.33g,2mmol)，然后向其中加入4-哌啶基哌啶(3.70g,22mmol)，5h后，反應(yīng)完全。將反應(yīng)液濃縮旋干，再向其中加入100ml H₂O，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，收集有機(jī)層，濃縮，得到5.58g固體，產(chǎn)率92％。

4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)苯胺(12e)

將11e(3.03g,10mmol)溶于甲醇溶劑中，加入300mg Pd/C，然后通入H₂反應(yīng)，6h后過濾，收集濾液，濃縮，得到2.46g固體，產(chǎn)率90％。

1-(4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)苯基)-3-(1-(4-硝基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)脲(Ⅰ₂₁)

將6g(0.36g,1mmol)溶于10ml無水甲苯中，并加入少量無水DMF助溶，然后向反應(yīng)瓶中加入12e(0.27g,1mmol)，130℃回流3-4h，反應(yīng)完全。濃縮，柱層析得到0.41g淡黃色固體，收率68％。MS(ESI)m/z:604[M+H]⁺.

實(shí)施例22 4-((4-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷-1-基)甲基)-N-(1-(4-硝基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₂₂)的制備

4-(氯甲基)-N-(1-(4-硝基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(9g)

將7g(0.61g,2mmol)溶于5ml無水二氯甲烷中，加入1.10ml三乙胺(0.81g,8mmol)，再將酰氯化的對(duì)氯甲基苯甲酸(0.38g,2mmol)溶于3ml無水二氯甲烷中，并在-5℃冰浴下緩緩滴加入7g中，0.5h后，反應(yīng)完畢。蒸除反應(yīng)液中的二氯甲烷溶劑，加入100mL水，乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有機(jī)層，清水洗(30mL×2)，飽和食鹽水(30mL)洗，干燥，過濾，濃縮得淡黃色固體0.86g，收率94％。4-((4-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷-1-基)甲基)-N-(1-(4-硝基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₂₂)

將9g(0.46g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入N-甲基高哌嗪(0.17g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.52g淡黃色固體，收率97％。MS(ESI)m/z:535[M+H]⁺.

實(shí)施例23 1-(3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-((4-羥基哌啶-1-基)甲基)苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(Ⅰ₂₃)的制備

1-(3,5-二甲氧基苯基)-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸(1h)

將L-色氨酸(10.20g,50mmol)溶解于80ml CH₃COOH溶液中，加入3,5-二甲氧基苯甲醛(9.13g,55mmol)，90℃下攪拌3h。反應(yīng)完畢，用2M的NaOH溶液將反應(yīng)液調(diào)至PH＝5-6，析出大量白色固體，抽濾，用水洗滌，真空干燥得到白色固體15.12g，產(chǎn)率86％。

1-(3,5-二甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸(2h)

將1h(17.60g,50mmol)溶于150ml DMF溶劑中，-5℃機(jī)械攪拌下，分批加入KMnO₄(11.05g,70mmol)，繼續(xù)攪拌1h后，抽濾，反應(yīng)液加入到200ml冷水中，析出沉淀，抽慮得淡棕色固體10.62g，收率61％。

1-(3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-((4-羥基哌啶-1-基)甲基)苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(Ⅰ₂₃)

將2h(0.35g,1mmol)溶于10mml無水二氯甲烷中，再向其中加入EDCI(0.38g,2mmol)和DMAP(0.06g,0.5mmol),然后向其中加入12d(0.18g,1mmol),10h后，反應(yīng)結(jié)束，濃縮，柱層析得到0.51g淡黃色固體，收率95％。MS(ESI)m/z:537[M+H]⁺.

實(shí)施例24 1-(4-((1,4-二氮環(huán)庚烷-1-基)甲基)苯基)-3-(1-(3,5二甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)脲(Ⅰ₂₄)的制備

1-(3,5-二甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7h)的制備

參照1a-7a的制備方法，將L-色氨酸與3,5-二甲氧基苯甲醛經(jīng)過五步反應(yīng)，制備出化合物1-(3,5-二甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7h)。MS(ESI)m/z:320[M+H]⁺.

1-(4-硝基芐基)-1,4-二氮環(huán)庚烷(11f)

將4-硝基溴芐(4.30g,20mmol)溶于40ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(5.52g,40mmol)，KI(0.33g,2mmol)，然后向其中加入高哌嗪(4.00g,40mmol)，5h后，反應(yīng)完全。將反應(yīng)液濃縮旋干，再向其中加入100ml H₂O，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，收集有機(jī)層，濃縮，得到4.37g固體，產(chǎn)率93％。

4-((1,4-二氮環(huán)庚烷-1-基)甲基)苯胺(12f)

將11f(2.35g,10mmol)溶于甲醇溶劑中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入200mg Pd/C，然后通入H₂反應(yīng)，6h后反應(yīng)完全。過濾，收集濾液，濃縮，得到1.87g固體。產(chǎn)率91％。

1-(4-((1,4-二氮環(huán)庚烷-1-基)甲基)苯基)-3-(1-(3,5二甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)脲(Ⅰ₂₄)

將6h(0.37g,1mmol)溶于10ml無水甲苯中，并加入少量無水DMF助溶，然后向反應(yīng)瓶中加入12f(0.21g,1mmol)，130℃回流3-4h，反應(yīng)完全。濃縮，柱層析得到0.36g淡黃色固體，收率65％。MS(ESI)m/z:551[M+H]⁺.

實(shí)施例25N-(1-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)苯基)-1-(4-氟苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(Ⅰ₂₅)的制備

1-(4-氟苯基)-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸(1i)

將L-色氨酸(10.20g,50mmol)溶解于80ml CH₃COOH溶液中，加入5.88ml4-氟苯甲醛(55mmol)，90℃下攪拌3h。反應(yīng)完畢，用2M的NaOH溶液將反應(yīng)液調(diào)至PH＝5-6，析出大量白色固體，抽濾，用水洗滌，真空干燥得到白色固體12.72g，產(chǎn)率82％。

1-(4-氟苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸(2i)

將1i(15.50g,50mmol)溶于150ml DMF溶劑中，-5℃機(jī)械攪拌下，分批加入KMnO₄(11.05g,70mmol)，繼續(xù)攪拌1h后，抽濾，反應(yīng)液加入到200ml冷水中，析出沉淀，抽慮得淡棕色固體9.95g，收率65％。

N-(1-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)苯基)-1-(4-氟苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺

將2i(0.31g,1mmol)溶于10mml無水二氯甲烷中，再向其中加入EDCI(0.38g,2mmol)和DMAP(0.06g,0.5mmol),然后向其中加入12e(0.27g,1mmol),10h后，反應(yīng)結(jié)束，濃縮，柱層析得到0.53g淡黃色固體，收率94％。MS(ESI)m/z:562[M+H]⁺.

實(shí)施例26N-(1-(4-溴苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-4-((4-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷-1-基)甲基)苯甲酰胺(Ⅰ₂₆)的制備

1-(4-溴苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7j)的制備

參照1a-7a的制備方法，將L-色氨酸與4-溴苯甲醛經(jīng)過五步反應(yīng)，制備出化合物1-(4-溴苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7j)。MS(ESI)m/z:338[M+H]⁺.N-(1-(4-溴苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-4-(氯甲基)苯甲酰胺(9j)

將7j(0.67g,2mmol)溶于5ml無水二氯甲烷中，加入1.10ml三乙胺(0.81g,8mmol)，再將酰氯化的對(duì)氯甲基苯甲酸(0.38g,2mmol)溶于3ml無水二氯甲烷中，并在-5℃冰浴下緩緩滴加入7j中，0.5h后，反應(yīng)完畢。蒸除反應(yīng)液中的二氯甲烷溶劑，加入100mL水，乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有機(jī)層，清水洗(30mL×2)，飽和食鹽水(30mL)洗，干燥，過濾，濃縮得淡黃色固體0.93g，收率95％。N-(1-(4-溴苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)-4-((4-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷-1-基)甲基)苯甲酰胺(Ⅰ₂₆)

將9j(0.49g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入N-甲基高哌嗪(0.17g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.54g淡黃色固體，收率95％。MS(ESI)m/z:568[M+H]⁺.

實(shí)施例27 4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)-N-(9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₂₇)的制備

9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7k)的制備

參照1a-7a的制備方法，將L-色氨酸與甲醛經(jīng)過五步反應(yīng)，制備出化合物9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(7k)。MS(ESI)m/z:184[M+H]⁺.

4-(氯甲基)-N-(9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(9k)

將7k(0.37g,2mmol)溶于5ml無水二氯甲烷中，加入1.10ml三乙胺，再將酰氯化的對(duì)氯甲基苯甲酸(0.38g,2mmol)溶于3ml無水二氯甲烷中，并在-5℃冰浴下緩緩滴加入7k中，0.5h后，反應(yīng)完畢。蒸除反應(yīng)液中的二氯甲烷溶劑，加入100mL水，乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有機(jī)層，清水洗(30mL×2)，飽和食鹽水(30mL)洗，干燥，過濾，濃縮得淡黃色固體0.54g，收率86％。

4-([1,4’-二哌啶基]-1’-亞甲基)-N-(9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)苯甲酰胺(Ⅰ₂₇)

將9k(0.34g,1mmol)溶于8ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(0.28g,2mmol),KI(0.02g,0.1mmol)，然后向其中加入4-哌啶基哌啶(0.25g,1.5mmol)，10h后，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到0.45g淡黃色固體，收率96％。MS(ESI)m/z:468[M+H]⁺.

實(shí)施例28N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(Ⅰ₂₈)的制備

2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸(1k)

將L-色氨酸(10.2g,50mmol)溶解于20ml 2.5N的H₂SO₄溶液中，加入13.8ml甲醛溶液(115mmol)，60℃下攪拌2h。反應(yīng)完畢，用2N的HCl將反應(yīng)液調(diào)至PH＝5，析出大量白色固體，用水洗滌，真空干燥得到白色固體9.8g，產(chǎn)率85％。9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸(2k)

將1k(10.80g,50mmol)溶于150ml DMF溶劑中，-5℃機(jī)械攪拌下，分批加入KMnO₄(11.05g,70mmol)，繼續(xù)攪拌1h后，抽濾，反應(yīng)液加入到200ml冷水中，析出沉淀，抽慮得淡棕色固體7.21g，收率68％。

1-甲基-4-(4-硝基芐基)哌嗪(11g)

將4-硝基溴芐(4.30g,20mmol)溶于40ml乙腈溶劑中，再加入K₂CO₃(5.52g,40mmol)，KI(0.33g,2mmol)，然后向其中加入4-甲基哌嗪(2.20g,22mmol)，5h后，反應(yīng)完全。將反應(yīng)液濃縮旋干，再向其中加入100ml H₂O，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，收集有機(jī)層，濃縮，得到4.32g固體，產(chǎn)率92％。

4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯胺(12g)

將11g(2.35g,10mmol)溶于甲醇溶劑中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入200mg Pd/C，然后通入H₂反應(yīng)，6h后反應(yīng)完全。過濾，收集濾液，濃縮，得到1.89g固體。產(chǎn)率92％。

N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(Ⅰ₂₈)

將2k(0.21g,1mmol)溶于10mml無水二氯甲烷中，再向其中加入EDCI(0.38g,2mmol)和DMAP(0.06g,0.5mmol),然后向其中加入12g(0.21g,1mmol),10h后，反應(yīng)結(jié)束，濃縮，柱層析得到0.37g淡黃色固體，收率94％。MS(ESI)m/z:386[M+H]⁺.

實(shí)施例29四甲基氮唑藍(lán)比色法(MTT)體外抗腫瘤試驗(yàn)

采用MTT評(píng)價(jià)了本發(fā)明化合物對(duì)3種人癌細(xì)胞株的抗增殖活性。MTT法已廣泛用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。選擇吉西他濱(Gem)作為陽性對(duì)照藥。

人普通癌細(xì)胞株：人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、人肝癌細(xì)胞HepG2、人肺癌細(xì)胞H1299、人乳腺癌細(xì)胞Mcf-7、人子宮癌細(xì)胞Hela。人耐藥腫瘤細(xì)胞株：人耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8/5-FU、人耐藥肝癌細(xì)胞Bel-7402/FU。

實(shí)驗(yàn)方法如下：取處于指數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化，使貼壁細(xì)胞脫落，制成每毫升含2×10⁴～4×10⁴個(gè)細(xì)胞的懸液。取細(xì)胞懸液接種于96孔板上，每孔100μL，置恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。換液，加入受試化合物Ⅰ₁-Ⅰ₂₈(化合物用DMSO溶解后用完全培養(yǎng)基稀釋，受試化合物濃度分別為(12.5×10^-6mol/L)，每孔100μL，培養(yǎng)72小時(shí)。將MTT加入96孔板中，每孔10μL，培養(yǎng)箱中反應(yīng)4小時(shí)。吸去上清液，加入DMSO，每孔100μL，平板搖床上振搖5min。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)為570nm處測(cè)定每孔的吸收度，計(jì)算細(xì)胞抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和2所示。

細(xì)胞抑制率＝(陰性對(duì)照組OD值–受試物組OD值)/陰性對(duì)照組OD值×100％。

實(shí)施例30Western blot檢測(cè)β-咔啉衍生物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的細(xì)胞周期蛋白CDK1、Cyclin B和DNA損傷標(biāo)志H2AX(S139ph)蛋白表達(dá)的影響

a.細(xì)胞處理：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為10⁶/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔1.0ml，加入不同濃度受試藥物I₈、I₁₂、I₂₂，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

b.總蛋白提取及蛋白濃度測(cè)定：加入細(xì)胞蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑提取總蛋白。以上均于冰浴中進(jìn)行。4℃離心12000g，15min，吸出上清(細(xì)胞裂解液)。

c.BCA法測(cè)定總蛋白濃度。

d.SDS-PAGE和Western blot分析：分別使用CDK1、Cyclin B和H2AX(S139ph)一抗和二抗。

e.進(jìn)行灰度掃描，PDQuest7.2.0軟件分析結(jié)果。以β-actin作為內(nèi)參，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。