本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗菌肽、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗菌肽是生物防御系統(tǒng)中所產(chǎn)生的對(duì)抗外源病原體的肽類物質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中，是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。迄今為止，已有數(shù)千種抗菌肽得到分離和鑒定?？咕膶?duì)細(xì)菌、真菌、寄生蟲、病毒、腫瘤細(xì)胞等有著廣泛的抑制作用。近年來(lái)，抗生素的濫用引發(fā)了一系列安全問(wèn)題，如病原菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，種類不斷增加，進(jìn)而嚴(yán)重威脅人類健康?？咕淖鳛橐环N安全環(huán)保的抗生素替代品，在醫(yī)藥行業(yè)、飼料和食品添加劑等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前已報(bào)道的抗菌肽中，有幾種來(lái)自于唾液乳桿菌的抗菌肽類物質(zhì)被證實(shí)具有高效廣譜的抑菌活性和良好的開發(fā)潛力，其中部分唾液乳桿菌天然存在于動(dòng)物的消化道中。

現(xiàn)有技術(shù)中已報(bào)道的研究比較成熟的抗菌肽ABP-118，由唾液乳桿菌L.salivarius UCC118產(chǎn)生，由兩條多肽所組成，包括ABP-118α(4096Da)和ABP-118β(4332Da)，分別由abp118α和abp118β基因編碼，另外由abpIM基因所編碼的免疫蛋白可免疫該抗菌肽對(duì)產(chǎn)生菌自身的抑制作用。該機(jī)制普遍存在于可產(chǎn)生該抗菌肽的唾液乳桿菌中。組成該抗菌肽的兩種多肽均為小分子肽，具有較高的熱穩(wěn)定性，且對(duì)很多革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌及真菌均具有較好的抑菌活性，因而具有較好的應(yīng)用前景。有些該類抗菌肽的兩條多肽分開時(shí)不具有抑菌活性或活性較弱，只有在兩者混合在一起時(shí)才會(huì)有很好的抑菌效果。

為了進(jìn)一步開發(fā)利用抗菌肽，找到更多的抗菌肽進(jìn)行研究可以為后期的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足及實(shí)際的需求，本發(fā)明提供一種抗菌肽、其制備方法及應(yīng)用，所述抗菌肽，所述抗菌肽具有較強(qiáng)的抑制耐藥性金黃色葡萄球菌的活性。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種抗菌肽，所述抗菌肽包含如SEQ ID NO.1-2所示的氨基酸序列。

本發(fā)明中，所述抗菌肽命名為salivaricin SJH-8，簡(jiǎn)稱SJH-8，包括SJH-8α和SJH-8β兩條肽鏈。

所述SEQ ID NO.1(SJH-8α)所示的氨基酸序列如下：Lys Arg Gly Pro Asn Cys Val Gly Asn Phe Leu Gly Gly Leu Phe Ala Gly Ala Ala Ala Gly Val Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ile Val Gly Gly Ala Asn Leu Gly Met Val Gly Gly Ala Leu Thr Cys Leu；

所述SEQ ID NO.2(SJH-8β)所示的氨基酸序列如下：Lys Asn Gly Tyr Gly Gly Ser Gly Asn Arg Trp Val His Cys Gly Ala Gly Ile Val Gly Gly Ala Leu Ile Gly Ala Ile Gly Gly Pro Trp Ser Ala Val Ala Gly Gly Val Ser Gly Gly Phe Thr Ser Cys Arg。

優(yōu)選地，所述抗菌肽包含如SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列；

所述SEQ ID NO.3(SJH-8α)所示的核苷酸序列如下：AAACG TGGAC CTAAC TGTGT AGGTA ACTTC TTAGG TGGTC TATTT GCTGG AGCAG CTGCA GGAGT TCCAC TTGGA CCAGC TGGTA TCGTA GGTGG GGCAA ACTTA GGAAT GGTAG GCGGA GCGCT TACTT GTTTA TAA；

所述SEQ ID NO.4(SJH-8β)所示的核苷酸序列如下：AAAAA TGGTT ATGGT GGTAG TGGAA ATCGC TGGGT TCACT GTGGA GCTGG CATCG TAGGT GGAGC TTTAA TTGGA GCTAT CGGTG GACCC TGGTC AGCCG TAGCG GGTGG AGTTT CTGGT GGTTT TACAA GTTGC CGTTA A。

優(yōu)選地，所述抗菌肽包含的氨基酸序列的分子量為α鏈(SEQ ID NO.1)：4074；β鏈(SEQ ID NO.2)：4297。

優(yōu)選地，所述抗菌肽來(lái)自于三黃雞回腸菌群。

第二方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有至少一個(gè)拷貝的如第一方面所述的核苷酸序列。

第三方面，本發(fā)明提供一種重組的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有如第二方面所述的表達(dá)載體。

優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或乳酸乳球菌中的任意一種，優(yōu)選為乳酸乳球菌。

本發(fā)明中，所述宿主為大腸桿菌或枯草芽孢桿菌時(shí)，除抗菌肽自身(SJH-8α、SJH-8β)以外，應(yīng)連同其攜帶的前導(dǎo)肽序列(SJH-8α的信號(hào)肽序列：MET MET Lys Glu Phe Thr Val Leu Thr Glu Cys Glu Leu Ala Lys Val Asp Gly Gly；SJH-8β的信號(hào)肽序列：MET Lys Asn Leu Asp Lys Arg Phe Thr Ile MET Thr Glu Asp Asn Leu Ala Ser Val Asn Gly Gly)和免疫蛋白SJH-8m一起轉(zhuǎn)入宿主中表達(dá)；而宿主選用乳酸乳球菌時(shí)，用其特有的usp45信號(hào)肽替代原前導(dǎo)肽，同時(shí)表達(dá)免疫蛋白SJH-8m。

第四方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的抗菌肽的制備方法，包括如下步驟：

(1)提取三黃雞回腸菌群宏基因組；

(2)根據(jù)抗菌肽ABP-118設(shè)計(jì)引物，以提取的三黃雞回腸菌群宏基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增；

(3)將步驟(2)擴(kuò)增出的片段的前導(dǎo)肽替換為宿主的分泌表達(dá)信號(hào)肽，再進(jìn)行全合成整個(gè)片段，得到完整的分泌表達(dá)抗菌肽；

(4)構(gòu)建分泌表達(dá)抗菌肽重組質(zhì)粒，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，得到表達(dá)抗菌肽的表達(dá)工程菌。

優(yōu)選地，步驟(1)所述引物為SEQ ID NO.5-6所示的序列；

上游引物如SEQ ID NO.5所示，下游引物如SEQ ID NO.6所示：

上游引物(118αF)：5'-ATGATGAAGGAATTTACAGTATTGA-3'，(SEQ ID NO.5)；

下游引物(118imR)：5'-CTATAGCCACCACATAAAATTTAAC-3'，(SEQ ID NO.6)。

優(yōu)選地，步驟(4)所述構(gòu)建分泌表達(dá)抗菌肽重組質(zhì)粒為將得到的分泌表達(dá)抗菌肽連接到pNZ8148質(zhì)粒的BtgI和HindⅢ克隆位點(diǎn)。

第五方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的抗菌肽、如第二方面所述的表達(dá)載體、如第三方面所述的宿主細(xì)胞在制備動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。

第六方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的抗菌肽、如第二方面所述的表達(dá)載體、如第三方面所述的宿主細(xì)胞在制備治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述的藥物可以治療包括但不限于由金黃色葡萄球菌引起的感染。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明制備的抗菌肽SJH-8，具有高效廣譜抑菌作用，具有較強(qiáng)的抑制耐藥菌的能力，尤其針對(duì)金黃色葡萄球菌有很好的抑制作用；

(2)本發(fā)明制備的抗菌肽SJH-8毒性低，可作為抗生素替代品使用；

(3)本發(fā)明制備的抗菌肽SJH-8為進(jìn)一步開發(fā)利用抗菌肽奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明抗菌肽相關(guān)基因的PCR產(chǎn)物；

圖2是本發(fā)明重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；

圖3是本發(fā)明NZ9000重組子的平板單菌落圖；

圖4是本發(fā)明工程菌發(fā)酵液抑菌效果圖。

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。

實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過(guò)正規(guī)渠道商購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

三黃雞購(gòu)自廣州南沙菜市場(chǎng)；

乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.Cremoris)NZ9000、配套質(zhì)粒pNZ8148(氯霉素抗性)購(gòu)于上海北諾生物科技有限公司；

大腸桿菌MG1655為本實(shí)驗(yàn)室保存；

引物由上海生工生物工程有限公司合成；

主要試劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；

質(zhì)粒提取和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根公司；

酶制劑購(gòu)自TaKaRa公司。

主要試劑的配制：

(1)乳酸乳球菌GM17培養(yǎng)基

大豆胨5.0g，蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，牛肉浸粉5.0g，抗壞血酸鈉0.5g，β-甘油磷酸鈉19.0g，硫酸鎂0.25g，加ddH2O至900ml，121℃高壓蒸汽滅菌15min。待滅菌冷卻后分別加入50ml用0.22μm濾膜過(guò)濾后的5％葡萄糖、5％乳糖溶液。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入瓊脂粉含量為2％。

(2)LB培養(yǎng)基

胰化蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl 10g，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解，用5mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至1L，在121℃、0.1Mpa下滅菌20min。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入瓊脂粉含量為2％。

(3)乳酸乳球菌感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)用G-SGM17培養(yǎng)基

大豆胨5.0g，蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，牛肉浸粉5.0g，抗壞血酸鈉0.5g，β-甘油磷酸鈉19.0g，硫酸鎂0.25g，蔗糖171.1g，甘氨酸25g，加ddH2O至900ml，121℃高壓蒸汽滅菌20min。待滅菌冷卻后分別加入50ml用0.22um濾膜過(guò)濾后的5％葡萄糖、5％乳糖溶液。

(4)MRS培養(yǎng)基

蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸二胺2.0g、吐溫-80 1.0ml、磷酸氫二鉀0.4g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.29g、碳酸鈣20.0g、瓊脂15.0g，蒸餾水溶解并定容到1000ml，pH調(diào)至6.2–6.6，攪拌后加熱，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下滅菌20min。

(5)氯霉素溶液

稱取氯霉素溶解于無(wú)水乙醇中，0.22μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾除菌，1.5ml離心管分裝，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?chǔ)存濃度為35mg/ml，工作濃度為10μg/ml。

(6)大腸桿菌電轉(zhuǎn)孵化液用SOC培養(yǎng)基

配方如下：2％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，0.05％(W/V)氯化鈉，2.5mM氯化鉀，10mM氯化鎂，20mM葡萄糖溶液(0.22μm過(guò)濾器除菌，培養(yǎng)基滅菌后加入)。121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

(7)50×TAE(Tris-乙酸)電泳緩沖液

Tris堿242g，EDTA 18.622g，加入800ml ddH2O，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹尤?7.1ml醋酸，充分混勻，再加ddH2O定容至1L，室溫保存。使用前稀釋為1×TAE電泳緩沖液。

實(shí)施例1 提取三黃雞回腸的腸道菌群基因組

提取三黃雞回腸的腸道菌群基因組，包括如下步驟：

(1)將剪刀、鑷子用75％酒精消毒；

(2)取三黃雞腸道，剪碎，加入5mL PBS，轉(zhuǎn)移至15mL離心管，用振蕩器混勻；

(3)4000×g室溫離心10min；

(4)將上清轉(zhuǎn)移至2mL EP管，12000rpm離心5min，棄上清，加入200μL溶菌酶溶液(20mg/mL)，37℃放置1h；

(5)將溶菌酶處理過(guò)的樣品用Ezup柱式土壤DNA抽提試劑盒(生工Sangon Biotech)提取基因組。

實(shí)施例2 制備抗菌肽重組載體

(1)根據(jù)抗菌肽ABP-118基因序列設(shè)計(jì)引物：

上游引物(118αF)：5'-ATGATGAAGGAATTTACAGTATTGA-3'，(SEQ ID NO.5)；

下游引物(118imR)：5'-CTATAGCCACCACATAAAATTTAAC-3'，(SEQ ID NO.6)。

(2)PCR擴(kuò)增：以實(shí)施例1提取的三黃雞回腸的腸道菌群基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：

設(shè)置一組以水為樣本的陰性對(duì)照。

反應(yīng)條件如下：

所獲得PCR產(chǎn)物核酸進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示，可見(jiàn)條帶正確。

驗(yàn)證后用天根公司的膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收。

(3)全合成：

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)原序列進(jìn)行重新設(shè)計(jì)。

新序列包括α鏈、β鏈和免疫蛋白M。對(duì)α鏈和β鏈上的前導(dǎo)肽用乳酸乳球菌特有的分泌表達(dá)信號(hào)肽Usp45進(jìn)行替換，并在序列5’端加上BtgI酶切位點(diǎn)，在3’端加上HindIII酶切位點(diǎn)。全長(zhǎng)序列命名為SJH8αβM，如圖2所示，由上海生工生物工程有限公司合成；

(4)構(gòu)建重組質(zhì)粒：

酶切連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，反應(yīng)體系如下：

37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3h，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠純化回收，將酶切后的載體與基因進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下：

輕輕混勻組分，置于16℃水浴鍋反應(yīng)2h，得到重組載體pNZ8148-SJH8αβM。

實(shí)施例3 構(gòu)建抗菌肽宿主細(xì)胞

(1)將實(shí)施例2制備的重組載體轉(zhuǎn)化MG1655感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，涂氯霉素抗性LB平板，挑選陽(yáng)性克隆；

大腸桿菌MG1655感受態(tài)細(xì)胞的制備：

①50μL菌液接種到5mL LB培養(yǎng)液中，37℃，200-250rpm過(guò)夜培養(yǎng)；

②5mL培養(yǎng)基稀釋到800ml LB培養(yǎng)液中，37℃，200-250rpm培養(yǎng)，直到OD₆₀₀到0.4-0.6；

③菌液在冰上預(yù)冷30min；

④5000×g，4℃離心15min，棄上清；

⑤用滅菌的冰水重懸細(xì)胞，先用移液器重懸浮細(xì)胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水注滿離心管，5000×g，4℃離心15min，棄上清；

⑥重復(fù)上述步驟一次；

⑦用滅菌的冰冷的10％甘油重懸細(xì)胞，先用移液器重懸浮細(xì)胞于少量體積中(幾毫升)，然后加10％甘油注滿離心管，5000×g，4℃離心15min，棄上清；

⑧用滅菌的冰冷的10％甘油重懸細(xì)胞至終體積為2-3mL；

⑨分裝100μL一管于1.5mL離心管里，-80℃保存，待用于轉(zhuǎn)化。

(2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化NZ9000感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆；

乳酸乳球菌乳脂亞種NZ9000感受態(tài)細(xì)胞的制備：

Solution I的配制：蔗糖171.1g，甘油100ml，加ddH2O至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

Solution II的配制：蔗糖171.1g，甘油100ml，EDTA 18.612g，加ddH2O至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

Solution III的配制：G-M17培養(yǎng)液+20mM MgCl2+2mM CaCl2。

①50μL NZ9000菌液接種到5mL G-SGM17培養(yǎng)液中(擰緊15mL離心管管口)，30℃過(guò)夜培養(yǎng)；

②5mL菌液稀釋到50mL G-SGM17培養(yǎng)液中(用封口膜封住錐形瓶瓶口)，30℃過(guò)夜培養(yǎng)；

③50mL菌液稀釋到400mL G-SGM17培養(yǎng)液中(用封口膜封住錐形瓶瓶口)，30℃培養(yǎng)，直到OD₆₀₀在0.2-0.3之間(約3h)；

④6000×g，4℃離心20min,棄去上清；

⑤用400mL Solution I(4℃)洗滌細(xì)胞，6000×g離心，棄去上清；

⑥用200mL Solution II(4℃)重懸細(xì)胞，冰浴15min，6000×g離心，棄去上清；

⑦用100mL Solution I(4℃)洗滌細(xì)胞，6000×g離心，棄去上清；

⑧用4mL Solution I(4℃)重懸細(xì)胞；

⑨分裝40μL一管到1.5mL離心管中，-80℃保存，使用前在冰上解凍。

(3)抗菌肽的表達(dá)

(1)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pNZ8148-SJH8αβM轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌乳脂亞種NZ9000感受態(tài)細(xì)胞，在GM17平板上培養(yǎng)；

(2)挑取轉(zhuǎn)化子到5mL GM17液體培養(yǎng)基(含氯霉素10μg/mL)中，30℃過(guò)夜培養(yǎng)；

(3)取0.8mL菌液到10mL新鮮GM17培養(yǎng)液(含氯霉素10μg/mL)中，至OD₆₀₀達(dá)0.4左右；

(4)加入終濃度為10ng/mL的Nisin誘導(dǎo)，12h后檢測(cè)抗菌肽活性。

實(shí)施例4 構(gòu)建抗菌肽宿主細(xì)胞

(1)所述重組質(zhì)粒也可以通過(guò)電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655感受態(tài)細(xì)胞，其大腸桿菌MG1655感受態(tài)細(xì)胞的制備方法如下：

①?gòu)?80℃冰箱取出MG1655感受態(tài)細(xì)胞100μL，放在冰上解凍5min；待感受態(tài)細(xì)胞解凍后，與10μL連接產(chǎn)物混合加入已預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5min；

②在電擊儀上調(diào)好電轉(zhuǎn)條件：2kV，將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)槽，按下電擊儀Pulse按鈕進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；

③電轉(zhuǎn)化后立即加入1mL SOC培養(yǎng)基(4℃)，冰浴5min；

④將電轉(zhuǎn)杯中菌液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，37℃、250rpm復(fù)蘇40min；

⑤離心管離心后倒掉上清，加入200μL含氯霉素抗性的LB培養(yǎng)液，吸取200μL培養(yǎng)液加到LB篩選平板(含氯霉素10μg/mL)，用玻璃涂布器把菌液涂布于整個(gè)平板的表面，37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)(12-16h)。

(2)所述重組質(zhì)粒也可以通過(guò)電轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌乳脂亞種NZ9000感受態(tài)細(xì)胞，其乳酸乳球菌乳脂亞種NZ9000感受態(tài)細(xì)胞的制備方法如下：

Solution I的配制：蔗糖171.1g，甘油100ml，加ddH2O至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

Solution II的配制：蔗糖171.1g，甘油100ml，EDTA 18.612g，加ddH2O至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

Solution III的配制：G-M17培養(yǎng)液+20mM MgCl2+2mM CaCl2。

①?gòu)?80℃冰箱取出NZ9000感受態(tài)細(xì)胞40μL，放在冰上解凍5min；

②待感受態(tài)細(xì)胞解凍后，與10μL連接產(chǎn)物混合加入已預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5min(陽(yáng)性對(duì)照組：40μL感受態(tài)細(xì)胞+4μL空載pNZ8148)；

③在電擊儀上調(diào)好電轉(zhuǎn)條件：2kV，將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)槽，按下電擊儀Pulse按鈕進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；

④電轉(zhuǎn)化后立即加入1mL Solution III(4℃)，冰浴5min，然后在30℃孵育1.5h；

⑤離心管離心后倒掉上清，加入100μL含氯霉素抗性的GM17培養(yǎng)液，用移液器充分吸吹后吸取100μL培養(yǎng)液加到GM17篩選平板(含氯霉素10μg/mL)，用玻璃涂布器把菌液涂布于整個(gè)平板的表面，用封口膜將平板密封，30℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)。

培養(yǎng)結(jié)果如圖3所示，30℃培養(yǎng)后出現(xiàn)的單菌落圖，從中篩選出陽(yáng)性克隆。

(3)抗菌肽的表達(dá)

(1)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pNZ8148-SJH8αβM轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌乳脂亞種NZ9000感受態(tài)細(xì)胞，在GM17平板上培養(yǎng)；

(2)挑取轉(zhuǎn)化子到5mL GM17液體培養(yǎng)基(含氯霉素10μg/mL)中，30℃過(guò)夜培養(yǎng)；

(3)取0.8mL菌液到10mL新鮮GM17培養(yǎng)液(含氯霉素10μg/mL)中，至OD₆₀₀達(dá)0.4左右；

(4)加入終濃度為10ng/mL的Nisin誘導(dǎo)，12h后檢測(cè)抗菌肽活性。

實(shí)施例5 抗菌肽活性的檢測(cè)

(1)將兩種菌發(fā)酵液于4℃ 6000g離心15min，將獲得的上清液進(jìn)行0.22μm過(guò)濾獲得誘導(dǎo)后的無(wú)菌上清液；

(2)以金黃色葡萄球菌為指示菌(～10⁶CFU/mL)，用濾紙片法做抑菌實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品點(diǎn)10μL，做四個(gè)重復(fù)。

(3)于37℃培養(yǎng)12h后，導(dǎo)入SJH8αβM基因的重組乳酸乳球菌乳脂亞種NZ9000(實(shí)驗(yàn)組)上清液樣品可見(jiàn)明顯的抑菌圈，結(jié)果如圖4所示。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。