本發(fā)明涉及植物超氧化物歧化酶的提取領(lǐng)域，具體的說是涉及一種植物超氧化物歧化酶提取的新方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是一種酸性的金屬酶，在生物體內(nèi)能夠催化自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，并且能夠消除機體內(nèi)超氧陰離子自由基(O2-)保護(hù)機體的細(xì)胞過快衰老。到目前為止，人們已經(jīng)從包括細(xì)菌、真菌、藻類、植物和動物等多種生物體內(nèi)分離出SOD。自上世紀(jì)三十年代首次從牛的紅血球中分離得到SOD，人們曾一直致力于從動物肝臟和血液中提取并分離SOD，并已取得了顯著的成果，在醫(yī)學(xué)等眾多方面都有應(yīng)用。但是由于動物血液中提取得到的SOD容易被病毒感染，且動物的飼養(yǎng)過程中易受到飼料、疾病等的因素影響。
植物中的SOD多屬植物天然蛋白，不僅可以避免發(fā)生病毒交叉感染，而且不含有對人體有害的物質(zhì)。含有SOD的植物的來源廣泛，一般價格都比較低廉，目前大多研究是從大蒜、玉米、番茄、獼猴桃等日常蔬菜、瓜果中提取SOD。天然的超氧化物歧化酶存在穩(wěn)定性差、活性易損失等問題，而目前研究報道的植物SOD提取工藝中，大多是利用熱變性原理，這一處理會使酶蛋白分子發(fā)生亞基的解聚、變性或其他方面的構(gòu)象變化，導(dǎo)致酶活性的下降或喪失，產(chǎn)品穩(wěn)定性差、活性難保存；而且生產(chǎn)過程中需要使用大量的有機溶劑，提取程序復(fù)雜，使得產(chǎn)品的成本較高，生產(chǎn)周期較長，產(chǎn)率不高，因此，植物SOD的生產(chǎn)還只停留在實驗室階段，尚未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本專利提供了一種植物超氧化物歧化酶提取的新方法。通過樣品預(yù)處理、粗酶液的制備、脫色和激活、有機溶劑除雜、丙酮沉淀SOD和冷凍干燥等處理過程。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案：一種植物超氧化物歧化酶提取的新方法，其特征在于按下述步驟操作：
稱取一定質(zhì)量的植物鮮果或鮮葉，加入生理鹽水冷凍后用打漿機打漿，加入保護(hù)劑和溶膜劑置于冰箱中一定時間，冷凍離心，上清液即為原材料的預(yù)處理酶液，預(yù)處理的酶液先過截留分子量為10萬 Dal后過1萬 Dal的膜，所得濃縮液加入適量激活劑、木質(zhì)活性炭和活性白土脫色離心后，置于冰箱冷凍一定時間，加入混合有機溶劑進(jìn)行除雜，經(jīng)丙酮沉淀后獲得活性在1300~1800 U/mg的超氧化物歧化酶產(chǎn)品。
所述植物鮮果或鮮葉原料預(yù)處理酶液的制備具體步驟如下：將鮮果或鮮葉洗干凈，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的原料，加入1.5~2倍體積的生理鹽水、0.1倍的聚乙二醇保護(hù)劑和0.05倍的曲拉通溶膜劑，冷凍至有冰晶，然后用打漿機打漿，放入冰箱中1小時，冷凍離心，所得上清液即為預(yù)處理酶液。
所述膜過濾的具體操作步驟如下：將預(yù)處理酶液先用截留分子量為10萬的膜過濾，透過液再經(jīng)截留分子量為1萬的膜過濾，濃縮至1/5時得到超氧化物歧化酶粗提液。
所述加入適量激活劑、木質(zhì)活性炭和活性白土脫色的具體操作步驟如下：每100 mL超氧化物歧化酶粗提液中加入2.5 g木質(zhì)活性炭、1.25 g活性白土和適量激活劑，置于120 rpm/min的搖床上進(jìn)行搖蕩脫色。
所述除雜處理的具體操作步驟如下：將權(quán)利要求4所述脫色后的粗提液離心，加入粗提液體積1/3倍的混合有機溶劑，混合有機溶劑由乙醇：氯仿質(zhì)量比為5:3混合而成，充分混勻，冷凍離心，將清液和氯仿分離，向得到的清液中加入其總體積0.6倍的丙酮，冷凍離心，除去雜蛋白。
所述丙酮沉淀的具體操作步驟如下：將權(quán)利要求5所述上清液放在冰箱中冷凍，然后加入其1.2倍體積的冷丙酮溶液，離心后將其沉淀在冷凍干燥器中冷凍干燥，得粉末狀超氧化物歧化酶產(chǎn)品。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
（1）加入保護(hù)劑、溶膜劑和激活劑，可延長SOD的半衰期、破膜及使SOD酶蛋白處于活性狀態(tài)。
（2）采用膜過濾濃縮法獲得SOD粗品，首先用10萬膜過濾，去除了多糖和大分子量的蛋白質(zhì)，為后續(xù)除雜減輕了壓力。后經(jīng)1萬膜過濾，去除了單糖、小分子的有機酸和維生素C，有效避免了維生素C對微量連苯三酚測定SOD活性時的影響，同時SOD酶液大大濃縮，降低了溶劑的使用量，有效節(jié)約了經(jīng)濟(jì)成本。
（3）加入活性白土和木質(zhì)活性炭，以除去色素，有助于SOD活性的提高。
(4) 該工藝去除了超氧化物歧化酶傳統(tǒng)工藝中的熱變處理過程。
附圖說明
圖1 本發(fā)明工藝流程示意圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但它并不是對本發(fā)明的限定。
實施例1：
從神州草中提取超氧化物歧化酶，具體按下述步驟操作：
1、準(zhǔn)確稱取1000 g神州草，放入小桶中，然后加入2000 mL生理鹽水，100 mL保護(hù)劑（千分之3濃度的聚乙二醇）和10 mL溶膜劑（曲拉通），用打漿機打漿，放入冰箱中冷凍至有冰晶。
2、將含有冰晶的神州草漿進(jìn)行冷凍離心，將上清液約2100 mL放入冰箱中冷凍1小時后，先過截留分子量為十萬的膜過濾設(shè)備，透過液進(jìn)入截留分子量為一萬的膜過濾設(shè)備，濃縮至200 mL用于SOD的提取。
3、神州草濃縮液200 mL中加入5g木質(zhì)活性炭和2.5g活性白土放入三角瓶中，同時加入0.2 mL激活劑（飽和氯化銅溶液）放在120 rpm/min的搖床上振蕩1小時進(jìn)行脫色。
4、將激活脫色后的漿液離心，約180 mL清液加入混合有機溶劑55 mL（乙醇：氯仿=5:3），充分混勻，冷凍1小時，離心，將清液和氯仿相分離。
5、向清液235 mL中加入150 mL的丙酮，冷凍1小時，離心，除去雜蛋白。
6、將上清液放在冰箱中冷凍20 min，然后再加入130 mL丙酮溶液，充分搖勻后冷凍1小時。
7、離心后將其沉淀在冷凍干燥器中冷凍干燥得約0.12克SOD產(chǎn)品，檢測其活性為1380 U/mg。
實施例2：
從野生獼猴桃中提取超氧化物歧化酶，具體按下述步驟操作：
1、準(zhǔn)確稱取1000 g野生獼猴桃果，放入小桶中，然后加入2000mL生理鹽水，100 mL保護(hù)劑（千分之3濃度的聚乙二醇）和10 mL溶膜劑（曲拉通），用打漿機打漿，冷凍至有冰晶。放入冰箱中一小時。
2、將含有冰晶的野生獼猴桃果漿進(jìn)行冷凍離心，將上清液約2600 mL放入冰箱中冷凍1小時后，先過截留分子量為十萬的膜過濾設(shè)備，透過液進(jìn)入截留分子量為一萬的膜過濾設(shè)備，濃縮至200 mL用于SOD的提取。
3、野生獼猴桃果濃縮液200 mL中加入5g木質(zhì)活性炭和2.5g活性白土放入三角瓶中，同時加入0.2 mL激活劑（飽和氯化銅溶液）放在120 rpm/min的搖床上振蕩1小時進(jìn)行脫色。
4、將激活脫色后的漿液離心，約180 mL清液加入混合有機溶劑55 mL（乙醇：氯仿=5:3），充分混勻，冷凍1小時，離心，將清液和氯仿相分離。
5、向清液235 mL中加入150 mL的丙酮，冷凍1小時，離心，除去雜蛋白。
6、將上清液放在冰箱中冷凍20 min，然后再加入130 mL丙酮溶液，充分搖勻后冷凍1小時。
7、離心后將其沉淀在冷凍干燥器中冷凍干燥得約0.25克SOD產(chǎn)品，檢測其活性為1670 U/mg。
實施例3：
從沙棘果中提取超氧化物歧化酶，具體按下述步驟操作：
1、準(zhǔn)確稱取1000 g沙棘果，放入小桶中，然后加入2000mL生理鹽水，100 mL保護(hù)劑（千分之3濃度的聚乙二醇）和10 mL溶膜劑（曲拉通），用打漿機打漿，冷凍至有冰晶。放入冰箱中一小時。
2、將含有冰晶的沙棘果漿進(jìn)行冷凍離心，將上清液約2400 mL放入冰箱中冷凍1小時后，先過截留分子量為十萬的膜過濾設(shè)備，透過液進(jìn)入截留分子量為一萬的膜過濾設(shè)備，濃縮至200 mL用于SOD的提取。
3、沙棘果濃縮液200 mL中加入5g木質(zhì)活性炭和2.5g活性白土放入三角瓶中，同時加入0.2 mL激活劑（飽和氯化銅溶液）放在120 rpm/min的搖床上振蕩1小時進(jìn)行脫色。
4、將激活脫色后的漿液離心，約180 mL清液加入混合有機溶劑55 mL（乙醇：氯仿=5:3），充分混勻，冷凍1小時，離心，將清液和氯仿相分離。
5、向235 mL清液中加入150 mL的丙酮，冷凍1小時，離心，除去雜蛋白。
6、將上清液放在冰箱中冷凍20 min，然后再加入130 mL丙酮溶液，充分搖勻后冷凍1小時。
7、離心后將其沉淀在冷凍干燥器中冷凍干燥，得約0.11克SOD產(chǎn)品，檢測其活性為1310 U/mg。