本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種受外界有機氮調(diào)控表達的水稻啟動子的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在植物生長所需各種大量元素中，氮素是植物生長中需求量最大且起著制約作用的重要元素，是限制植物生長和植物產(chǎn)量的首要因素，同時，氮素也是生態(tài)系統(tǒng)中最常見的限制性因子[劇成欣，張耗，王志琴，等.水稻高產(chǎn)和氮肥高效利用研究進展[J].中國稻米，2013，19：16-21.]。適當增加氮肥施用量是使作物獲得高產(chǎn)的主要措施之一，然而氮肥利用率低以及隨著人們大量的施用氮肥，造成大量氮素的損失。由于氮對大氣和水體的排放，對環(huán)境帶來了一系列令人堪憂的問題，繼而對生態(tài)平衡造成不同程度的破壞。因而，提高農(nóng)作物對氮素的吸收和再利用效率，不僅可以為今后的研究提供理論依據(jù)，對提高農(nóng)作物產(chǎn)量和減少生態(tài)環(huán)境的污染也具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)和基因工程在植物領(lǐng)域的迅速發(fā)展，植物對氮素吸收轉(zhuǎn)運的分子機理也越來越清晰。根據(jù)前人的探究表明，氮的運輸?shù)鞍字饕譃榘被徇\輸?shù)鞍?、寡肽運輸?shù)鞍?、嘌呤及嘌呤衍生物運輸?shù)鞍?、銨根運輸?shù)鞍缀拖跛岣\輸?shù)鞍?NRT1)五大家族。寡肽運輸基因家族分為運輸含2～3個氨基酸殘基的寡肽的PTR運輸基因家族(peptide transporter family,PTR)和運輸4～5個氨基酸殘基的寡肽的OPT運輸基因家族(oligopeptide transporter family,OPT)兩大類[蔡昭艷，劉滔，方中明，等.植物寡肽運輸與硝酸根運輸基因家族的研究進展[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2011，19(1)：91-96.]。其中NRT1與PTR在序列同源性上歸屬于同一基因家族NPF(NRT1/PTR,nitrate transporter 1/peptide tansporter 1)家族，即能夠介導(dǎo)硝酸根、2-3個氨基酸的小分子肽等物質(zhì)進行跨膜運輸?shù)牡鞍譡Rentsch D,Schmidt S,Tegeder M.Transporters for uptake and allocation of organic nitrogen compounds in plants.FEBS Let,2007,581:2281-2289.]。

水稻中有84個NPF同源基因，但這些基因家族成員的功能和作用目前還知之甚少，只有少數(shù)幾個基因已經(jīng)報道。有研究發(fā)現(xiàn)SP1(OsNPF4.1)基因編碼一個屬于PTR家族的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，決定水稻穗長[Li SB,Qian Q,Fu ZM,et al.Short panicle1 encodes a putative PTR family transporter and determines rice panicle size.The Plant J,2009,58(4)：592-605.]；OsPTR9(OsNPF8.20)的表達受外源氮和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)，改變OsPTR9的表達影響水稻的氮素利用效率、生長和產(chǎn)量[Fang ZM,Xia KF,Yang X et al.Altered expression of the PTR/NRT1 homologue OsPTR9 affects nitrogen utilization efficiency,growth and grain yield in rice.Plant Biotech J,2013,11(4)：446-458.]。NPF基因家族其他成員的時空表達特異性并不清楚。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種受外界有機氮調(diào)控表達的水稻NPF基因家族成員OsNPF7.3基因的啟動子的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

本發(fā)明以水稻的NPF基因家族成員OsNPF7.3基因的啟動子為對象，首先將構(gòu)建好的啟動子-GUS表達載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到水稻成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織中，得到轉(zhuǎn)基因植株后鑒定陽性植株，繼而得到T1代轉(zhuǎn)基因植株，得到T2代成熟種子。然后在T2代種子生長的不同時期分別進行GUS組織化學(xué)染色，分別對其植株的根、莖、葉、穗等不同組織進行染色，測定GUS表達活性，并用不同氮處理轉(zhuǎn)基因植株，檢測GUS表達活性，分析其時空表達特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該啟動子活性能受外界有機氮的強烈誘導(dǎo)，促進下游基因在水稻的根和莖中特異性表達。將該啟動子應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因工程中，可在外界有機氮施加下增加氮的吸收與運輸，促進營養(yǎng)生長，也可以使在該啟動子下的目的基因的表達產(chǎn)物特異的在根和莖積累，增加局部表達量。因此，OsNPF7.3基因的啟動子在轉(zhuǎn)基因工程中有良好的應(yīng)用前景。

一種OsNPF7.3基因的啟動子在水稻中的應(yīng)用，為外界提供有機氮后該啟動子能夠啟動下游基因在水稻根和/或莖中特異性表達。實現(xiàn)該應(yīng)用的方法具體包括如下步驟：構(gòu)建該啟動子-目的基因的表達載體，再將表達載體導(dǎo)入水稻中得到轉(zhuǎn)基因水稻，轉(zhuǎn)基因水稻在外界提供有機氮后能促進目的基因在根和/或莖中表達。

所述的啟動子的序列如SEQ ID NO.1所示，或為對SEQ ID NO.1所示的序列進行取代、添加和/或缺失一個或幾個核苷酸獲得的不影響下游基因表達、具有同等功能的DNA序列。

所述的表達載體的骨架載體優(yōu)選為pCAMBIA-1301載體。

所述的有機氮包括蛋白胨、谷氨酸、谷氨酰胺。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了OsNPF7.3基因的啟動子活性能受外界有機氮的誘導(dǎo)，將該啟動子用于轉(zhuǎn)基因水稻中可使其下游基因在水稻的根和莖中能特異性表達，該啟動子在轉(zhuǎn)基因工程中有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明為以后探究如何調(diào)控氮素吸收與利用提供新的思路。

附圖說明

圖1是啟動子-GUS表達載體的轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定圖。圖中，M為DNA大小指示條帶，1-12各泳道均為T0代轉(zhuǎn)基因植株。其中，2-10泳道有條帶，為陽性植株，1和12泳道無條帶，為陰性植株，說明啟動子-GUS表達載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入到2-10泳道的轉(zhuǎn)基因株系中。

圖2是轉(zhuǎn)基因植株各組織部位GUS表達活性情況。圖中，A表示根尖，B表示根伸長區(qū)，C表示分蘗芽，D表示帶側(cè)根的根，E表示抽穗期的莖，F(xiàn)表示葉片，G表示葉鞘，H表示灌漿期的莖，I表示連接穗的莖，J表示孕穗期的穗，K表示抽穗期的穗，L表示灌漿期的穗，M表示成熟期的穗，N表示抽穗期打開穎殼的穗。

圖3是無機氮條件下GUS表達活性情況，圖中對照表示用全營養(yǎng)液一直培養(yǎng)。

圖4是有機氮條件下GUS表達活性情況，圖中對照表示用全營養(yǎng)液一直培養(yǎng)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。若未特別指明，下述實施例所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；所用的實驗方法均為常規(guī)方法，并可按照已描述的重組技術(shù)(參見分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)完成；所用的材料、試劑等，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1OsNPF7.3基因的啟動子-GUS轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的DNA，利用擴增引物F(GAATTCGAAGTGTATCTACAGCCAGGAA，SEQ ID NO.2)和擴增引物R(CCATGGAGAGGCAAGCAAGCAAGG，SEQ ID NO.3)通過PCR擴增OsNPF7.3基因的啟動子序列后，用EcoRI和NcoI酶切連入pCAMBIA-1301載體(pCAMBIA-1301載體購自Cambia公司)，構(gòu)建出啟動子-GUS表達載體pOsNPF7.3-p1301。采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，通過轉(zhuǎn)化水稻成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織將啟動子-GUS表達載體導(dǎo)入正常水稻品種中花11中。

將所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長高約10cm時，種于大田中，待苗長大后，通過PCR對轉(zhuǎn)基因植株進行檢測。檢測引物對為：

檢測引物F：GATGTTGGCGACCTCGTATT(SEQ ID NO.4)，

檢測引物R：TCGTTATGTTTATCGGCACTTT(SEQ ID NO.5)。

若擴增出517bp的片段，則轉(zhuǎn)基因植株為陽性植株，結(jié)果見圖1。陽性植株單株收種并種植，直至T2代鑒定出純合的轉(zhuǎn)基因植株。

實施例2轉(zhuǎn)基因植株不同部位啟動子-GUS表達活性的檢測

分別在種子萌發(fā)階段、小苗時期、分蘗期、生殖期對T2代純合轉(zhuǎn)基因植株的不同部位進行GUS染色，具體過程如下：

收獲鑒定成功的T2代種子后，將其浸泡在水中，并在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待種子萌發(fā)階段，在露白時期以及種子發(fā)芽時期分別進行GUS染色。

待種子的芽長到2cm左右，將其播種到96孔板，在溫室光照下用全營養(yǎng)液水培，待小苗時期，換用水稻營養(yǎng)液培養(yǎng)，水稻營養(yǎng)液采用國際水稻研究所常規(guī)營養(yǎng)液，其成分見下表1。待小苗長到10cm左右，對小苗的葉、根進行GUS染色。

表1國際水稻研究所常規(guī)營養(yǎng)液的成分

注：制備微量元素貯備液時，各種鹽類分別溶解，再與50mL的硫酸混勻，加蒸餾水稀釋至1L。使用時每4L營養(yǎng)液添加微量元素貯備液5mL。用NaOH調(diào)節(jié)pH值到5.0，每兩天換一次培養(yǎng)液。

待小苗長到在20cm左右，將其移栽到土壤里，溫室光照培養(yǎng)。待分蘗期，對植株的葉、根、莖和基部進行GUS染色。

在生殖期，分別在孕穗期、抽穗期、開花期、灌漿期和成熟期分別對T2代植株的葉、莖、根和穗等不同組織部位進行GUS染色。

以上材料侵泡于GUS染色液后并置于37℃保溫至過夜。然后用75％酒精脫色3次后將其保存于4℃。將用酒精脫色后的材料置于顯微鏡下觀察，藍色部位為GUS活性表達位點。

結(jié)果見圖2，經(jīng)過染色發(fā)現(xiàn)GUS活性在根、側(cè)根、莖和幼穗中較高。

實施例3啟動子-GUS轉(zhuǎn)基因植株在不同氮素條件下GUS表達活性比較

將T2代種子浸泡在水中，并在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待種子的芽長到2cm左右，將其播種到96孔板，在溫室光照下用全營養(yǎng)液進行水培，待小苗生長到3周左右，將全營養(yǎng)液換成在水稻營養(yǎng)液(除氮元素不加外)中添加2mM的硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、蛋白胨、谷氨酸、谷氨酰胺等不同氮的溶液進行培養(yǎng)(全營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)作為對照)，比較轉(zhuǎn)基因植株在不同氮下的GUS表達。結(jié)果見圖3、4，有機氮蛋白胨、谷氨酸、谷氨酰胺均能強烈促進啟動子序列調(diào)控GUS基因在根和側(cè)根中的表達。

上述結(jié)果表明，外界有機氮施加下，可以通過OsNPF7.3基因的啟動子來增加氮的吸收與運輸，促進營養(yǎng)生長，也可以使其他目的基因的表達產(chǎn)物特異的在根和莖積累，增加局部表達量，因此OsNPF7.3基因的啟動子在轉(zhuǎn)基因工程中有良好的應(yīng)用前景。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。