本發(fā)明涉及偽狂犬病病毒檢測技術領域，具體而言，涉及一種檢測偽狂犬病病毒的核酸組合及其應用、試劑盒以及方法。

背景技術：

目前，偽狂犬病病毒(pseudorabies,PRV)屬皰疹病毒科(Herpesvirdae)a-皰疹病毒亞科(Alpherpesvirinae)，是一種以懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎，新生仔豬發(fā)熱、神經(jīng)癥狀、麻痹、衰竭死亡為特征的傳染病，其死亡率可達100％。偽狂犬病是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，該病在我國廣泛存在并引發(fā)巨大損失。

目前核酸方面的檢測方法主要為傳統(tǒng)PCR，熒光定量PCR以及核酸雜交技術等。定量或者半定量的PCR方法已經(jīng)有許多的研究報道，往往也顯示出不錯的效果。然而，針對偽狂犬病病毒的核酸檢測，很大程度上依賴于樣品的采集部位。如采集樣品剛好在扁桃體，三叉神經(jīng)節(jié)，鼻粘膜等病毒含量高的部位則能使得檢測順利，檢出率高。但是，在實際的檢測中，不是所有時候都是檢測者親自采樣，一些部位如三叉神經(jīng)節(jié)也是很難精準采集的，若檢測時使用的是血液等病毒含量少的樣品，就有可能會出現(xiàn)漏檢。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種檢測偽狂犬病病毒的核酸組合，該核酸組合包括檢測偽狂犬病病毒的引物和探針，利用數(shù)字PCR技術檢測出樣品中低含量的偽狂犬病病毒，避免漏檢。

本發(fā)明的第二目的在于提供上述檢測偽狂犬病病毒的核酸組合在檢測偽狂犬病病毒中的應用，提高檢測的靈敏性和特異性，避免漏檢。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種檢測偽狂犬病病毒的試劑盒，該試劑包括上述核酸組合，該試劑盒可用于檢測低偽狂犬病病毒含量的樣品，避免漏檢，其具有靈敏性好、特異性強、檢測速度快、操作方便等特點。

本發(fā)明的第四目的在于提供一種檢測偽狂犬病病毒的方法，該檢測方法以上述的核酸組合作為檢測基礎，結合數(shù)字PCR技術，可對偽狂犬病病毒含量的樣品進行檢測，具有靈敏性高、特異性強特點。

本發(fā)明的實施例是這樣實現(xiàn)的：

一種檢測偽狂犬病病毒的核酸組合，其包括第一引物對和與第一引物對相對應的第一探針，第一引物對包括堿基序列分別如SEQ ID NO.1-2所示的引物，第一探針的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，第一探針的5’端的熒光報告基團為HEX或VIC，第一探針的3’端的淬滅基團為BHQ或TAMRA。

上述所述的檢測偽狂犬病病毒的核酸組合在檢測偽狂犬病病毒中的應用。

一種檢測偽狂犬病病毒的試劑盒，其包括上述的檢測偽狂犬病病毒的核酸組合。

一種檢測偽狂犬病病毒的方法，其包括：

往PCR體系中加入第一引物對和與第一引物對相對應的第一探針；

將PCR體系形成微滴，并進行微滴數(shù)字PCR；

其中，第一引物對包括堿基序列分別如SEQ ID NO.1-2所示，第一探針的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，第一探針的5’端的熒光報告基團為HEX或VIC，第一探針的3’端的淬滅基團為BHQ或TAMRA。

本發(fā)明實施例的一種檢測偽狂犬病病毒的核酸組合及其應用、試劑盒以及方法的有益效果是：本發(fā)明的檢測偽狂犬病病毒的核酸組合以基于數(shù)據(jù)PCR平臺，根據(jù)偽狂犬病病毒的gB基因的保守序列進行設計，該核酸組合包括堿基序列分別如SEQ ID NO.1-2所示的引物的第一引物對和堿基序列如SEQ ID NO.1-2所示的第一探針，這樣，該核酸組合可在數(shù)字PCR平臺上通過對gB基因的檢測，實現(xiàn)對偽狂犬病病毒的檢測，在檢測的過程中避免漏檢，提高檢出率，其具有靈敏性高、特異性強的特點。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例4的標準質粒按10倍梯度稀釋后檢測得到的標準曲線；

圖2為本發(fā)明實施例4的標準質粒按2倍梯度稀釋后檢測得到的標準曲線；

圖3為本發(fā)明實施例5的特異性檢測試驗結果；

圖4為本發(fā)明實施例7的實驗組和對照組在FAM通道中的熒光信號檢測結果；

圖5為本發(fā)明實施例7的實驗組和對照組在HEX通道中的熒光信號檢測結果。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明的一種檢測偽狂犬病病毒的核酸組合及其應用、試劑盒以及方法進行具體說明。

微滴數(shù)字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是近年來發(fā)展起來的快速、準確、可實現(xiàn)DNA絕對定量的PCR方法。其原理是通過把稀釋到一定濃度的DNA分子分布在一定數(shù)目的微滴中，使大部分微滴中的DNA分子數(shù)目為1或0，然后通過PCR擴增和熒光信號的累計讀取陽性微滴數(shù)目，再根據(jù)泊松分布計算出(現(xiàn)有的數(shù)字PCR儀器基本上都自動相應軟件可自動計算出DNA分子數(shù))樣本中的DNA分子數(shù)。該方法無需內參基因無需制備標準曲線，在微量核酸樣品的檢測中顯示出很好的檢測效果。

基于此，發(fā)明人通過對偽狂犬病病毒的gB基因的保守序列進行設計出了可用于ddPCR平臺的檢測偽狂犬病病毒的核酸組合，其包括：第一引物對和與第一引物對相對應的第一探針，第一引物對包括堿基序列分別如SEQ ID NO.1-2所示的引物，第一探針的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，第一探針的5’端的熒光報告基團為HEX或VIC，第一探針的3’端的淬滅基團為BHQ或TAMRA。

具體地，第一引物對包括上游引物gB-F和下游引物gB-R，上游引物gB-F的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物gB-R的堿基序列如SEQ ID NO.2所示。

通過上述核酸組合，通過gB基因的檢測，實現(xiàn)對偽狂犬病病毒的檢測，其具有較高的靈敏性和特異性，能夠從低偽狂犬病病毒含量樣品中檢出偽狂犬病病毒，有效地避免傳統(tǒng)檢測方法出現(xiàn)的漏檢現(xiàn)象。

此外，根據(jù)大多數(shù)商業(yè)化偽狂犬病病毒的基因缺失疫苗都具有gE基因缺失，某些多基因缺失疫苗也是在gE基因缺失的基礎上再缺失TK或gI基因等情況。本發(fā)明人還針對偽狂犬病病毒的gE基因設計出了相應引物和探針。以期在對病原實現(xiàn)準確快速檢測的同時也能對所檢出的偽狂犬病病毒是野毒株，還是gE缺失的疫苗毒株進行有效區(qū)分，使檢測結果更可靠準確。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供的檢測偽狂犬病病毒的核酸組合還可包括：第二引物對和與第二引物對相對應的第二探針。第二引物對包括堿基序列分別如SEQ ID NO.4-5所示，第二探針的堿基序列如SEQ ID NO.6所示。第二探針的5’端的熒光報告基團為FAM，第二探針的3’端的淬滅基團為BHQ或TAMRA。需要說明的是，在這種情況下，第一探針的熒光報告基因的類別均可根據(jù)實際情況選擇，只要保證其第一探針和第二探針的熒光報告基因的類別不同即可。第一探針和第二探針二者的淬滅基團則可相同，也可以不相同。

其中，第二引物對包括上游引物gE-F和下游引物gE-R。上游引物gE-F的堿基序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物gE-R的堿基序列如如SEQ ID NO.5所示。

第二引物對和第二探針對gE基因檢測，其與第一引物對和第一探針配合，形成兩重ddPCR，在對偽狂犬病病毒的檢測同時不僅避免非特異性擴增，又可實現(xiàn)偽狂犬病病毒是野毒株、還是gE缺失的疫苗毒株的區(qū)分，也就說檢測出gB基因和gE基因都有熒光信號為野毒株，檢測出gB基因有熒光信號、gE基因沒有熒光信號則gE缺失的疫苗毒株，這樣可確保檢測結果更準確更可信。

本發(fā)明還提供了上述的任意一種檢測偽狂犬病病毒的核酸組合在檢測偽狂犬病病毒中的應用。該檢測偽狂犬病病毒的核酸組合其不僅可在ddPCR平臺進行應用，還可以通過熒光定量PCR、普通PCR等方式來實現(xiàn)對檢測偽狂犬病病毒的檢測，只要采用本發(fā)明提供的核酸組合用于檢測偽狂犬病病毒即屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明提供的檢測偽狂犬病病毒的試劑盒包括上述任一種的核酸組合。

該試劑盒可用于在ddPCR平臺上檢測樣品中是否含有偽狂犬病病毒，并同時對檢出的病原進行區(qū)分，即對所檢出的偽狂犬病病毒是野毒株還是gE基因缺失的疫苗毒株，同樣具有靈敏性好、特異性強的特點。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供的檢測偽狂犬病病毒的試劑盒還可以包括在進行ddPCR時配套的PCR反應緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶中的一種或多種等成分。

此外，本發(fā)明提供的檢測偽狂犬病病毒的方法包括以下步驟：

(1)配制PCR反應體系

往PCR體系中加入上述的第一引物對和與第一引物對相對應的第一探針，以進行PCR，實現(xiàn)對樣品中偽狂犬病病毒的高靈敏性檢測。其中，PCR體系包括PCR反應混合液和待測樣本的DNA模板。PCR反應混合液可通過市面購買，也可自行配制，PCR反應混合液主要包括：PCR反應緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶等成分。

優(yōu)選地，在該PCR體系還可加入上述的第二引物對和與第二引物對相對應的第二探針。以進行兩重PCR，在實現(xiàn)對樣品中偽狂犬病病毒的高靈敏性檢測同時，進一步實現(xiàn)對所檢出的偽狂犬病病毒的類別進行檢測，區(qū)分所檢出病原是偽狂犬病病毒是野毒株還是gE基因缺失的疫苗毒株，以使結果更加準確可靠。

(2)微滴生成

將PCR體系形成微滴，并進行微滴數(shù)字PCR。

優(yōu)選地，采用微滴生成油對PCR體系進行微滴處理形成微滴，微滴生成油與PCR體系的體積比為6.8～7.2:2。優(yōu)選地，微滴生成油與PCR體系的體積比為:7:2.。

當然，本發(fā)明在其他的實施例中，也可以采用將PCR反應體系分散到ddPCR反應芯片上的方式形成微滴，并不限于采用微滴生成油包裹的方式。

優(yōu)選地，進行所述微滴數(shù)字PCR的的PCR反應條件為：95℃預變性10min；95℃變性30s，50-60℃退火1min，40個循環(huán)；98℃10min，4℃停止反應。

更優(yōu)選地，進行所述微滴數(shù)字PCR的的PCR反應條件為：95℃預變性10min；95℃變性30s，58.3℃退火1min，40個循環(huán)；98℃10min，4℃停止反應。

(3)檢測

在數(shù)字PCR儀器上檢測相應的熒光信號，得到檢測結果。

綜上，本發(fā)明提供的檢測偽狂犬病病毒的核酸組合及其應用、試劑盒以及方法具有很高的靈敏性和較強特異性，能夠有效地對低病毒含量的樣品進行檢測，檢出率高，同時區(qū)分出檢出病原的類別，檢測結果更準確可靠，克服了現(xiàn)有檢測方法的缺陷，為偽狂犬病病毒的檢測提供了更多的科學依據(jù)和支撐。

以下結合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述。

實施例1

本實施例提供了檢測偽狂犬病病毒的核酸組合，其包括第一引物對和與第一引物對相對應的第一探針，以及第二引物對和與第二引物對相對應的第二探針。第一引物對和第一探針根據(jù)偽狂犬病病毒的gB基因的保守序列設計，可用于檢測出樣品是否含有偽狂犬病病毒。第二引物對和第二探針根據(jù)偽狂犬病病毒的gE基因的保守序列設計，通過第二引物對和第二探針的加入，可使得在檢測樣品是否含有偽狂犬病病毒的同時，進一步區(qū)分所檢測出的偽狂犬病病毒是野毒株(gB陽性、gE陽性)，還是gE缺失的商業(yè)化疫苗毒株(gB陽性、gE陰性)。

需要說明的是，在其他的實施例中，在不需要區(qū)分所檢出的偽狂犬病病毒是野毒株還是gE缺失商業(yè)化疫苗毒株的情況下。本發(fā)明的檢測偽狂犬病病毒的核酸組合可以僅包括第一引物對和第一探針，即可實現(xiàn)對偽狂犬病病毒的檢測效果。

具體地，第一引物對的上游引物gB-F為：

5’-TGAAGCGGTTCGTGATGG-3’(其堿基序列如SEQ ID NO.1所示)，第一引物對的下游引物gB-R為：

5’-CCCCGCACAAGTTCAAGG-3’(其堿基序列如SEQ ID NO.2所示)。第一探針gB-probe為：

HEX-5’-CGCGTACGTGCTCCCGGACC-3’-BHQ(其堿基序列如SEQ ID NO.3所示)。

具體地，第二引物對的上游引物gE-F為：5’-CTTCCACTCGCAGCTCTTCTC-3’(其堿基序列如SEQ ID NO.4所示)，第二引物對的下游引物gE-R為：5’-GTRAAGTTCTCGCGCGAGT-3’(其堿基序列如SEQ ID NO.5所示)。第二探針gE-probe為：FAM-5’-TTCGACCTGATGCCGC-3’-BHQ(其堿基序列如SEQ ID NO.6所示)。

綜上，本實施例提供的核酸組合可通過采用兩重數(shù)字PCR技術，檢測出樣品中是否含有gB和gE基因成分，提高檢出限、防止漏檢，實現(xiàn)對偽狂犬病病毒快速檢測，同時通過多重PCR，在檢測的同時，區(qū)分所檢病原是野毒株還是gE缺失商業(yè)化疫苗毒株。

實施例2

本實施例提供了檢測偽狂犬病病毒的試劑盒，該試劑盒包括實施例1提供的核酸組合。該試劑盒可用于在ddPCR平臺上檢測樣品中是否含有偽狂犬病病毒，并同時對檢出的病原進行區(qū)分，即對所檢出的偽狂犬病病毒是野毒株還是gE基因缺失的疫苗毒株，且本實施例提供的試劑盒具有良好的靈敏性和特異性，能夠避免樣品中含有的病毒量少而導致的漏檢情況發(fā)生。

當然，在其他的實施例中，本發(fā)明提供的檢測偽狂犬病病毒的試劑盒還可以包括在進行ddPCR時配套的PCR反應緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶中的一種或多種等成分。

實施例3

本實施例提供了檢測偽狂犬病病毒的方法，具體如下。

1.配制ddPCR反應體系：2×ddPCR master mix 10μL，引物(900nM)各0.9μL(gB-F、gB-R、gE-F、gE-R各0.9μL)，探針(250nM)各0.5μL(gB-probe、gE-probe各0.5μL)，待測樣品的DNA模板2μL，DEPC處理水補足至20μL。

gB-F、gB-R、gE-F、gE-R、gB-probe、gE-probe的堿基序列同實施例1。

2.生成微滴：采用微滴生成油包裹ddPCR反應體系方式形成微滴，微滴生成油與ddPCR反應體系的體積比7:2，微滴的數(shù)量為1×10⁴個。在本實施例中，在ddPCR儀器上(QX100微滴式數(shù)字PCR儀、美國伯樂公司)用75μL微滴生成油包裹ddPCR反應體系形成微滴。

3.按如下ddPCR反應條件進行反應：95℃預變性10min；95℃變性30s，58.3℃退火1min，40個循環(huán)；98℃10min，4℃停止反應。

4.檢測，用在FAM通道和VIC通道下分別FAM和VIC熒光信號，F(xiàn)AM通道檢測gE基因，HEX通道檢測gB基因。根據(jù)熒光信號值，檢測出待測樣品的偽狂犬病病毒。若FAM通道和HEX通道均有熒光信號，則表明待測樣品中含有偽狂犬病病毒野毒株；若HEX通道有熒光信號、FAM通道沒有熒光信號，則表明待測樣品中含有gE缺失的偽狂犬病病毒疫苗。

實施例4

對實施例1提供檢測偽狂犬病病毒的核酸組合的靈敏性試驗。

標準曲線繪制與靈敏性試驗

用梯度稀釋的標準質粒作為模板進行擴增，以估計的標準質粒濃度作為橫坐標，以ddPCR檢測得來的質粒濃度作為縱坐標，繪制標準曲線并以R²評價線性關系。得出在滿足線性關系，并且FAM和HEX通道都能檢測出陽性結果的前提下，該方法所能檢測出的最小濃度，作為上述核酸組合的靈敏性判斷指標。具體步驟如下。

1.配制質粒模板：以分別連接有gE基因的標準質粒(pMD19-T-gE)和gB基因的標準質粒(pMD19-T-gB)進行等濃度等體積混合，制備10倍和2倍梯度稀釋的質粒模板。其中，10倍梯度稀釋的濃度分別為：1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹以及0copies/μL；2倍梯度稀釋的濃度分別為：76、38、19、9.5、4.75copies/μL。

2.配制ddPCR反應體系：2×ddPCR master mix 10μL(mix包括PCR反應緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司)，引物(900nM)各0.9μL(gB-F、gB-R、gE-F、gE-R各0.9μL)，探針(250nM)各0.5μL(gB-probe、gE-probe各0.5μL)，質粒模板2μL，DEPC處理水補足至10μL。按上述ddPCR反應體系，配制出各梯度稀釋濃度的ddPCR反應體系。按上述ddPCR反應體系配制出各梯度濃度的ddPCR反應體系。

3.微滴生成：采用數(shù)字PCR儀器(QX100微滴式數(shù)字PCR儀、美國伯樂公司)、用75μL的微滴生成油對應25μL的ddPCR反應體系生成10000個微滴，生成微滴后封膜并進行PCR擴增。ddPCR條件：95℃預變性10min；95℃變性30s，58.3℃退火1min，進行40個循環(huán)；98℃10min，4℃保存。

4.檢測：反應結束后，用數(shù)字PCR儀器(QX100微滴式數(shù)字PCR儀、美國伯樂公司)在FAM通道和VIC通道分別檢測各梯度濃度的ddPCR反應體系所對應的FAM和VIC熒光信號，F(xiàn)AM通道檢測gE基因，HEX通道檢測gB基因。根據(jù)熒光信號值，數(shù)字PCR儀器通過自帶軟件自動計算出相應的標準質粒拷貝數(shù)(即檢測所得標準質?？截悢?shù))，以各梯度濃度的ddPCR反應體系中預計質粒拷貝數(shù)作為橫坐標、以各梯度濃度的ddPCR反應體系中檢測所得質?？截悢?shù)作為縱坐標、分別繪制出10倍和2倍梯度稀釋的質粒模板的標準曲線，結果如圖1～圖2和表1所示。

由圖1可知(圖中)，在10倍稀釋濃度下，檢測gB基因的標準曲線的R²為0.998，檢測gE基因的標準曲線的R²為999；由圖2可知，在2倍稀釋濃度下，檢測gB基因的標準曲線的R²為0.9966，檢測gE基因的標準曲線的R²為9968。由此可以看出本發(fā)明提供的核酸組合以及檢測方法不管在高濃度或低濃度的情況下(1×10⁴～4.75copies/μL)都能保持良好的線性關系。且由表2可知，最小的檢測濃度為4.75copies/μL，進一步表明本發(fā)明提供的核酸組合、試劑盒以及檢測方法的靈敏性較好。

表1.在2倍梯度稀釋濃度下檢測出的標準質粒濃度

實施例5

對實施例1提供的檢測偽狂犬病病毒的核酸組合的特異性試驗。

以豬瘟疫苗，藍耳疫苗，偽狂犬病病毒疫苗Bartha K61，偽狂犬野毒株，乙腦疫苗，是細小疫苗，圓環(huán)2型疫苗以及健康豬組織DNA作為受檢樣品，檢測上述核酸組合的特異性。具體步驟如下。

1.提取受檢樣品的基因組DNA：按病毒DNA/RNA提取試劑盒的操作說明提取上述受檢樣品的基因組DNA，并將提取的各受檢樣品的DNA稀釋至同一質量濃度100μg/μL，作為進行ddPCR的DNA模板。

2.配制ddPCR反應體系：2×ddPCR master mix 10μL，引物(900nM)各0.9μL(gB-F、gB-R、gE-F、gE-R各0.9μL)，探針(250nM)各0.5μL(gB-probe、gE-probe各0.5μL)，DNA模板2μL，DEPC處理水補足至20μL。按上述ddPCR反應體系，配制出各受檢樣品的ddPCR反應體系。同時以滅菌超純水作為模板，配制出空白對照的ddPCR反應體系。

3.微滴生成：上機(QX100微滴式數(shù)字PCR儀、美國伯樂公司)、用75μL的微滴生成油對應25μL的ddPCR反應體系生成10000個微滴，生成微滴后封膜并進行PCR擴增。ddPCR條件：95℃預變性10min；95℃變性30s，58.3℃退火1min，進行40個循環(huán)；98℃10min，4℃保存。

4.檢測：反應結束后，在FAM通道和VIC通道分別檢測各受檢樣品所對應的FAM和VIC熒光信號，結果如圖3所示。

由圖3可知(圖中：A代表FAM通道中的熒光信號檢測結果，B代表在HEX通道中的熒光信號檢測，A11是空白對照，B11是豬瘟疫苗，C11是藍耳疫苗，D11是偽狂犬疫苗Bartha K61(gE缺失的偽狂犬病病毒疫苗)，E11是偽狂犬野毒株(偽狂犬病野毒株)，G11乙腦疫苗，H11是細小疫苗，A12是圓環(huán)2型疫苗，H12是健康豬組織)，在FAM和HEX檢測通道中，空白對照以及豬瘟疫苗，藍耳疫苗，乙腦疫苗，細小疫苗，圓環(huán)2型疫苗以及健康豬組織均沒有熒光信號；偽狂犬疫苗Bartha K61(D11)只在FAM通道下有熒光信號，但在VIC通道中沒有熒光信號，說明偽狂犬疫苗Bartha K61是缺失gE基因的偽狂犬病病毒疫苗，與實際結果一致；而偽狂犬野毒株(E11)在FAM通道和VIC通道中均檢測到熒光信號，說明偽狂犬野毒株是偽狂犬病野毒株，與實際結果一致；由此表明，本發(fā)明提供的檢測偽狂犬病病毒的的核酸組合、試劑盒以及檢測方法的特異性較好，不會導致非特異性擴增，且同時能夠有效地區(qū)分偽狂犬野毒與gE缺失的疫苗毒株，

實施例6

對實施例3提供的檢測偽狂犬病病毒的方法進行重復性檢測試驗。

配制質粒模板：以分別連接有gE基因的標準質粒(pMD19-T-gE)和gB基因的標準質粒(pMD19-T-gB)進行等濃度等體積混合，梯度稀釋出3個梯度濃度，分別為：7.6×10⁴、7.6×10³以及7.6×10²copies/μL，每個梯度濃度按實施例3的檢測方法，檢測出每個梯度濃度下的質?？截悢?shù)，結果以平均值表示，比較組內和組間變異系數(shù)(CV)，評價重復性，每個梯度濃度重復3次。重復性試驗結果如表2所示。

表2.重復性試驗結果

注：表中樣本編號1、2、3分別表示7.6×10⁴、7.6×10³以及7.6×10²copies/μL

由表2可知，組內變異系數(shù)平均值為0.66％，組間變異系數(shù)為0.74％，均低于3％，由此表明本發(fā)明提供的檢測偽狂犬病病毒的方法具有較好的重復性，也進一步表明本發(fā)明提供的核酸組合、試劑盒同樣具有較好的重復性。

實施例7

對實施例3提供的檢測偽狂犬病病毒的方法的退火溫度的驗證試驗。具體如下步驟如下。

1.配制ddPCR反應體系：2×ddPCR master mix 10μL，引物(900nM)各0.9μL(gB-F、gB-R、gE-F、gE-R各0.9μL)，探針(250nM)各0.5μL(gB-probe、gE-probe各0.5μL)，待測樣品的DNA模板2μL，DEPC處理水補足至20μL。

gB-F、gB-R、gE-F、gE-R、gB-probe、gE-probe的堿基序列同實施例1。

2.生成微滴：采用微滴生成油包裹ddPCR反應體系方式形成微滴，微滴生成油與ddPCR反應體系的體積比7:2，微滴的數(shù)量為1×104個。在本實施例中，在ddPCR儀器上(QX100微滴式數(shù)字PCR儀、美國伯樂公司)用75μL微滴生成油包裹ddPCR反應體系形成微滴。

3.以95℃預變性10min；95℃變性30s，58.3℃退火1min，40個循環(huán)；98℃10min，4℃停止反應的ddPCR反應條件作為試驗組。以退火溫度分別為50℃，50.7℃，52℃，53.9℃，56.3℃，59.4℃，60℃作為對比組(共7個對比組)，對比組的其他ddPCR反應條件的設置同試驗組。

4.檢測，用在FAM通道和VIC通道中分別檢測FAM和VIC熒光信號，F(xiàn)AM通道檢測gE基因，HEX通道檢測gB基因。檢測結果如圖4和圖5所示。

由圖4和圖5可知(圖中：橫坐標代表微滴數(shù)，縱坐標代表振幅，A12為50℃，B12為50.7℃，C12為52℃，D12為53.9℃，E12為56.3℃，F(xiàn)12為58.3℃，G12為59.4℃，H12為60℃)，在FAM通道中，試驗組(F12)的陽性熒光信號和背景信號的差別最大，具有明顯的反應效果，表明以58.3℃作為退化溫度進行ddPCR，具有較佳的反應結果。

實施例8

在本實施例中，按實施例3提供的檢測偽狂犬病病毒的方法對23份組織樣品和21份血液樣品進行偽狂犬病病毒檢測。檢測結果如表2所示。

表2.組織樣品和血液樣品的檢測結果

由表2可知，23份組織樣品中，gE和gB雙基因陽性結果為18份，gE陰性gB陽性結果為1份，雙基因陰性為4份，與已知檢測結果的一致性為100％。21份血液樣品預先用熒光定量PCR檢測結果雙基因與gB單基因的總陽性率為47.6％，ddPCR檢測結果總陽性率為81％，證明本發(fā)明采用特異性引物(第一引物對和第二引物對)和探針(第一探針和第二探針)結合ddPCR技術來對偽狂犬病病毒的檢測方法的檢測結果與實際結果的符合性更高，并且進一步證明本發(fā)明提供的檢測偽狂犬病病毒的核酸組合、試劑盒以及方法具有很高的靈敏性和較強特異性，能夠有效地對低病毒含量的樣品進行檢測，同時區(qū)分出檢出病原的類別，為偽狂犬病病毒的檢測提供了更多的科學依據(jù)和支撐。

以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。