相關申請的交叉參引本申請要求由hergenrother等人于2009年2月9日提交的美國臨時申請61/151,064的優(yōu)先權,該申請的全部內容通過引用的方式納入本文。關于聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究所(nationalinstitutesofhealth)授予的r01-ca120439、美國國立衛(wèi)生研究所授予的1t32gm070421和美國國立衛(wèi)生研究所授予的f31-ca13013801s1的政府資助下完成的。政府享有本發(fā)明的某些權利。
背景技術:
::凋亡(或程序性細胞死亡)在所有多細胞生物的發(fā)育和體內平衡中起主要作用(shiy,2002,molecularcell9:459-470)。癌癥的常見特點是對天然凋亡信號的抗性。根據(jù)癌癥的種類,這種抗性通常是由于凋亡級聯(lián)中關鍵蛋白的上調或下調,或者是由于編碼這些蛋白的基因中的突變。這種變化發(fā)生于內在凋亡途徑(其如經漏斗般(funnel)通過線粒體和胱天蛋白酶-9)和外在凋亡途徑(其涉及死亡受體和胱天蛋白酶-8的作用)。例如,已在癌癥中觀察到了蛋白(例如p53、bim、bax、apaf-1、flip等)的合適水平的改變。所述改變可導致有缺陷的凋亡級聯(lián),其中上游的促凋亡信號無法得到充分地傳遞來活化執(zhí)行者(executioner)胱天蛋白酶——胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7。圖1顯示了所述凋亡級聯(lián)的一些方面。由于大多數(shù)凋亡途徑最終會涉及胱天蛋白酶原-3的活化,上游的基因異常在凋亡線路中有效“斷裂”,結果這類細胞會非典型地增殖?;诘蛲鲈诎┌Y中的主要作用,已努力開發(fā)了靶向凋亡級聯(lián)中的特定蛋白的治療劑。例如,對級聯(lián)成員(例如p53)和bcl家族中的蛋白或者對凋亡抑制蛋白(iap)家族的肽結合劑或小分子結合劑具有促凋亡活性,促進apaf-1低聚化的化合物也具有促凋亡活性。但是,因為這種化合物靶向所述凋亡級聯(lián)上的較早(或中間至較高)位置,這些成員的下游蛋白具有突變的癌癥仍然可對抗這些化合物可能的有利效果。為了治療目的,優(yōu)選地鑒定直接活化所述凋亡級聯(lián)中較遠下游的促凋亡蛋白的小分子。本發(fā)明的方法涉及所述級聯(lián)中的這種較低的位置,因此甚至能夠殺死在其上游凋亡結構中具有突變的那些細胞。此外,如果在癌細胞中上調促凋亡蛋白,則本文公開的治療策略可具有較大的成功可能性。在本發(fā)明中,本發(fā)明人努力鑒定了從靶向凋亡的重要下游效應蛋白——胱天蛋白酶原-3開始的小分子。胱天蛋白酶原-3向胱天蛋白酶-3的轉變或活化可導致生成有活性的“執(zhí)行者”胱天蛋白酶形式,其隨后會催化對多種蛋白底物的水解?;钚噪滋斓鞍酌?3是異二聚體的同二聚體,并且通過蛋白水解胱天蛋白酶原-3產生。在體內,這種蛋白水解活化是通常通過胱天蛋白酶-8或胱天蛋白酶-9的作用發(fā)生。為了確保前酶或酶原不被過早活化,胱天蛋白酶原-3具有12個氨基酸的“安全閂”(safetycatch),其可阻斷蛋白水解接觸到ietd部位(氨基酸序列為ile-glu-thr-asp)。參見roy,s.etal.;maintenanceofcaspase-3proenzymedormancybyanintrinsic″safetycatch″regulatorythpeptide,proc.natl.acad.sci.98,6132-6137(2001)。這種安全閂能使胱天蛋白酶原-3抵抗自體催化活化和胱天蛋白酶-9引起的蛋白水解。突變研究表明,三個連續(xù)的天門冬氨酸殘基似乎是所述安全閂的關鍵組分。所述安全閂的位置對ph敏感;因此,一旦細胞酸化(這發(fā)生在凋亡過程中),則認為所述安全閂允許接觸蛋白水解部位,并且活性胱天蛋白酶-3可通過胱天蛋白酶-9的作用或者通過自體活化機理產生。在具體癌癥中,胱天蛋白酶原-3的表達被上調。對來自20個結腸癌患者的原代分離物的研究揭示了,平均而言,在這類分離物中胱天蛋白酶原-3相對鄰近的非癌組織被上調了6倍(royetal.,2001)。此外,胱天蛋白酶原-3在某些成神經細胞瘤、淋巴瘤和肝癌中被上調(nakagawara,a.etal.,1997,cancerres.57:4578-4584;izban,k.f.etal.,am.j.pathol.154:1439-1447;persad,r.etal.,modernpatholo.17:861-867)。再者,美國國家癌癥研究所治療發(fā)展部(nationalcancerinstitute(nci)developmentaltherapeuticsprogram)對用于癌癥篩選的60個細胞系組中胱天蛋白酶原-3水平進行了系統(tǒng)評價。評價揭示了某些肺癌、黑素瘤、腎癌和乳腺癌顯示出極大提高的胱天蛋白酶原-3表達水平(svingen,p.a.etal.,clin.cancerres.10:6807-6820)。由于活性胱天蛋白酶-3在完成凋亡中的作用、胱天蛋白酶原-3在某些癌細胞類型中相對較高的表達水平以及值得注意的由安全閂介導的對其自體活化的抑制,本發(fā)明人有理由認為直接修飾胱天蛋白酶原-3的小分子可被鑒定,并且這類分子在靶向癌癥治療中可能有廣泛應用。在本文中本發(fā)明人尤其公開了,包括能夠誘導細胞死亡的小分子的組合物和方法。在一些實施方案中,一些組合物和方法涉及可直接或間接與程序性細胞死亡途徑成員(例如胱天蛋白酶原-3)相互作用的化合物。在一些實施方案中,與其它直接或間接與程序性細胞死亡途徑成員(例如胱天蛋白酶原-3)相互作用的化合物相比,本發(fā)明的組合物和方法具有降低的神經毒性。技術實現(xiàn)要素:本發(fā)明在廣義上提供了治療性治療的化合物、組合物和方法。在一些實施方案中,本發(fā)明適用于多種癌癥疾病和癌細胞種類的情況,例如乳腺癌、淋巴瘤、腎上腺癌、腎癌、黑素瘤、白血病、成神經細胞瘤、肺癌、腦癌和本領域中已知的其它癌癥。還需進一步說明的是,已經發(fā)現(xiàn)了能夠活化通常以其無活性形式在癌細胞中過表達的酶的化合物。所述化合物可誘導癌細胞中的程序性細胞死亡(凋亡),包括上調胱天蛋白酶原-3的化合物。許多癌癥會抵抗標準化學治療。本發(fā)明的化合物可以利用在癌細胞中可能被上調的生物靶,因此甚至在其凋亡機構有缺陷的細胞中也被證明可起作用。這些化合物也可成功用于靶向癌癥療法,其中有利的是選擇性殺死癌細胞,同時對胱天蛋白酶原-3水平較低的非癌細胞的副反應相對較低。這些副反應可包括毒性,特別是神經毒性。不欲拘泥于具體理論,據(jù)信本發(fā)明的化合物、組合物和方法的實施方案可通過在癌細胞治療中有效的凋亡或程序性細胞死亡的調節(jié)機理發(fā)揮作用。在一個優(yōu)選的實施方案中,凋亡的調節(jié)通過誘導凋亡實現(xiàn)。在另一個實施方案中,凋亡的調節(jié)通過抑制凋亡實現(xiàn)。提供了具有n-?;赇\-螯合核心的化合物,所述核心具有至少一個連接于末端苯基環(huán)的極性基團。還提供了具有原-羥基n-?;赇\螯合核心的化合物,所述核心具有至少一個連接于末端苯基環(huán)的極性基團。更特別地,提供了具有式(fx1)的化合物:其中x1、x2、x3、x4和x5各自獨立地為c或n,其中當x1、x2、x3、x4和x5為n時,相應的r10、r11、r12、r13或r14不存在;r10、r11、r12、r13、r14、r3、r7、r8和r9之一含有選自以下的極性基團:氨磺?;⑾趸?、氨基、羧基、磺?;头蓟酋;?;r10、r11、r12、r13、r14、r3、r7、r8和r9中的其它基團各自獨立地選自:氫、鹵素、氨磺?;?、硝基、氨基、羧基、磺?;?、芳基磺?;?、烷氧基、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基和c2-c6烯基;n和m各自獨立地為1至3的整數(shù);r4和r5各自獨立地為ch或n;a為o或s;r6為氫或c1-c6烷基;x為氧;并且r2為氫、c1-c6烷基或c1-c6烷氧基。還提供了具有式(fx11)的化合物:其中x1、x2、x3、x4和x5各自獨立地為c或n,其中當x1、x2、x3、x4和x5為n時,相應的r10、r11、r12、r13或r14不存在;r10、r11、r12、r13和r14之一含有選自以下的極性基團:氨磺?;?、硝基、氨基、羧基、磺?;头蓟酋;?;r10、r11、r12、r13和r14中的其它基團各自獨立地選自:h、鹵素、氨磺?;⑾趸?、氨基、羧基、磺?;⒎蓟酋;屯檠趸?;n和m各自獨立地為1至3的整數(shù);r4和r5各自獨立地為ch或n;a為o或s;r6為氫或c1-c6烷基;r3、r7、r8、r9各自獨立地選自氫、鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基或c2-c6烯基;x為氧;并且r2為氫、c1-c6烷基或c1-c6烷氧基。在一個實施方案中,r2x在本文提供的任何式和結構中均為-oh。在一個實施方案中,r3在本文提供的任何式和結構中均為甲氧基或烯丙基。在一個實施方案中,在式(fx1)中,r10、r11、r12、r13、r14、r3、r7、r8或r9之一選自:-no2;-cooh;其中ra和rb各自獨立地為氫、c1-c6烷基和c1-c6烷氧基,r18和r19各自獨立地選自氫和c1-c6烷基,q為o至3的整數(shù);其中r16和r17各自獨立地選自氫和c1-c6烷基,并且p為0至3的整數(shù)。在一個實施方案中,在式(fx1)或(fx11)中,r10、r11或r12之一選自:-no2;-cooh;其中ra和rb各自獨立地為氫、c1-c6烷基和c1-c6烷氧基,r18和r19各自獨立地選自氫和c1-c6烷基,并且q為0至3的整數(shù);其中r16和r17各自獨立地選自氫和c1-c6烷基,并且p為0至3的整數(shù)。在一個實施方案中,在式(fx1)中,r10、r11、r12、r13、r14、r3、r7、r8或r9之一為其中ra和rb各自獨立地為氫、c1-c6烷基和c1-c6烷氧基;r18和r19各自獨立地選自氫和c1-c6烷基;q為0至3的整數(shù)。在一個實施方案中,在式(fx1)或(fx11)中,r10、r11、r12、r13、或r14之一為其中ra和rb各自獨立地為氫、c1-c6烷基和c1-c6烷氧基;r18和r19各自獨立地選自氫和c1-c6烷基;q為0至3的整數(shù)。在一個實施方案中,在式(fx1)或(fx11)中,r12為其中ra和rb各自獨立地為氫、c1-c6烷基和c1-c6烷氧基;r18和r19各自獨立地選自氫和c1-c6烷基;并且q為0至3的整數(shù)。在一個實施方案中,在r12中,ra和rb各自為氫,并且q為0。在一個實施方案中,r3為烯丙基,x為o,并且r2為氫。在一個實施方案中,r12為-s(=o)2-nh2。在一個實施方案中,r11、r12和r13為甲氧基。在一個實施方案中,r3為烯丙基,x為o,并且r2為氫。在一個實施方案中,x1、x2、x3、x4和x5中的一個或兩個為n。還提供了具有式(fx2)的式(fx1)或(fx11)化合物:其中變量如本文其它地方對式(fx1)或(fx11)的描述。還提供了具有式(fx12)的式(fx1)或(fx11)化合物:其中變量如本文其它地方對式(fx1)或(fx11)的描述。還提供了具有式(fx3)、(fx4)、(fx5)或(fx6)的式(fx1)或(fx11)化合物:還提供了具有式(fx7)或(fx8)的式(fx1)或(fx11)化合物:還提供了包含熒光標記物的式(fx1)或(fx11)化合物。還提供了具有結構(fx9)的式(fx1)或(fx11)化合物:在一個實施方案中,還提供了一種在癌細胞中選擇性誘導凋亡的方法,包括將能夠修飾所述癌細胞的胱天蛋白酶原-3分子的化合物給予所述癌細胞;其中所述化合物為式(fx1)或(fx11)的化合物。在一個實施方案中,還提供了一種選擇性誘導癌細胞凋亡的方法,包括將能夠修飾所述癌細胞的胱天蛋白酶原-3分子的化合物給予所述癌細胞;其中所述化合物為式(fx1)或(fx11)化合物,并且其中所述癌細胞在需要治療的患者體內。在一個實施方案中,還提供了一種治療癌細胞的方法,包括(a)鑒別對以胱天蛋白酶原活化化合物進行的癌細胞治療的潛在易感性;和(b)使所述癌細胞暴露于有效量的所述胱天蛋白酶原活化化合物;其中所述胱天蛋白酶原活化化合物為式(fx1)或(fx11)化合物。在一個實施方案中,還提供了一種治療癌細胞的方法,包括(a)鑒別對以胱天蛋白酶原活化化合物進行的癌細胞治療的潛在易感性;和(b)使所述癌細胞暴露于有效量的所述胱天蛋白酶原活化化合物;其中所述胱天蛋白酶原活化化合物為式(fx1)或(fx11)化合物,其中所述胱天蛋白酶原活化化合物能夠活化胱天蛋白酶原-3和胱天蛋白酶原-7中的至少一個。在一個實施方案中,還提供了一種誘導癌細胞死亡的方法,包括將能夠活化所述癌細胞的胱天蛋白酶原-3分子的化合物給予所述癌細胞,其中所述化合物為式(fx1)或(fx11)化合物。在一個實施方案中,還提供了一種藥物,所述藥物包含有效量的一種或多種式(fx1)或(fx11)化合物。在一個實施方案中,還提供了一種制備用于治療癌細胞的藥物的方法,所述藥物包含一種或多種式(fx1)或(fx11)化合物。在一個實施方案中,還提供了一種誘導細胞凋亡的方法,包括將式(fx1)或(fx11)化合物給予所述細胞。還提供了一種如本文所述的方法,其中所述胱天蛋白酶原活化化合物的logbb為-0.4至-2。還提供了一種如本文所述的方法,其中所述式(fx1)或(fx11)化合物的logbb為-0.4至-2。還提供了一種如本文所述的方法,其中所述化合物不穿透血腦屏障至(例如)在患者體內引起可感知的神經毒性作用的程度。還提供了一種離體方法,包括使細胞與有效量的式(fx1)或(fx11)化合物接觸。還提供了一種處理細胞的方法,該方法包括使細胞與有效量的式(fx1)或(fx11)化合物接觸的步驟。還提供了用于治療的式(fx1)或(fx11)的化合物。還提供了式(fx1)或(fx11)的化合物或所述癌癥的治療。還提供了式(fx1)或(fx11)化合物用于制造治療癌癥的藥物的用途。在一個方面中,本發(fā)明化合物上的至少一個取代基為極性基團。在一個實施方案中,a為o。在一個實施方案中,r4和r5都為n。在一個實施方案中,m和n都為1。在一個實施方案中,x1、x2、x3、x4和x5都為c。在一個實施方案中,r6為h。在一個實施方案中,r7、r8和r9都為h。在一個實施方案中,r3為烯丙基。在一個實施方案中,r10和r14為h,r11、r12和r13各自為甲氧基。在一個實施方案中,r2x為-oh。在一個實施方案中,r3為甲氧基。在一個實施方案中,r3、r7、r8和r9之一為甲氧基。在一個實施方案中,r3、r7、r8和r9中的兩個為甲氧基。在一個實施方案中,r3、r7、r8和r9中的三個為甲氧基。在一個實施方案中,r10、r11、r12、r13和r14之一為甲氧基。在一個實施方案中,r10、r11、r12、r13和r14中的兩個為甲氧基。在一個實施方案中,r10和r13為甲氧基。在一個實施方案中,r10、r11、r12、r13和r14中的三個為甲氧基。在一個實施方案中,r10、r11、r12、r13和r14中只有一個不為氫。在一個實施方案中,r11、r12、r13和r14中只有一個不為氫。在一個實施方案中,r11或r12不為氫。在本發(fā)明的一個方面中,本文所述和所示的任何式的化合物都以熒光標記物進行標記。對本發(fā)明的化合物和方法使用熒光標記物使得可追蹤所需系統(tǒng)中的所述化合物,確定所述化合物濃度,并且如本領域已知,具有其它用途。具體熒光標記物的種類、使用、合成和選擇在本領域普通技術人員的技術水平內。在一個具體實施方案中,所述熒光標記物為alexafluor350。本文意欲包括和公開其它熒光標記物,就如其被逐一列舉一樣。在本發(fā)明的一個方面中,本發(fā)明的化合物穿透血腦屏障的量不足以引起將需要停止治療的量的神經毒性或其它副效應。在本發(fā)明的一個方面中,例如,本發(fā)明的化合物的logbb為-0.4至-2。在本發(fā)明的一個方面中,本發(fā)明的化合物可誘導癌細胞的細胞死亡。在本發(fā)明的該方面的實施方案中,本發(fā)明的化合物可誘導淋巴瘤、白血病、黑素瘤、宮頸癌和乳腺癌細胞的細胞死亡。如“極性基團”在本領域中所用的,本文使用的該術語包括至少一個至少部分極性的鍵。極性基團含有至少一個具有偶極矩的鍵。如“極性基團”在本領域中所用的,本文使用的該術語可包括作為整個化學“基團”一部分的極性基團。本文使用的氨磺?;鶊F具有結構:其中ra和rb各自獨立地為氫、c1-c6烷基和c1-c6烷氧基;r18和r19各自獨立地選自氫和c1-c6烷基;q為0至6的整數(shù)。在一個實施方案中,ra和rb各自為氫。本文使用的磺?;薪Y構:-so2-。在一個實施方案中,所述磺?;鶠榫哂薪Y構的芳基磺?;囊徊糠郑浩渲衦16和r17各自獨立地選自氫和c1-c6烷基,其中所述芳基可任選地在環(huán)上被一個或多個雜原子取代并且可任選地被一個或多個鹵原子、硝基、c1-c6烷基和c1-c6烷氧基取代,p為0至6的整數(shù)?;酋;梢匀魏魏线m的取代基(例如氫或c1-c6烷基)封端。本文使用的烯丙基是指烯基-ch2-ch=ch2。本文使用的硝基含有結構-no2。在一個實施方案中,硝基可為烷基硝基的末端基團,其中一至六個任選被取代的亞甲基在硝基官能團之前。本文使用的羧基含有結構:-cooh。在一個實施方案中,羧基由c1-c6烷基替代氫而封端。附圖說明圖1顯示了胱天蛋白酶原-3的小分子活化的一些方面。圖2顯示了pac-1選擇性殺死多種癌細胞。圖3顯示了pac-1阻滯小鼠異種移植癌癥模型中的腫瘤生長。圖4顯示了pac-1阻滯小鼠體中的腫瘤生長。圖5顯示了pac-1可緩解zn2+對胱天蛋白酶原-3的抑制。正如通過裂解ac-devd-pna底物所評價的,鋅抑制體外胱天蛋白酶原-3(d9a/d28a/d175a)突變體(d3a,2.5μm)活性的能力在存在pac-1(50μm)的情況下被降低。所示數(shù)據(jù)代表三次試驗。圖6顯示了,在含有10μmznso4的緩沖液中測定時,pac-1可增強胱天蛋白酶原-3(d9a/d28a/d175a)(d3a)突變體的活性。圖7顯示了,在含有10μmznso4的緩沖液中測定時,pac-1-i-8可增強胱天蛋白酶原-3(d9a/d28a/d175a)(d3a)突變體的活性。圖8顯示了,將znso4滴定至pac-1的溶液(50μm在50mmhepes、100mmkno3、ph7.2緩沖液中)可引起pac-1的uv-可見光譜的變化。所示的是以5μm的增量由0至75μm的znso4濃度。圖9顯示了,用連續(xù)變化方法分析pac-1-zn2+結合相互作用和進行化學計量?;诜逯档奈恢?,確定化學計量為1∶1,確定kd為42nm。誤差棒代表平均值的標準偏差。圖10顯示了,將znso4滴定至pac-1-i-8的溶液(50μm,在50mmhepes、100mmkno3、ph7.2緩沖液中)不引起pac-1-i-8的uv-可見光譜的變化。圖11顯示了由改變pac-1-ii-7濃度引起的細胞死亡百分數(shù)。圖12顯示了由改變pac-1-iv-3濃度引起的細胞死亡百分數(shù)。圖13顯示了pac-1-ii-6的鋅結合。圖14顯示了共焦顯微術研究的結果。圖15顯示了pac-1-zn2+復合物的最低能量構象異構體。圖16顯示了體外表征s-pac-1。a)pac-1和s-pac-1的結構。b)zn2+:s-pac-1復合物的形成曲線。s-pac-1以46±5nm的kd結合鋅。c)s-pac-1在體外活化胱天蛋白酶原-3d3a。將濃度10μm的未切割的胱天蛋白酶原-3(d3a)在存在15μm外源鋅的情況下孵育。加入50μms-pac-1在最初五分鐘過程中導致活性快速增加,之后在隨后的60分鐘中緩慢增加。d)s-pac-1可誘導u-937細胞的凋亡。將u-937細胞與50μms-pac-1孵育12小時,通過膜聯(lián)蛋白v/pi染色進行分析。圖17顯示了s-pac-1的特征。a)對小鼠腹膜內給藥的s-pac-1的藥代動力學。將c57/bl6小鼠用125mg/kg溶解于2-羥丙基-b-環(huán)糊精的s-pac-1經過腹膜內給藥進行處理。在不同的時間將小鼠處死并抽血。血清中s-pac-1的濃度通過lc確定。125mg/kg的s-pac-1具有約170μm的血漿濃度峰值和約1小時的半衰期。b)研究用獵狗中單劑量s-pac-1的藥代動力學。對四只獵狗靜脈給予單劑量的s-pac-1(25mg/kg在2-羥丙基-β-環(huán)糊精中),在不同時間抽血,并通過lc確定血清的s-pac-1濃度。s-pac-1在狗中具有約150μm的血漿濃度峰值和約3小時的半衰期。c)對三只健康的獵狗連續(xù)輸注給予s-pac-1。狗在10分鐘的時間內接受初始負荷劑量,之后在接下來的24小時內恒速輸注。在不同時間點抽血并通過lc分析確定血漿中s-pac-1濃度。s-pac-1的連續(xù)輸注被很好地耐受,并且在狗中成功確立了穩(wěn)態(tài)的s-pac-1血清濃度。圖18顯示了帶有淋巴瘤的狗中的s-pac-1的藥代動力學。對參加臨床試驗的狗給予7mg/kg的負荷劑量和3mg/kg/hr的恒速輸注24(a-c)或72(d-e)小時。在不同時間點抽血并通過lc分析確定s-pac-1的血清濃度。圖19顯示了s-pac-1處理的抗腫瘤效果。上圖)在7周時間內患者1的recist分值。箭頭指示治療天數(shù)。在處理過程中,患者1出現(xiàn)了recist分值降低27%。處理結束后,腫瘤尺寸迅速增大(第42天)。下圖)下頜淋巴結(顯示輪廓)的ct掃描顯示,在處理之前(第0天)和給予s-pac-1一周后(第7天)腫瘤尺寸的顯著減小。圖20顯示了代表性的egta熒光滴定測定數(shù)據(jù),其中s-pac-1-zn:kd=46±5nm。具體實施方式一般而言,本文使用的術語和短語具有其領域認可的含義,其可參見于本領域技術人員已知的標準的教科書、期刊參考文獻和上下文。應用以下縮寫。iap,凋亡抑制劑;pac-1,胱天蛋白酶原活化化合物1;parp,聚(adp-核糖)聚合酶。提供以下定義以闡明其在本發(fā)明的上下文中的具體用法。本文使用的術語“化學治療試劑”是指任何能夠減小或防止癌細胞、癌細胞群、腫瘤或其它惡性組織的生長、增殖或擴散的物質。該術語還意在包括任何抗腫瘤或抗癌試劑。本文使用的術語“有效量”意在包括諸如藥用有效量或治療有效量的范圍。例如,在一些實施方案中,該量能夠實現(xiàn)有利狀態(tài)、有利結果、篩選測定中的功能活性或者臨床狀態(tài)改善。本文使用的術語“癌細胞”意在包括本領域中廣義理解的定義。在一個實施方案中,該術語是指被異常調節(jié)的細胞,其會導致人或動物中的癌癥臨床病癥。在一個實施方案中,該術語可以指人或動物中的細胞系或細胞或者來自人或動物的培養(yǎng)的細胞系或細胞。癌細胞可為各種各樣分化的細胞、組織或器官類型,這是本領域中可理解的。術語“烷基”是指支化或非支化的飽和烴鏈(優(yōu)選具有1至22個碳原子)的單價團(monoradical)和含有一個或多個環(huán)的環(huán)烷基(具有3至22個碳原子)。短烷基為含有1至6個碳原子的烷基,包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基,包括所有其異構體。長烷基為含有8-22個碳原子的烷基,優(yōu)選含有12-22個碳原子的烷基、含有12-20個碳原子的烷基和含有16-18個碳原子的烷基。術語“環(huán)烷基”是指具有單環(huán)或多個稠環(huán)的3至22個碳原子環(huán)烷基。環(huán)烷基包括具有3-8元環(huán)的環(huán)烷基和具有5和6元環(huán)的環(huán)烷基。環(huán)烷基包括例如單環(huán)結構,例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)辛基等,或多環(huán)結構,例如金剛烷基等。術語“烯基”是指支化或非支化的不飽和烴基團(優(yōu)選具有2至22個碳原子)的單價團和含有一個或多個環(huán)的環(huán)烯基(具有3至22個碳原子),其中至少一個環(huán)包含雙鍵。烯基可含有一個或多個雙鍵(c=c),其可為綴合的。優(yōu)選的烯基為具有1或2個雙鍵的烯基。短烯基為具有2至6個碳原子的烯基,包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基,包括所有其異構體。長烯基為具有8-22個碳原子的烯基,優(yōu)選具有12-22個碳原子的烯基、含有12-20個碳原子的烯基和具有16-18個碳原子的烯基。術語“環(huán)烯基”是指具有單環(huán)或多個稠環(huán)的3至22個碳原子的環(huán)狀烯基,其中至少一個環(huán)含有雙鍵(c=c)。環(huán)烯基包括例如單環(huán)結構,例如環(huán)丙烯基、環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)辛烯基、環(huán)辛二烯基和環(huán)辛三烯基。術語烯丙基表示烯基-ch2-ch=ch2。術語“炔基”是指不飽和烴的單價團,優(yōu)選具有2至22個碳原子并且具有一個或多個三鍵(c≡c)。炔基包括乙炔基、炔丙基等。短炔基為具有2至6個碳原子的炔基,包括所有其異構體。長炔基為具有8-22個碳原子的炔基,并且優(yōu)選具有12-22個碳原子的炔基、具有12-20個碳原子的炔基和具有16-18個碳原子的炔基。術語“芳基”是指含有6至22個碳原子的不飽和芳香族碳環(huán)基團的基團,具有單環(huán)(例如苯基)、一個或多個環(huán)(例如聯(lián)苯)或多個稠環(huán),其中至少一個環(huán)是芳香族的(例如萘基、二氫菲基、芴基或蒽基)。芳基包括苯基、萘基等。芳基除包含不飽和芳環(huán)之外還可包含烷基、烯基或炔基的部分。術語“烷芳基”是指含有烷基部分的芳基,即-亞烷基-芳基和-被取代的亞烷基-芳基。這類烷芳基例如芐基(-ch2-苯基)、苯乙基等。如本文所述,烷基、烯基、炔基和芳基任選地是被取代的(所述術語可包括被取代的變體)并且可包含1-8個非氫取代基,取決于所述基團中碳原子的數(shù)目和所述基團的不飽和程度。本文所述的所有這些變化可以是非取代的(其中任何可為氫的可變化基團都為氫)或者被一個或多個選自以下的非氫取代基取代:鹵素(包括氟、氯、溴或碘)、c1-c3鹵代烷基、羥基(oh)、巰基(hs-)、c1-c6烷基、c1-c3烷基、c1-c6烷氧基、c1-c3烷氧基、苯基、芐基、烯基、c2-c4烯基、炔基、c2-c4炔基、-nh2、-nr’h、-nr’r”、r’co-、r’r”nco-、r’co-nh-或r’co-nr’-,其中r’和r”為c1-c6烷基、c1-c3烷基或苯基。術語“氨基”是指基團-nh2或基團-ne’r”,其中各r’和r”獨立地選自氫、烷基或芳基。烷氧基為已通過鍵合于氧而被修飾的烷基,可由式r-o代表,也可稱為烷基醚基團。烷氧基的實例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和庚氧基。烷氧基包括其中所述基團的烷基部分被取代的取代烷氧基,這在本文有關烷基的描述中提供。本文使用的meo-是指ch3o-。“鹵代烷基”是指被一個或多個相同或不同的本文定義的鹵基團取代的本文定義的烷基。代表性的鹵代烷基包括例如三氟甲基、3-氟十二烷基、12,12,12-三氟十二烷基、2-溴辛基、3-溴-6-氯庚基等。術語“鹵”或“鹵素”是指鹵素基團,例如氟(-f)、氯(-cl)、溴(-br)、碘(-i)或砹(-at)。術語“雜芳基”是指在至少一個環(huán)(如果有多于一個環(huán))中具有1至4個選自氧、氮和硫的雜原子的2至22個碳原子芳香基。雜芳基可任選是被取代的。雜芳基尤其包括具有5和6元環(huán)的雜芳基以及環(huán)中具有一或兩個氮的雜芳基、環(huán)中有一或兩個氧的雜芳基和環(huán)中有一或兩個硫的雜芳基。術語“雜環(huán)”或“雜環(huán)的”是指具有單環(huán)或多個稠環(huán)的飽和或不飽和基團的單價團,有2-22個碳原子并且在至少一個環(huán)中有1至6個雜原子,優(yōu)選1至4個雜原子,所述雜原子選自氮、硫、磷和/或氧。雜環(huán)基團可以是被取代的。環(huán)優(yōu)選地具有3-10個成員,更特別地具有5或6個成員。術語“酯”是指如本領域中理解的化學實體,特別是可包括(rco-)形式的基團。至于含有一個或多個取代基的任何上述基團,應理解,這類基團不含空間上(sterically)不切實際和/或合成上不可行的任何取代或取代形式。本發(fā)明的化合物包括對所公開化合物的取代所產生的所有新立體化學異構體。如本領域中常規(guī)和公知的,本文所述式中的氫原子并不總是明確地顯示出,例如,連接于芳環(huán)和脂環(huán)的碳原子的氫原子并不總是明確地顯示于式中。本文提供的結構,例如在描述所述式的上下文中,意欲向本領域技術人員表達本發(fā)明的方法和組合物的化合物的化學組成,并且如本領域技術人員可理解的,所提供的結構未顯示這些化合物的原子之間的具體鍵角。應注意,除非上下文另外明確指出,本說明書和所附權利要求述中使用的單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”包括復數(shù)的提及物。因此,例如,提及“一個細胞”包括多個此類細胞和本領域技術人員已知的其等價物,等等。另外,術語“一”、“一或多”和至少“一”在本文中可互換使用。還應注意,術語“包含”、“包括”和“具有”可互換使用。表述“權利要求xx-yy的任一項的”(其中xx和yy表示權利要求編號)意在提供多個替換形式的從屬權利要求,并且在一些實施方案中可與術語“如權利要求xx-yy任何一項中的”互換。除非另外定義,本文使用的所有技術術語和科學術語具有與本發(fā)明所屬
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:中普通技術人員通常理解的含義相同的含義。盡管類似或等價于本文所述方法和材料的任何方法和材料都可用于實施或測試本發(fā)明,下面將描述優(yōu)選的方法和材料。本文中任何信息都不應解釋為由于這些公開內容在發(fā)明之前而本發(fā)明不能早于這些公開內容。在一些實施方案中,脂質體或微團可用作所述組合物的載體或運載體。除非另外聲明,本文所述或示例組分的每種制劑或結合物都可用于實施本發(fā)明??蓪⒈景l(fā)明的組合物、制品和制劑配制成用于腸內給藥、腸胃外給藥、局部給藥、氣霧劑給藥、吸入給藥或皮膚給藥的診斷或治療組合物。所述組合物、制品和制劑的局部或皮膚送遞也可包括氣霧劑、乳劑、凝膠劑、溶液劑等。本發(fā)明的組合物、制品和制劑以可有效實現(xiàn)所需診斷和/或治療效果的劑量給藥。這類劑量可以在寬的范圍內變化,取決于所述組合物中應用的具體組成、需要檢查的器官或組織、臨床操作中應用的設備、達到的治療效力等。這些組合物、制品和制劑含有有效量的所述組合物,以及適合于預計給藥類型的常規(guī)藥用載體和賦形劑。這些組合物、制品和制劑也可任選地包括穩(wěn)定劑和皮膚滲透增強劑?!盎颊摺被颉笆茉囌摺保诒疚闹械韧褂?,是指動物。具體而言,動物是指哺乳動物,優(yōu)選人。受試者可以:(1)患有通過給予本發(fā)明化合物或組合物可診斷、預防和/或治療的病癥;或者(2)易感通過給予本發(fā)明化合物或組合物可診斷、預防和/或治療的病癥。在一個實施方案中,本發(fā)明的組合物為化學治療劑。在一個實施方案中,本發(fā)明提供了涉及有效濃度(優(yōu)選約10nm至約100μm)的所公開結構式的化合物和方法。在另一個實施方案中,所述有效濃度為約200nm至約5μm。在一個實施方案中,所述有效濃度被認為是這樣一個值,例如在直接胱天蛋白酶原活化測定中、在細胞凋亡誘導測定中或者在動物臨床治療評價中50%活性濃度。在一個優(yōu)選的實施方案中,該值少于約200μm。在一個優(yōu)選的實施方案中,該值少于約100μm。本發(fā)明的化合物和可用于本發(fā)明方法中的化合物包括具有所公開式的化合物和這些化合物的酯,優(yōu)選包括可藥用的鹽和酯。在一個實施方案中,本發(fā)明提供了前藥形式的組合物。本發(fā)明化合物的前藥可用于本發(fā)明的方法中??稍隗w內被轉化以提供生物活性、藥用活性或治療活性形式的本發(fā)明化合物的任何化合物都是前藥。前藥的多種實例和形式是本領域中熟知的。生物分子(例如前體蛋白或前體核酸)可為前藥。前藥的實例見于,尤其是designofprodrugs,editedbyh.bundgaard,(elsevier,1985),methodsinenzymology,vol.42,atpp.309-396,editedbyk.widder,etal.(academicpress,1985);atextbookofdrugdesignanddevelopment,editedbykrosgaard-larsenandh.bundgaard,chapter5,“designandapplicationofprodrugs,”,h.bundgaard,atpp.113-191,1991);h.bundgaard,advanceddrugdeliveryreviews,vol.8,p.1-38(1992);h.bundgaard,etal.,journalofpharmaceuticalsciences,vol.77,p.285(1988);andnogrady(1985)medicinalchemistryabiochemicalapproach,oxforduniversitypress,newyork,pages388-392)。在一個實施方案中,本發(fā)明的組合物為分離或純化的形式。應認識到,不管本文中認為或公開的任何機理解釋或設想最終正確與否,本發(fā)明的實施方案都是可實施且有用的。當本文公開一組取代基時,應理解該組和所有亞組的所有單個成員(包括組成員的任何異構體和對映異構體)都分別被公開。當本文使用馬庫什組或其它分組時,所述組的所有單個成員和組的所有可能組合和亞組合都意在被單獨地包括在本公開內容中。發(fā)明人預計本說明書中提供的任何馬庫什組或列表的任一個或多個成員都可根據(jù)需要從本發(fā)明中排除。當在本文中描述一種化合物使得所述化合物的一種具體異構體或對映異構體未被以例如式或以化學名給出時,該描述意在包括單獨或以任何組合形式描述的化合物的每種異構體和對映異構體。此外,除非另外說明,否則本公開內容意在包括本文中公開的化合物的所有同位素變體。例如,應理解,所公開的分子中的任一個或多個氫都可以氘或氚替代。分子的同位素變體通??捎米鳒y定所述分子的標準物以及可用在與該分子或其用途相關的化學和生物研究中?;衔锏木唧w名稱旨在示例,因為已知本領域普通技術人員可以不同名稱命名相同的化合物。本文公開的分子可包括一個或多個可電離的基團[可從其上除去質子的基團(例如-oh、-cooh等)或加入質子的基團(例如胺)或者可被季銨化的基團(例如胺)]。這類分子及其鹽的所有可能離子形式都意在被單獨地包括在本公開內容中。就本文的化合物的鹽而言,本領域普通技術人員可在大范圍的可獲得的抗衡離子中,選擇適合于制備本發(fā)明的鹽的抗衡離子以用于所給定的應用。例如,通常任何陰離子都可用于形成本文的化合物的鹽;例如鹵素、硫酸根、羧酸根、乙酸根、磷酸根、硝酸根、三氟乙酸根、乙醇酸根、丙酮酸根、草酸根、蘋果酸根、丁二酸根、富馬酸根、酒石酸根、檸檬酸根、苯甲酸根、甲磺酸根、乙磺酸根、對甲苯磺酸根、水楊酸根等。本發(fā)明的化合物及其鹽或酯可以以其互變異構體的形式存在,其中使氫原子換位至所述分子的其它部分并且所述分子的原子之間的化學鍵相應地重排。應理解,所有互變異構體形式,在其可存在的范圍內,都包括在本發(fā)明中。另外,所述化合物可具有反式和順式異構體,并且可含有一個或多個手性中心,因此以對映異構和非對映異構的形式存在。除非本文另外聲明,本發(fā)明可包括所有這類異構體、單個的對映異構體,以及順式和反式異構體的混合物、非對映異構體的混合物;對映異構體的非外消旋和外消旋混合物(光學異構體);和富含一種或多種形式的上述混合物。當不具體提及化合物(或不對稱碳)的構型(順式、反式,或者r或s)時,則意在指多于一種異構體的任一種異構體或混合物。制備過程可使用外消旋體、對映異構體或非對映異構體作為原料。在制備對映異構體或非對映異構體產物時,它們可用常規(guī)方法分離,例如通過色譜法或分級結晶。本發(fā)明化合物可為游離形式或水合物形式。除非另外聲明,本文描述或示例的組分的每種制劑或結合物都可用于實施本發(fā)明。每當在本申請中描述范圍時,例如溫度范圍、時間范圍、logbb或者組成或濃度范圍,所有居間范圍和亞范圍以及所有包括在所給范圍內的單個值都意在被包括在本公開內容中。本文公開的任何參考文獻中的信息在一些情況下可表明現(xiàn)有技術狀態(tài),例如在其有效提交日期提交的專利文獻;發(fā)明人意欲根據(jù)需要將這些信息應用于本文以排除確實在現(xiàn)有技術中出現(xiàn)的具體實施方案。例如,當化合物被公開和/或要求保護時,應理解,相對于本發(fā)明界定為現(xiàn)有技術的化合物,包括參考文獻中公開的化合物,都不欲包括在本發(fā)明主題權利要求的組合物中。本文提供的一些參考文獻通過引用的方式納入,以提供有關本發(fā)明的原料來源、其它原料、其它試劑、其它合成方法、其它分析方法和其它用途的細節(jié)?;诒绢I域中的知識,本領域普通技術人員會理解具體示例以外的原料、試劑、固體底物、合成方法、純化方法和分析方法均可應用于實施本發(fā)明而不需要借助過多實驗。通過以下非限制性實施例可進一步理解本發(fā)明。實施例1.pac-1和個性化抗癌療法如本文進一步討論的,凋亡是多細胞生物中常見的程序性細胞死亡類型。逃避凋亡是癌癥的一個標志,許多癌癥可抗天然凋亡信號。這種抗性最常是由于上游凋亡蛋白的異常表達和突變,這可阻止促凋亡信號向下游的半胱氨酸-天門冬氨酸蛋白酶——胱天蛋白酶的正常傳輸。最終,執(zhí)行者胱天蛋白酶-3的活化是大多數(shù)凋亡途徑中主要的關鍵步驟。令人驚奇地,在許多癌癥中胱天蛋白酶原-3被上調,但上游凋亡級聯(lián)的變化可防止其被活化。許多促凋亡化合物已被開發(fā)來靶向胱天蛋白酶-3上游的凋亡蛋白。然而,上述障礙通常會阻止這些化合物在癌細胞中發(fā)揮其所需的促凋亡效應。一種個性化的且更有效的抗癌策略涉及對所述級聯(lián)中任何障礙物下游的促凋亡蛋白的直接活化。圖1顯示了胱天蛋白酶原-3的小分子活化的一些方面。本發(fā)明人已報道了pac-1是這樣的小分子,即其在體外和許多癌細胞系內直接將胱天蛋白酶原-3活化成胱天蛋白酶-3,誘導癌細胞凋亡(nat.chem.biol.2006,2,543-550)。pac-1還在多種小鼠癌癥模型中被證明具有效力。上游凋亡蛋白的突變和異常表達可阻止促凋亡信號到達下游效應物——胱天蛋白酶。在許多癌癥中關鍵執(zhí)行者胱天蛋白酶原-3被上調。為了尋找能夠直接活化胱天蛋白酶原-3的小分子,已付出了許多努力。其中一些努力在本文中進行了描述,進一步作為本發(fā)明的
背景技術:
:。方案1顯示了胱天蛋白酶原-3活化劑的示例性高通量篩選。λ最大=405nm方案1以發(fā)色底物篩選約20000種化合物目的是篩選它們將胱天蛋白酶原-3活化成活性胱天蛋白酶-3的能力。pac-1被鑒定為能夠以劑量依賴的方式活化胱天蛋白酶原-3的化合物。pac-1-i-8為顯示無活性的結構相關的化合物。圖2顯示了pac-1可選擇性殺死癌細胞。pac-1可誘導分離自剛切除的結腸腫瘤的細胞死亡。剛切除的原代結腸腫瘤(和鄰近的非癌組織一起)取自23個人,將癌組織和非癌組織分離。pac-1以與胱天蛋白酶原-3的細胞濃度成比例的方式誘導細胞死亡。圓圈代表取自23個結腸腫瘤的原代癌細胞。黑三角代表多種癌細胞系。菱形為四種非癌細胞類型:hs888lu(肺成纖維細胞)、mcf-10a(乳腺成纖維細胞)、hs578bst(乳腺上皮細胞)和分離自健康供體骨髓的白細胞。方形為分離自所述23個人的腫瘤邊緣的原代非癌細胞。圖3和4顯示了癌癥的小鼠異種移植模型中腫瘤生長的pac-1阻滯(putt,etal.nat.chem.biol.2006,2,543-550)。對于圖3,使用nci-h226(肺癌)細胞系通過皮下注射在小鼠中形成腫瘤,每組八只小鼠,每只小鼠三個腫瘤。通過口服管飼法在第1-21天每天一次給予pac-1或載體。誤差棒為s.e.m。對于圖4,以nci-h226細胞系注射小鼠。依照putt,etal.nat.chem.biol.2006,2,543-550中描述的方案,以pac-1(100mgkg-1)經口服管飼法處理所述小鼠。對照小鼠的肺有大量灰色腫瘤塊,而接受了pac-1的小鼠幾乎沒有可見的腫瘤。已知鋅離子可抑制胱天蛋白酶原-3。pac-1在存在鋅的情況下能夠以劑量依賴的方式活化胱天蛋白酶原-3,并且改變鋅抑制的ic50。pac-1-i-8不能活化胱天蛋白酶原-3,但在高濃度下顯示出抑制作用。圖5、6和7顯示,pac-1可緩解zn2+對胱天蛋白酶原-3的抑制。檢查了鋅的濃度范圍對胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶原-3酶活性的效應。將所有緩沖劑都首先以樹脂處理以除去任何痕量的金屬污染物。因為胱天蛋白酶原-3本身會緩慢自蛋白水解成有活性的胱天蛋白酶-3,制備了胱天蛋白酶原-3的三突變體,其中所有三個胱天蛋白酶切割部位都被除去(d9a/d28a/d175a)。與文獻中的數(shù)據(jù)一致,所述胱天蛋白酶原-3的三突變體是蛋白水解穩(wěn)定的,具有比胱天蛋白酶-3的活性低約200倍(數(shù)據(jù)未顯示)。存在鋅的情況下的酶測定表明,該金屬可強烈地抑制胱天蛋白酶-3(數(shù)據(jù)未顯示)、胱天蛋白酶原-3(數(shù)據(jù)未顯示)和胱天蛋白酶原-3(d9a/d28a/d175a)突變體(圖5)。圖6顯示了當在含有10μm的znso4的緩沖液中測定時,pac-1可增強胱天蛋白酶原-3(d9a/d28a/d175a)(d3a)突變體的活性。如所示,pac-1在高化合物濃度下實際上可抑制這三種酶。圖7顯示了,當在含有10μm的znso4的緩沖液中測定時,pac-1-i-8可增強胱天蛋白酶原-3(d9a/d28a/d175a)(d3a)突變體的活性。pac-1-i-8在高化合物濃度下實際上可抑制這種酶,甚至在不存在znso4的情況下也是如此。圖8、9和10顯示了,pac-1為一種金屬螯合劑。在存在鋅的情況下,pac可顯示405nm下吸光度的特征性增加。無活性衍生物甚至在高鋅濃度下也未顯示任何吸光度變化。使用這種吸光度偏移,pac-1:zn2+復合物的結合常數(shù)可通過連續(xù)變化法確定。如圖8中所示,以漸增量的znso4滴定pac-1可導致該化合物的uv-可見光譜的變化。zn2+結合時的摩爾吸光度的這種偏移可提供一種便捷的方法來確定pac-1-zn2+結合的化學計量和該相互作用的離解常數(shù)。將所述連續(xù)變化方法的變化方案用于該確定。對于總濃度50μm的多種摩爾分數(shù)的znso4和pac-1獲得了410nm下的吸光度。然后,將這些值相對于被設為1的化學計量點處的可能最大吸光度值(即當所有zn2+都被過量pac-1結合時)標準化。應用所述連續(xù)變化方法揭示了pac-1可以1∶1化學計量結合zn2+,由圖9的曲線圖中0.5摩爾分數(shù)處的峰證明。從圖9還可明顯看出的是該小金屬-金屬相互作用的很強的性質。在1∶1的化學計量下,pac-1幾乎完全將其吸收值偏移至鋅結合狀態(tài)(在1∶1的pac-1-zn2+比例下,96%的pac-1結合于zn2+)。使用該96%值和方程logka=0.3010-logm+log最大y-2log(1-最大y),本發(fā)明人得到了kd=42nm的pac-1-zn2+相互作用。雖然pac-1-zn2+相互作用的kd為42nm時,如圖8中所示,使用微摩爾濃度的鋅仍然觀察到吸光度的變化。這是由于在該實驗中與kd相比的高總配體濃度(50μm)?;谠搶嶒炛惺褂玫匿\和pac-1的濃度,adair方程可預測在約30μm鋅下pac-1-zn2+復合物的半最大總體平均位占據(jù)率(halfmaximalpopulationaveragesiteoccupancy),與得到的數(shù)據(jù)一致(圖8)。將znso4滴定至pac-1-i-8中沒產生光譜變化(這通過uv-vis光譜法監(jiān)測),這與pac-1-8不結合zn2+的觀點一致。為確認該結果,使用第二種方法來確定pac-1-zn2+的離解常數(shù)。在該實驗中,將預先形成的pac-1和zn2+的復合物以egta[乙二醇二(p-氨基乙基醚)n,n’-四乙酸,一種金屬結合劑,已知對zn2+有親和力]滴定,并監(jiān)測410nm下的吸光度。用egta-zn2+締合常數(shù)的文獻值,本發(fā)明人計算出pac-1-zn2+的離解常數(shù)為55nm,大致與通過所述連續(xù)變化方法計算的42nm的kd相符。圖10顯示了,將znso4滴定至pac-1-i-8溶液(50μm在50nm的hepes、100mm的kno3、ph7.2緩沖液中)中不會導致pac-1-i-8的uv-可見光譜變化。所示的是以5μm的增量從0至70μm的znso4濃度。實施例2.pac-1和衍生物的合成分子建模形成了圖15中所示的pac-1-zn2+復合物的最低能量構象異構體。該結構是使用mmff力場對23種低能構象異構體進行構象搜索得到。該模型表明與n-?;旯羌艿南嗷プ饔谩⑴c酚羥基的相互作用和與芐基環(huán)的陽離子-pi相互作用。合成了結構改變的pac-1衍生物家族,以研究這些結構組分及其在鋅結合中的作用,以及該化合物家族的細胞毒性可能性。合成了四種類型的衍生物,以研究酚位置(i類)、芐基(ii類)、這些環(huán)的結合(iii類)和n-?;旯羌?iv類)。這些類型顯示于下文方案2中。方案2關于這些化合物和類型的另外的信息可見于:peterson,etal.,j.med.chem.2009,52,5721-5731。大多數(shù)i-iii類化合物是如方案3a所示經縮合合適的酰肼和醛進行合成。如方案3a所示,該縮合反應的產率在72與95%之間,1g是例外,其自發(fā)形成二硫化物二聚體,導致產率降低。通過這類縮合反應,合成了11個i類的衍生物(1a-k)、7個ii類的衍生物(2a-g)和1個iii類的衍生物(3)。方案1中的酰肼結構單元通過以下反應合成:多種芐基氯與哌嗪的反應,所得產物用氯乙酸乙酯的烷基化,之后所得酯與酰肼的反應。醛結構單元是市購的或者從簡單原料合成。也可通過類似的縮合反應合成三個iv類衍生物。因此,缺少兩個哌嗪氮中的一個的化合物(4a-c)是如方案3反應式1和2所示合成自相應的酰肼和醛。然而,iv類中許多衍生物不能經類似的縮合反應合成,需要另外的合成路徑。因此,化合物4d是通過使用nacnbh3還原pac-1中的腙來合成(方案4a反應式3)?;衔?e-g是通過27與合適的氯化物反應來合成(方案4a反應式4-6)。這些類型可探測這些環(huán)體系的電子學以及復合物中包含的配位雜原子。方案3:pac-1的合成改變兩個環(huán)上的取代基,i-iii類pac-1衍生物是用與方案3a中所示相同的路徑合成。方案3a.應注意到,針對該方案提供了“r”變量,用法不必與本公開內容剩余部分的用法相同。本公開內容通篇中所有這類變化都是本領域普通技術人員易于理解的。iv類化合物是如下所示經過稍微改變合成。方案4.iv類化合物的合成。一些其它的iv類化合物是使用方案4a中所示的方法合成。方案4a。這里提供了所述四類化合物的合成方法。材料——除非另外指出,所有試劑均購自fisher。所有緩沖液都用milliq純凈水制備。合成了ac-devd-pna。luria肉湯(lb)購自emd。依托泊苷(etoposide)購自sigma。胱天蛋白酶活性緩沖液含有50mm的hepes(ph7.4)、300mm的nacl并經處理。ninta結合緩沖液含有50mm的tris(ph8.0)、300mm的nacl和10mm的咪唑。ninta洗滌緩沖液含有50mm的tris(ph8.0)、300mm的nacl和20mm的咪唑。ninta洗脫緩沖液含有50mm的tris(ph8.0)、300mm的nacl和500mm的咪唑。膜聯(lián)蛋白v結合緩沖液含有10mm的hepesph7.4、140mm的nacl、2.5mm的cacl2、0.1%的bsa。c末端接6×his-標記的胱天蛋白酶原-3蛋白如下述進行表達。細胞培養(yǎng)物——u937人類淋巴瘤細胞和sk-mel-5人類黑素瘤細胞獲自atcc。細胞培養(yǎng)于補充有10%的fbs和1%的青霉素-鏈霉素的rpmi1640生長培養(yǎng)基中。將細胞于37℃下和5%的co2中孵育。sk-mel-5細胞的傳代培養(yǎng)是通過用0.05%的胰蛋白酶-edta(gibco)稀釋液胰蛋白酶消化細胞單層并進一步培養(yǎng)于如上所述補充有fbs和青霉素-鏈霉素的rpim1640生長培養(yǎng)基中而實現(xiàn)。細胞死亡測定——將u937人類淋巴瘤細胞以5000個細胞/孔的密度鋪板于96孔板孔中的200μl的rpmi生長培養(yǎng)基(含有10%的fbs和1%的青霉素-鏈霉素)中。以不同濃度向每個孔中加入2μl100×化合物的dmso儲液,使得以濃度為0μm至100μm的化合物處理所述細胞。各濃度均重復試驗五次。在各板中,加入10μm的依托泊苷的5個孔作為陽性對照,加入2μl的dmso的5個孔作為陰性對照。然后,于37℃下和5%的co2中將所述板孵育72小時。在72小時孵育期后,將這些板用如前所述的磺酰羅丹明b測定法進行分析。具體地,向板的每個孔中加入50μl的80%(w/v)tca水溶液,然后使板于4℃靜置過夜。然后將板用h2o流輕輕地洗滌五次,以除去過量tca和沉淀的血清蛋白。然后使板進行空氣干燥,之后將100μl含0.057%(w/v)磺酰羅丹明b的1%(v/v)乙酸溶液加入至各個孔,在室溫下染色30分鐘。在染色后,將所述孔用100μl的1%(v/v)乙酸輕輕洗滌5分鐘,除去未結合的染料。然后將所述板進行空氣干燥。然后將200μl的10mm的tris堿(ph10.5)加入至各個孔中,并將所述板置于軌道搖床上維持5分鐘。然后在分子動力學(moleculardynamics)板讀數(shù)儀中讀出510nm下的od,計算細胞死亡百分數(shù)并相對于陽性對照(100%細胞死亡)和陰性對照(0%細胞死亡)標準化。將各化合物濃度的細胞死亡百分數(shù)取平均,作圖為化合物濃度的函數(shù)。使用tablecurve2d將所述數(shù)據(jù)擬合于對數(shù)的劑量響應曲線,并計算ic50值。將實驗重復三次,記錄計算的ic50值的平均值。確定并記錄三次實驗的平均值的標準偏差(sem)。單個的劑量響應曲線未顯示。胱天蛋白酶原-3/胱天蛋白酶-3的重組表達和純化——準確如前述重組表達并純化胱天蛋白酶原-3和胱天蛋白酶-3。簡言之,胱天蛋白酶原-3和胱天蛋白酶-3是由phc332表達質粒在大腸桿菌(escherichacoli)的電感受態(tài)bl21(de3)菌株(novagen)中表達。將c末端帶6×his-標簽的蛋白使用ninta樹脂(qiagen)純化。將含有蛋白的級分收集并合并。通過將所述蛋白加入以樹脂處理的裝有胱天蛋白酶活性緩沖液(caspaseactivitybuffer)的pd-10柱(gehealthcare),將所述純化的蛋白進一步純化以除去任何污染的鋅。將所得的溶于胱天蛋白酶活性緩沖液中的不含鋅且含蛋白級分合并,測定濃度,將所述蛋白溶液在液氮中快速冷凍并在-80℃下保存。胱天蛋白酶-3活性測定——在胱天蛋白酶活性緩沖劑中制備不含鋅的胱天蛋白酶-3(1μm)的儲液(2×)。在胱天蛋白酶活性緩沖液中制備200μm至200nm的多種濃度化合物儲液(2×)。制備含有znso4(25μm)的胱天蛋白酶原活性緩沖液儲液(10×)。向384孔板的每個孔中加入20μl的胱天蛋白酶-3(最終500nm)、20μl化合物儲液和5μl的znso4(最終2.5μm)或緩沖劑。各個板都包括陽性對照孔(0μm的鋅且無化合物)和陰性對照孔(2.5μm的鋅且無化合物)。將這些板在室溫下孵育30分鐘。然后,向所述板的每個孔中加入5μl的2mm的ac-devd-pna底物的儲液,然后立即在spectramax板讀數(shù)儀(moleculardevices,sunnyvale,ca)上每1分鐘監(jiān)測405nm下的吸光度持續(xù)30分鐘。將各個孔的斜率用于確定活性,并相對于陽性對照孔和陰性對照孔標準化,以給出活性百分數(shù)。將各化合物濃度(4個孔)的數(shù)據(jù)取平均,并將活性百分數(shù)作圖為化合物濃度的函數(shù)。使用tablecurve2d分析所述數(shù)據(jù)并且擬合于對數(shù)劑量響應曲線。大部分化合物在10μm下達到最大活性。確定各化合物在10μm下的活性百分數(shù)并記作三次重復實驗的平均值和相應的sem。未顯示單獨的劑量響應曲線。egta熒光滴定測定——該滴定測定基于公開的方案。在滴定前,在比色皿中裝入edta(10mm)維持10分鐘,之后用無菌去離子水和丙酮洗滌,用于除去任何殘留的金屬離子。將pac-1或衍生物(60μm)加入至含有緩沖液(hepes:50mm,kno3:100mm,ph7.2)和egta(7.3mm)的比色皿中,以達到10倍稀釋(pac-1終濃度:6μm)。漸增地加入zn(otf)2(0-10mm)。zn-pac-1(或衍生物)復合物的形成是通過熒光強度的增加(ex/em:410nm/475nm)來監(jiān)測。將475nm下的熒光強度相對于使用maxchelator程序計算的游離zn濃度([zn]f/m)作圖。使用kaleidagraph分析所述數(shù)據(jù)并擬合于基于由公開方案衍生的eqs1的形成曲線。i=(i最小kd+i最大[zn]f)/(kd+[zn]f)其中i最小和i最大分別定義為游離探針(probe)(在此情況下為pac-1或衍生物)和zn-探針復合物的熒光強度。免疫熒光染色——通過將圓的18mm的1號硼硅蓋玻片(vwr)在聚賴氨酸溶液中(sigma)搖晃1小時,然后以milliq洗滌來用聚賴氨酸涂布所述蓋玻片。將sk-mel-5人類黑素瘤細胞在12孔板底的聚賴氨酸涂布蓋玻片上培養(yǎng)。當細胞達到約80%匯合時,將所述細胞以dmso或100μmpac-1的dmso溶液(總dmso<1%)處理1小時。然后將所述細胞以1ml的pbs洗滌兩次。并于室溫下在3.7%甲醛的pbs溶液中固定10-15分鐘。然后將所述細胞以pbs再洗滌兩次,然后以0.1%tritonx-100的pbs溶液透化5分鐘。然后將所述細胞放在3%bsa的pbs溶液中封閉10分鐘并以1∶500的兔抗胱天蛋白酶原-3的抗體孵育1小時。然后將所述蓋玻片以pbs洗滌五次,并以抗兔alexafluor647綴合的第二抗體的1∶1000稀釋液避光孵育20分鐘。將所述蓋玻片以pbs再洗滌五次并以milliqh2o洗滌一次。然后使用fluorosave(calbiochem)將所述蓋玻片固定在載玻片上,并于黑暗中保存直至進行成像。將細胞在leicasp2多光子共聚焦顯微鏡上成像?;罴毎上瘛獙k-mel-5細胞培養(yǎng)于1號硼硅生長室(nunc)的底部,至約80%的匯合。然后將細胞在37℃下和5%的co2中以dmso、25μm的fam-devd-fmk的dmso溶液、25μm的af350-pac-1的dmso溶液,或者25μm的fam-devd-fmk和25μm的af350-pac-1二者同時處理1小時。然后將細胞以不含酚紅的rpmi1640生長培養(yǎng)基洗滌5次。然后在成像前將所述細胞于37℃下再孵育2小時。對于用于核染色的sybr綠染色的細胞,加入在培養(yǎng)基中1∶100000稀釋的sybr綠,然后立即進行成像。使細胞在leicasp2多光子共聚焦顯微鏡上成像。圖像分析——為了清楚起見調節(jié)圖像的亮度和對比度。在圖像中,使用imagej調節(jié)紅色通道以反映10與28之間的線性強度梯度。對于綠色通道,將所述圖像調節(jié)至0與44之間的線性強度梯度。為補償顯微鏡的光學偏移,在x方向手動偏移紅色通道5個像素,在y方向手動偏移綠色通道6個像素。將所述圖像以半徑1個像素的高斯模糊(gaussianblur)過濾以提高信噪比。使用imagej插件jacopo,以manders重疊系數(shù)確定重疊%。pac-1衍生物的凋亡誘導——將u937細胞(1ml的1×106細胞/ml)以5μl的多種化合物的乙醇儲液(達到終濃度50μm)處理。將所述細胞于37℃下孵育12小時。將所述細胞離心(200g維持5分鐘),以pbs(2ml)洗滌,再懸浮于500μl的膜聯(lián)蛋白v結合緩沖劑中。向各個樣品中加入10μlfitc綴合的膜聯(lián)蛋白v染料(southernbiotech)和10μl的碘化丙啶(sigma)至終濃度50μg/ml。在bentondickinsonlsrii流式細胞儀上分析細胞群。材料和方法總述所有要求無水條件的反應都在經烘干的玻璃器皿中在氮氣或氬氣的正氣氛下進行。標準注射器技術用于液體的無水加入。干的四氫呋喃是通過使其穿過市售溶劑純化系統(tǒng)(innovativetechnologies)中的活化鋁柱或分子篩獲得。除非另外注明,否則所有原料、溶劑和試劑都市購自供應商并且不經進一步純化而直接使用??焖偕V法使用230-400目的硅膠進行。酰肼5、pac-1、1a、1h、3-烯丙基鄰羥基苯甲醛、2-巰基苯甲醛、23、30、44是根據(jù)經過改動的文獻方法制備?;衔锓治鏊胣mr實驗都用varianunity400mhz或500mhz的光譜儀在cdci3(sigma)、cd2od(sigma)或丙酮-d6(sigma)中記錄,以殘留的未氘化溶劑作為內參。記錄了化學位移δ(ppm);耦合常數(shù)j(hz);多峰性(s=單峰,d=雙峰,t=三重峰,q=四重峰,m=多重峰);和積分。高分辨質譜數(shù)據(jù)用伊利諾伊大學質譜實驗室(universityofillinoismassspectrometrylaboratory)的micromassq-tofultimahybridquadrupole/time-of-flightesi質譜儀記錄。所有熔點都未校正。分析型hplc在altimac18柱(2.1×20mm)上進行,流動相a為0.1%的tfa水溶液,b為乙腈,使用的梯度系統(tǒng)為經5分鐘從0%至45%的b,然后在5-10分鐘從45%至55%的b,然后在10-15分鐘從50%至100%的b,在15-20分鐘恒定為100%的b,在20-25分鐘從100%至0%的b。lc-ms在c18柱(2.1×5mm)上進行,流動相a為0.1%的tfa水溶液,b為乙腈,使用的梯度系統(tǒng)是在0-2分鐘恒定為0%的b,然后在2-5分鐘從0%至50%的b,然后在5-7分鐘從50%至100%的b,在7-8分鐘恒定為100%的b,在8-10分鐘從100%至0%的b。方案s1.pac-1衍生物的合成方案s2.4c的合成方案s3.4a-b的合成方案s4.4f-g的合成方案s5.2d和4e的合成實施例3.pac-1衍生物的評價圖11顯示了化合物i-ii-7緩解鋅介導的胱天蛋白酶-3抑制。圖12顯示了化合物i-iv-3緩解鋅介導的胱天蛋白酶-3抑制。這些圖表示三次獨立的劑量響應實驗。誤差棒代表各個數(shù)據(jù)點的平均值的標準誤差。圖13顯示了存在和不存在鋅的情況下化合物1-ii-6的吸收譜。在細胞培養(yǎng)物中和體外測定法中評價pac-1衍生物殺死癌細胞、體外活化胱天蛋白酶原-3和結合鋅的能力。活化胱天蛋白酶原-3的化合物通常在u937細胞中具有低ic50值。示例性的數(shù)據(jù)顯示于下表1-4中。細胞死亡的誘導是使用u-937(人類淋巴瘤)細胞系確定的。將u-937細胞以懸浮物形式培養(yǎng)。對于這些實驗,使細胞暴露于多個化合物濃度72小時,經過磺酰羅丹明b測定法來定量細胞死亡,從對數(shù)劑量相應曲線計算ic50值。從這些數(shù)據(jù)可看出,(1)不能結合鋅的pac-1衍生物在體外不活化胱天蛋白酶-3,并且不適于誘導所培養(yǎng)的u-937細胞死亡。該信息表明,pac-1的鋅結合能力對其細胞死亡誘導性質是重要的。(2)鄰-羥基n-酰基腙基序對于鋅結合是關鍵性的。(3)幾乎所有結合鋅的化合物都可在體外活化胱天蛋白酶-3并可誘導所培養(yǎng)的u-937細胞死亡。只有化合物i-iv-1和i-iv-2——它們顯示無體外胱天蛋白酶-3活化作用,但仍然對n-937細胞有細胞毒性——對于該趨勢是例外。值得注意的是,本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),這兩種化合物(在10μm濃度下)是胱天蛋白酶-3酶活性的相當強的抑制劑;因此,該化合物的任何活化效應都可被這種抑制作用所掩蓋。這種抑制效應與以前的數(shù)據(jù)一致,所述數(shù)據(jù)證明pac-1在高化合物濃度下也會抑制胱天蛋白酶原-3/胱天蛋白酶-3。表1.i類化合物表2.ii類化合物表3.iii類化合物表4.iv類化合物實施例4.共焦顯微術共焦顯微術是以熒光性pac-1進行,以研究細胞中pac-1的亞細胞定位,目的是確證pac-1通過結合zn2+殺死癌細胞。熒光形式的pac-1是通過將alexafluor350“接”至pac-1而合成,如方案5所示。方案5以上顯示的熒光標記的化合物af-pac-1在這些測定法中具有類似于pac-1的活性(對于u-937細胞的ic50=14.8(3.2μm;10μm下的胱天蛋白酶-3活化=6.3(1.6%且在50μm下=20(3%;鋅的kd=61(9nm)。圖14顯示了共焦顯微術研究的結果。af-pac-1與胱天蛋白酶-3/-7酶活性部位的共定位。以dmso處理的sk-mel-5細胞在紅色通道和綠色通道中都顯示背景水平的染色(在此為漸變灰色(ahadedgray))。僅以fam-devd-fmk處理的細胞未顯示任何高于背景水平的染色。僅以af-pac-1處理的細胞在細胞質中顯示小點狀染色(punctatestaining),在520nm下發(fā)射無增加。同時以af-pac-1和fam-devd-fmk處理的細胞顯示強胱天蛋白酶-3/-7活性的斑點(假著色)和af-pac-1的小點狀染色(假著色),其在合并圖像中顯示良好的共定位。實施例5.用狗進行的pac-1臨床試驗將pac-1與2-羥丙基-β-環(huán)糊精的制劑以較高的劑量給藥至動物。狗出現(xiàn)了急性神經毒性(共濟失調和癲癇)。對小鼠的進一步研究顯示在高劑量下出現(xiàn)類似的癥狀。據(jù)信pac-1可穿過血腦屏障(bbb)并螯合所述結合于nmda受體的抑制性鋅。結果是,合成并試驗了新化合物pac-ii-9。關于該化合物的進一步的信息在本文其它地方描述。表5.預測血腦屏障(bbb)穿透性初步結果初步動物研究表明,pac-1-ii-9被用于改善神經毒性問題。另外的化合物和logbb數(shù)據(jù)在表6中提供。表6實施例6.pac-ii-9(s-pac-1)可降低神經毒性誘導凋亡性細胞死亡是一種有前景的抗癌策略。凋亡級聯(lián)中的關鍵事件是胱天蛋白酶原蛋白水解活化成有活性的胱天蛋白酶——之后可切割數(shù)十種細胞底物的半胱氨酸蛋白酶。2006年報道了可增強胱天蛋白酶原-3的催化活性并誘導其自活化成胱天蛋白酶-3的小分子。稱為pac-1的這種化合物可誘導癌細胞的凋亡,并在作為脂質基制劑口服給藥或作為膽甾醇顆粒皮下植入時在鼠異種移植物模型下顯示抗腫瘤活性。這里報道了在小鼠中對pac-1(作為靜脈推注劑遞送)進行評價,并且這些研究表明高劑量的pac-1可誘導神經毒性?;谠摪l(fā)現(xiàn)和推測的神經毒性機理,設計、合成并評價了被稱為s-pac-1的pac-1衍生物。與pac-1類似,s-pac-1可活化胱天蛋白酶原-3并誘導癌細胞的凋亡性死亡;然而,其不誘導神經毒性,這是在小鼠和狗中評價的。在狗中建立了對s-pac-1的連續(xù)靜脈內輸注方案,使該化合物達到約15μm的穩(wěn)態(tài)血漿濃度達24小時。在一項小規(guī)模臨床試驗中,以s-pac-1評價了患有淋巴瘤的五只寵物狗。結果顯示,s-pac-1在這些患者中被很好地耐受,并且這些處理在5名患者的4名中誘導了部分消退或使疾病穩(wěn)定。在最近十年中,已證明了靶向治療作為個性化抗癌策略的可能性。這些方法利用了癌細胞中存在的特定蛋白,以相對于正常細胞賦予特異性(1)。這類“個性化”藥物可命中產生自染色體易位的靶(2)(用于bcr-abl融合蛋白的gleevec(e)),導致組成型活化的突變體形式的蛋白(iressa和egfr突變,(4)plx4032和突變體braf(5,6))或在癌細胞中過表達的蛋白(在下文進一步描述)。由于癌癥的標志物之一是抗凋亡(7-9),對于抗癌藥物的發(fā)現(xiàn)來說凋亡蛋白是特別有用的靶(10)。事實上,已經以靶向凋亡蛋白的失調表達的化合物證明了抗癌活性,所述化合物包括p53-mdm2相互作用的小分子干擾劑(11,12)、bcl-2的抑制劑(13)和xiap的配體(14,15)。半胱氨酸蛋白酶的胱天蛋白酶家族的成員在凋亡的引發(fā)和執(zhí)行中都是關鍵的參與者。這些酶以低活性酶原(前酶)形式存在于細胞中,其被蛋白水解活化成成熟的高活性酶。對于凋亡來說,最關鍵的是胱天蛋白酶原-3蛋白水解轉化成胱天蛋白酶-3。由于內部和外部凋亡途徑都集中于活化胱天蛋白酶原-3,并且由于胱天蛋白酶-3有超過100種細胞底物,所以將胱天蛋白酶原-3活化成胱天蛋白酶-3是凋亡級聯(lián)中關鍵且必有的(committed)事件。值得注意的是,胱天蛋白酶原-3在許多腫瘤組織中均過表達,所述腫瘤包括乳腺癌(16)、結腸癌(17)、肺癌(18)、淋巴瘤(19)、成神經細胞瘤(20)、黑素瘤(21)和肝癌(22),表明活化胱天蛋白酶原-3的小分子相對于正常細胞可能對癌細胞具有選擇性。在2006年,本發(fā)明人報道發(fā)現(xiàn)了被稱為pac-1的小分子,當其作為脂質基制劑口服給藥或作為膽甾醇顆粒皮下植入時,其可在體外增強胱天蛋白酶原-3活性,誘導所培養(yǎng)的癌細胞死亡,并在多個小鼠異種移植物模型中有效(23)。pac-1在體外可通過螯合抑制性鋅離子活化胱天蛋白酶原-3(24),并且衍生物合成和評價顯示,pac-1的生物活性與具有完整的鄰-羥基n-?;赇\螯合基序有關(25)。許多數(shù)據(jù)表明,pac-1可通過螯合來自胱天蛋白酶原-3的鋅而誘導癌細胞的凋亡性死亡,最值得注意的是,熒光pac-1衍生物和細胞胱天蛋白酶-3活性部位的共定位(25)。作為第一種活化胱天蛋白酶原的化合物,pac-1的實驗證明了胱天蛋白酶原-3活化作為可行的抗癌策略的可能性。為進一步開發(fā)pac-1作為治療人癌癥的實驗性治療物,本發(fā)明人試圖表征該化合物在靜脈內給藥時且在更復雜的體內腫瘤模型系統(tǒng)中(具體是患有自發(fā)性癌癥的犬)中的作用。在患有癌癥的寵物狗中評價實驗性治療物可提供許多鼠異種移模物模型達不到的優(yōu)點(26)。在此,本發(fā)明人報道了在小鼠中靜脈內pac-1的毒性研究和pac-1衍生物(被稱為s-pac-1)的發(fā)現(xiàn),所述衍生物可誘導所培養(yǎng)的癌細胞系凋亡,在小鼠和研究用狗中被很好地耐受,并且在對患有自發(fā)性淋巴瘤的犬患者的小規(guī)模試驗中有效。pac-1的配制。為加快對用于治療人癌癥患者的胱天蛋白酶原-3活化劑的翻譯研究,評價了靜脈內給藥(常規(guī)抗癌劑的最常見藥物送遞途徑)的pac-1的耐受性。為此目的,本發(fā)明人首先優(yōu)化了配制步驟,該配制步驟可在水溶液中可靠地維持高濃度的pac-1——一種親脂的藥物。使pac-1在水溶液中溶解并維持的增溶劑是2-羥丙基-β-環(huán)糊精。在200mg/ml的2-羥丙基-β-環(huán)糊精的水溶液中,pac-1以20mg/ml溶解。完全溶解需要將所述水溶液酸化至ph1.5-2,然后使所述溶液恢復至ph5-6。用該步驟,在4℃下保存時,pac-1將保持在溶液中并且至少穩(wěn)定5天。pac-1的毒性。在努力表征靜脈內給予的pac-1的可行性和耐受性時,對c57/bl6小鼠經側尾靜脈注射給予10、20、30和50mg/kg的pac-1(溶解于2-羥丙基-β-環(huán)糊精),然后觀察該動物24小時。在10mg/kg的pac-1下,沒有觀察到臨床毒性征象。以此方式接受了20mg/kg的pac-1的小鼠表現(xiàn)出輕度的神經癥狀,包括昏睡和輕度共濟失調;這些癥狀在注射之后持續(xù)了20分鐘,此時小鼠恢復并且沒有顯示其它毒性征象。接受了30mg/kg的pac-1的小鼠表現(xiàn)出明顯的神經毒性征象,包括痙攣(1/3)、共濟失調(3/3)和失衡(3/3),從注射5分鐘內開始并持續(xù)大約15分鐘。接受了50mg/kg的pac-1的小鼠表現(xiàn)出急性神經毒性癥狀,有更明顯的共濟失調和失衡。在該劑量下,在所有小鼠中都觀察到肌肉痙攣。僅接受2-羥丙基-β-環(huán)糊精載體的小鼠沒有表現(xiàn)出毒性。盡管在小鼠身中觀察到神經毒性,pac-1已被以較低劑量安全地給予狗。為了證實這種神經毒性沒有物種特異性,在10分鐘的時程中將60mg/kg的pac-1經靜脈給予一只健康的研究用獵狗。給予這種高濃度的pac-1導致了類似的神經毒性,包括持續(xù)了20分鐘的共濟失調和痙攣。鑒于已知的pac-1在體外對鋅的親和性(24),及其已被證明的結合細胞鋅的能力(25),本發(fā)明人假設在給予溶于2-羥丙基-β-環(huán)糊精中的pac-1的小鼠和狗中觀察到的神經毒性是由于螯合被治療小鼠的中樞神經系統(tǒng)內nmda受體處的胞內鋅引起。這種假設與來自對其他鋅螯合劑的體內研究的數(shù)據(jù)一致,所述鋅螯合劑可誘導本發(fā)明人用pac-1觀察到的神經表型回憶(reminiscent)(27,28)。事實上,預測pac-1穿透血腦屏障(bbb)的分配的計算機分析(29)中顯示,pac-1具有-0.07的計算logbb。該logbb對應于血液與腦之間的0.85/1.0的分配比,表明極大量的pac-1可進入中樞神經系統(tǒng)。一些研究表明,螯合胞內鋅庫可緩解對nmda受體的緊張性抑制(tonicinhibition),形成神經元(neuronal)興奮過度(28,30)。方案1s-pac-1的克級合成s-pac-1的設計。為克服這種神經毒性,本發(fā)明人合成了穿透bbb的傾向較低的pac-1衍生物,以呈現(xiàn)出神經毒性降低并使得可以較高濃度給藥。設置在pac-1的芐基環(huán)上的極性官能團應可降低預測的logbb,而同時保持母體化合物的活性。這種s-pac-1——pac-1的氨磺酰衍生物——被設計為一種預測穿透bbb能力明顯降低(-1.26的logbb)的化合物。s-pac-1的合成路徑表示于方案6;該路徑是以前報道的pac-1合成路徑(23)的修改方案。簡言之,氨磺酰1偶聯(lián)于哌嗪2以便以良好產率得到酯3。然后該酯與肼反應生成酰肼4,其之后與醛5縮合以得到s-pac-1。該路徑的所有實驗細節(jié)以及s-pac-1和各種中間體的光譜數(shù)據(jù)可見于本文其它部分。很明顯,所述反應序列是可高度放大的;事實上,方案6所列的產率是產生40g的s-pac-1的產率。這種放大的關鍵是針對每種中間體開發(fā)簡單純化方案。因此,化合物2是通過重結晶從乙醇純化,酰肼3是通過重結晶從甲醇純化,終產物是通過硅膠色譜法和重結晶從甲醇純化。通過以40g規(guī)模進行該合成4次,成功制備了超過160g的s-pac-1。更小規(guī)模的s-pac-1合成的細節(jié)可見于本文其它部分。s-pac-1可結合鋅離子。s-pac-1的活性在數(shù)個生物化學測定法中被表征。用egta競爭滴定實驗(31)來確定s-pac-1:zn2+復合物的結合常數(shù)。在該實驗中,用不斷增加濃度的zn2+滴定含已知量的egta和s-pac-1的溶液,并在475nm下檢測s-pac-1的熒光。將存在zn2+的情況下的熒光變化用于作圖為形成曲線(圖16b)。用已知的egta結合常數(shù),可計算游離鋅的濃度并用于確定s-pac-1:zn2+復合物的結合常數(shù)。該復合物的kd為46±5nm,相比而言s-pac-1:zn2+的kd為52±2nm。(25)(圖20)。egta熒光滴定測定法——該滴定測定法基于公開的方案(huang,org.lett.2007,9,4999-5002)。滴定之前,將比色皿以edta(10mm)孵育10分鐘,然后用無菌去離子水和丙酮洗滌以移除任何殘留的金屬離子。將pac-1或衍生物(60μm)加入至含有緩沖液(hepes:50m,kno3:100mm,ph7.2)和egta(7.3mm)的比色皿以得到10倍稀釋物(終pac-1濃度:6μm)。以不斷增加的量加入zn(otf)2(0-10mm)。zn-pac-1(或衍生物)復合物的形成是通過熒光強度的增加進行監(jiān)測的(ex/em:410nm/475nm)。將475nm下的熒光強度相對于用maxchelaor程序計算的游離zn濃度([zn]f/m)作圖(patton,cellcalcium,2004,35,427-431)。所述數(shù)據(jù)用kaleidagraph分析并擬合于基于從公開方案衍生的eqs1的形成曲線。i=(i最小kd+i最大[zn]f)/(kd+[zn]f)eqs1其中i最小和i最大分別定義為游離探針(在此情況下為pac-1或衍生物)zn-探針復合物的熒光強度。s-pac-1可在體外活化胱天蛋白酶原-3。評價了在存在外源鋅的情況下s-pac-1在體外活化重組表達的胱天蛋白酶原-3的能力。為確保所述酶原的活性被監(jiān)測,使用了胱天蛋白酶原-3的蛋白酶解不可切割的變體(其中三個天冬氨酸切割部位殘基均被突變成丙氨酸(d9a/d28a/d175a))(24,32)。將這種重組表達的蛋白在存在10μm鋅的情況下孵育,并將s-pac-1加入至所述樣品中,以15分鐘的間隔監(jiān)測所述酶的活性。如圖16c中所示,s-pac-1可通過緩解鋅介導的抑制而快速(5分鐘之內)提高所述酶原的酶活性。s-pac-1可誘導所培養(yǎng)的多種癌細胞系的細胞死亡。已證實s-pac-1可在體外螯合鋅并活化胱天蛋白酶原-3,評價了s-pac-1對一組人、犬和鼠癌細胞系的抗癌活性。將細胞用不同濃度的化合物孵育72小時,之后用磺酰羅丹明b測定法來評價細胞死亡(33)。pac-1和s-pac-1的ic50值記錄于表1a中。在大多數(shù)情況下,s-pac-1與pac-1等效,但pac-1在hela細胞中似乎更強效。不管物種來源如何,pac-1和s-pac-1二者都似乎可強效對抗所有試驗的淋巴瘤細胞系。用u-937細胞進行的其它分析顯示,s-pac-1可誘導這些細胞凋亡。將u-937細胞以dmso、50μm的pac-1或50μm的s-pac-1處理12小時。在孵育后,用膜聯(lián)蛋白v/pi染色評價凋亡并通過流式細胞術進行分析(圖16d)。pac-1和s-pac-1二者的處理都可導致呈現(xiàn)膜聯(lián)蛋白v染色的細胞群增加。在該實驗中,s-pac-1可誘導與pac-1程度相同的凋亡(約40%)。在確定用于體內評價s-pac-1的合適治療策略的努力中,評價了s-pac-1細胞毒性的時間依賴性。將u-937細胞以s-pac-1處理不同的時長。在以s-pac-1處理后,將細胞洗滌以除去化合物并在沒有化合物的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在72小時時評價所有處理時間的細胞死亡。測定每個暴露時間的ic50值并記錄于表1b。在3、6和9小時時,ic50值大于所測試的最高濃度。在12小時的暴露時間時,觀察到ic50值快速減小。通過24小時的暴露,ic50值接近最小值并在后續(xù)48小時的時程中幾乎沒有顯示變化。這些時間依賴性的實驗表明,如果將癌細胞暴露于該化合物至少24小時,則s-pac-1在體內是最有效的。s-pac-1在小鼠中沒有神經毒性效應。已證實s-pac-1在體內和在細胞培養(yǎng)物中的活性,在c57/bl6小鼠中評價了s-pac-1的毒性效應。以與pac-1的毒性確定類似的方式,將s-pac-1(以2-羥丙基-β-環(huán)糊精溶解)經側尾靜脈注射以12.5mg/kg、25mg/kg、37.5mg/kg和350mg/kg給予c57/bl6小鼠。甚至在350mg/kg的劑量下也沒有觀察到神經毒性。對于在鼠腫瘤模型中評估s-pac-1的初始目標,確定了小鼠中s-pac-1的藥代動力學。如果s-pac-1能夠以使s-pac-1的血漿濃度在24小時的時程中超過約10μm的方式給藥,則所述治療能夠有效誘導胱天蛋白酶原-3活化和腫瘤細胞凋亡。為了順著這些思路開發(fā)治療策略,以125mg/kg溶于2-羥丙基-β-環(huán)糊精中的s-pac-1經腹膜內給藥治療c57/bl6小鼠。將小鼠處死并在給藥后的不同時間點取血。將血液樣品離心并收集血清,然后用液相色譜法分析以確定藥物濃度。s-pac-1隨時間的藥物濃度在圖17a中顯示。在注射后30分鐘時該劑量達到約170μm的血漿濃度峰值。然后s-pac-1的血漿濃度快速下降,在注射后4小時時,血液中沒有殘余的s-pac-1。對該數(shù)據(jù)的分析表明,s-pac-1在小鼠體中的消除半衰期為約1小時。基于s-pac-1在小鼠中達到的血漿濃度峰值和短半衰期,預測小鼠將需要以每兩小時350mg/kgs-pac-1的劑量進行治療,以在24小時的時程中達到并維持10μm的最小血漿濃度。盡管s-pac-1的這種頻繁給藥的方案(每2小時腹膜內給藥,持續(xù)24小時)在技術上是可行的,但是使用鼠腫瘤模型對s-pac-1作為新治療劑的進一步評估在方法學上是不實際的。因此,本發(fā)明人嘗試在更大的哺乳動物實驗系統(tǒng)——特別是健康和自發(fā)性患癌的狗——中進一步研究s-pac-1,這賦予更大的實用性,原因是保持s-pac-1穩(wěn)定狀態(tài)濃度達更長時間。在研究用狗中評估s-pac-1。將健康的研究用獵狗用于s-pac-1的藥代動力學和毒性研究。將四只研究用獵狗以在10分鐘內經靜脈注射的25mg/kg的s-pac-1(溶解于2-羥丙基-β-環(huán)糊精中)進行處理。在24小時中收集多個血清樣品以在狗中表征靜脈給藥的s-pac-1的藥代動力學譜。除了藥代動力學分析之外,每周在研究用狗中監(jiān)測單劑量的靜脈s-pac-1給藥的血液耐受性和非血液耐受性,連續(xù)持續(xù)四周(表2a)。如圖17b中所示,由此25mg/kg靜脈推注劑量形成的血漿濃度峰值為約150μm,類似于以125mg/kg腹膜內劑量處理的小鼠中達到的值。根據(jù)對藥代動力學譜的分析,狗中s-pac-1的半衰期被計算為3小時。此外,單劑量的靜脈s-pac-1處理被所有四只研究用狗很好地耐受,用這些動物未觀察到由于處理導致的短期或長期的不利事件。盡管狗中3小時的半衰期比小鼠中s-pac-1的半衰期有顯著提高,但是藥代動力學計算預測,所述藥物需要在一天的時程中給藥數(shù)次以維持高于約10μm的血清水平?;蛘撸捎眠B續(xù)速率輸注(continuousrateinfusion)以在治療過程中維持藥物的穩(wěn)定狀態(tài)的血清濃度。連續(xù)速率輸注策略已用于其他化學治療藥物,例如達卡巴嗪(dacarbazine)(34)、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)(35)和吉西他濱(gemcitabine)(36),輸注時間最長達98小時。此外,ym155——一種在較長暴露時間下呈現(xiàn)活性增加的研究中促凋亡藥物——現(xiàn)正進行臨床試驗,并且采用168小時的連續(xù)速率輸注(37)。將三只健康的研究用狗用于確定s-pac-1是否能夠經連續(xù)速率輸注方案安全地給藥,并確定合適的劑量水平來維持高于約10μm的血清濃度。每只狗都在10分鐘的時程中經靜脈輸注接受初始負荷劑量,隨后通過輸注泵送遞維持劑量另外24小時。在其24小時的輸注時程中觀察每只狗的不利反應,并間隔取血以評價s-pac-1處理的藥代動力學譜。此外,在完成s-pac-1輸注之后,每周對研究用狗評價血液和非血液毒性,持續(xù)連續(xù)4周。作為24小時連續(xù)速率輸注物給藥的s-pac-1可安全地給予至研究用狗并且容易達到微摩爾的穩(wěn)態(tài)血漿濃度。以此方式給予s-pac-1的狗的藥代動力學譜顯示,穩(wěn)態(tài)的血漿濃度與劑量增加有關(圖17c)?;谶@些結果預測出,7mg/kg負荷劑量和3mg/kg/hr恒定速率輸注將足以達到約10μm的穩(wěn)態(tài)血漿濃度。此外,s-pac-1的連續(xù)速率輸注在所有試驗劑量下均被很好地耐受,并且在任何研究用狗中都沒有觀察到血液毒性或非血液毒性。已證實了s-pac-1的體外活性,表明所述化合物可經連續(xù)速率輸注安全地給藥,并且>10μm的s-pac-1的穩(wěn)態(tài)血漿濃度可維持24小時的持續(xù)時間,對患有自發(fā)性淋巴瘤的就診寵物狗進行了小規(guī)模(n=5)臨床試驗。寵物狗中自發(fā)出現(xiàn)的癌癥與人癌癥之間具有許多相似之處,包括組織學外觀、腫瘤遺傳學、分子靶、生物和臨床表現(xiàn)以及對治療的響應(38)。這些自發(fā)性犬癌癥中,多中心淋巴瘤最常見,每100000只狗發(fā)生13至24例(39)。多中心b-細胞或t-細胞犬淋巴瘤的臨床進展和治療與人的非何杰金氏淋巴瘤有許多相同特性。犬淋巴瘤和人非何杰金氏淋巴瘤都對相同的細胞毒性藥物(例如多柔比星(doxorubicin)、長春新堿(vincristine)和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide))都有臨床響應。這些藥物是chop治療方案的組分,該治療方案為用于人彌漫性大b-細胞淋巴瘤的一線療法(40)。當對狗給藥時,chop方案將會在大約90%被診斷患有淋巴瘤的狗中誘導完全的臨床緩解(41,42)。類似于人的響應,大部分經chop治療實現(xiàn)減輕的狗將經歷疾病復發(fā)(43)。鑒于人與犬淋巴瘤之間的共同點,在犬淋巴瘤臨床試驗中對s-pac-1的評估可為開發(fā)s-pac-1作為新型人治療物提供重要的轉譯信息。s-pac-1試驗的選擇標準。受贈予或屬于伊利諾伊大學香檳分校獸醫(yī)學院小動物診所(universityofillinois-urbanachampaign、collegeofveterinarymedicine、smallanimalclinic)的狗被考慮參與本臨床試驗。合格患者的選擇標準如下:組織學或細胞學證實的多中心淋巴瘤;可測量的腫瘤負荷;良好的體力狀況;>4周的預期壽命;進入研究前3周內無在前化學治療;無明顯的共患疾病,包括腎衰竭或肝臟衰竭、充血性心力衰竭病史或臨床凝血病。此外,根據(jù)大學準則,在進入研究前寵物主人必須簽署書面知情同意書。犬淋巴瘤患者中s-pac-1的毒性和藥代動力學。五只狗患者經兩種治療方案中的一種接受s-pac-1治療(總結在表7c中)。參與第一治療方案的患者每周一次接受24小時的連續(xù)s-pac-1輸注,持續(xù)4個周循環(huán)。參與第二治療方案的患者隔周接受72小時的連續(xù)s-pac-1輸注,持續(xù)2個治療循環(huán)。在每個s-pac-1治療循環(huán)過程中收集血液,用于藥代動力學分析。此外,在每次排定的跟蹤回診時從所有寵物狗收集血液,以表征血液毒性和非血液毒性。在給藥之間,由寵物主人對患者進行監(jiān)測,以進行獸醫(yī)合作腫瘤小組的不利事件普通術語和標準(veterinaryco-operativeoncologygroupcommonterminologyandcriteriaforadverseevents)(vcog_ctcae)隨附的胃腸道毒性觀察評分(44)。參與治療方案1或2的所有患者都未表現(xiàn)出任何臨床上顯著的血液毒性或非血液毒性(表7c和d)。寵物主人僅報告了少數(shù)不利事件,例如在輸注部位的自限刺激和局部刺激(n=3)、食欲暫時喪失(n=1)和中度腹瀉(n=2)。所有不利反應在每個治療循環(huán)結束的48小時內消退。如圖18中所示,藥代動力學分析表明,所有患者都具有可測量的s-pac-1血清濃度。s-pac-1濃度在輸注開始6小時內達到穩(wěn)定狀態(tài)。根據(jù)從健康的研究用狗的預測,負荷劑量為7mg/kg的輸注和3mg/kg/hr的恒定速率輸注在大多數(shù)治療中足以達到>10μm的穩(wěn)定狀態(tài)的血漿濃度。s-pac-1的抗腫瘤活性。在整個研究時程中通過對外周淋巴結的累積測徑器測量以及對下頜淋巴結的ct掃描監(jiān)測對腫瘤負荷的評估。測徑器測量依照recist法進行(45)。簡言之,對4對外周淋巴結(下頜骨、肩胛骨前、腹股溝和腘部)記錄最長的直線測量長度,對這些值求和得到recist分值。除了測徑器測量所有4組外周淋巴結之外,在每個患者中對下頜淋巴結進行ct掃描,使得可精確且客觀地測量最大淋巴結直線長度。在5個治療的患者中,一個患者(患者1)顯示部分響應,在4周的治療時程中通過ct掃描獲得的下頜淋巴結測量值和recist分值都有約30%的減小(圖19a和b)。在四個治療周期后,停止給予藥物,在后續(xù)的2周中通過recist監(jiān)測所述狗。無治療時,該狗的recist分值劇烈增大(第36和42天)。除了這種部分響應外,三個患者顯示出穩(wěn)定的疾病(患者2-4),而一個患者表現(xiàn)出疾病進展(患者5)。s-pac-1是pac-1類中將在癌癥患者的臨床試驗中進行評價的第一個化合物(和胱天蛋白酶原-3的第一個小分子活化劑)。這些數(shù)據(jù)對于作為抗癌療法的胱天蛋白酶原-3活化策略很重要?;蛟S不令人驚奇的是,鑒于pac-1的作用機理及預測的其bbb穿透性,高劑量的該化合物可誘導神經毒性。而且,發(fā)生這種神經毒性的短暫滯后(約5分鐘)表明所觀察的神經毒性不是pac-1的初始血漿濃度峰值的導致的,而是pac-1穿透bbb的再分布導致的。鋅的內穩(wěn)態(tài)在中樞神經系統(tǒng)中是重要的(46),并且nmda受體需要結合的鋅以提供緊張性抑制(28)。nmda受體以低親和性(kd=5.5μm)結合鋅(47),這表明對鋅有較高親和性的鋅螯合劑(例如pac-1或s-pac-1(kd分別=46和52nm))能夠成功地從這些受體中分離鋅。一些研究表明,胞內鋅螯合可導致這些受體興奮過度(27),造成諸如不受控制的肌肉運動和癲癇發(fā)作的癥狀(28)。事實上,可穿透細胞的鋅螯合劑tpen已被證明,在低濃度下可在小鼠中誘導嚴重的神經毒性,在較高濃度下可誘導快速死亡(48)。有數(shù)種因素可影響化合物通過bbb的穿透性,包括極性、親脂性和大小(29)。降低化合物對bbb的穿透性的一個策略是增加該分子的極性。加入氨磺酰官能團是這種極性增加的良好候選方案,因為芳基氨磺?;蛟谠S多小分子治療物中是常見的。fda批準的含有芳基氨磺酰官能團的藥物包括塞來考昔(celecoxib)坦索洛新(tamsulosin)和鹽酸噻嗪?;加辛馨土龅膶櫸锕反砹艘环N用于對研究中新藥進行研究的重要工具(26)。us有將近1/4的寵物狗死于癌癥(49),不經治療時自診斷的平均存活時間是4-6周。對患有淋巴瘤的狗的標準護理法是給予chop治療(26)。這種治療由19周內16個給藥療程組成,通常導致完全減輕。與人疾病類似,實現(xiàn)減輕的大多數(shù)狗都會出現(xiàn)復發(fā),并且通常伴有耐藥性。這樣,需要新的藥效團來解決原發(fā)性淋巴瘤和復發(fā)性淋巴瘤。如表6c中所示,參與本研究的一只狗(患者1)在chop治療后減輕了5個月,最近被診斷出患有復發(fā)性淋巴瘤。一旦參與本研究,這只狗對s-pac-1治療的響應是腫瘤大小減小27%。鑒于治療持續(xù)時間相對較短,這種部分響應是顯著的(s-pac-1的4周相對于chop的19周)。令人鼓舞的是,5個患者中的4個達到部分響應或穩(wěn)定疾病,維持4周的持續(xù)時間,因為犬淋巴瘤通常是一種快速進行性惡性腫瘤,同時在疾病診斷的數(shù)周內外周淋巴結劇烈擴大。這一點可通過停止治療后患者1的淋巴結出現(xiàn)快速擴大來進一步表明。pac-1類的化合物可通過螯合抑制性鋅離子活化胱天蛋白酶原-3(25)。細胞內鋅主要存在于金屬蛋白酶中緊密結合的復合物、鋅指結構域(zinc-fingerdomain)和其它金屬結合蛋白中;然而,據(jù)信約10%的細胞鋅存在于疏松結合的不穩(wěn)定庫(labilepool)中(50)。許多研究暗示不穩(wěn)定的鋅可作為內源性的抗凋亡調節(jié)劑(51-54)。值得注意的是,螯合疏松結合的鋅庫是一種新出現(xiàn)的抗癌策略(24,25)。近來,另一種小分子鋅螯合劑ml-133被報道在體外和在鼠結腸癌異種移植物模型中具有抗癌性質(55)。盡管作者沒有報道,但是ml-133可能是以類似于pac-1和s-pac-1的方式起作用(即活化胱天蛋白酶原-3)。因此,評估s-pac-1也可用于螯合不穩(wěn)定的鋅庫作為抗癌策略??傊瑂-pac-1是一種具有類似母體化合物——pac-1——的活性的強效細胞毒性小分子。雖然高劑量的pac-1(當在2-羥丙基-β-環(huán)糊精中給藥時)可在體內誘導神經毒性,s-pac-1并不引起這種副作用。s-pac-1可被安全地給藥于小鼠、研究用狗和患有淋巴瘤的狗,并在該初步單劑量評估中顯示令人鼓舞的臨床效果。鑒于s-pac-1無神經毒性,預計s-pac-1甚至在比本文評價的劑量更高的劑量下也將被證明是安全的。s-pac-1的完全犬臨床試驗——包括在患淋巴瘤狗中的劑量擴大——目前正在進行。表6.a)pac-1和s-pac-1在多種所培養(yǎng)的癌細胞系中的細胞毒性分析。b)u-937細胞中s-pac-1細胞毒性的時間依賴性。c)以s-pac-1治療的五只患有淋巴瘤的狗的特征。a)a該細胞系使用mts細胞活性測定法進行評價。b)表7.a)選擇以單劑量s-pac-1治療的研究用狗的血液參數(shù)和非血液參數(shù),c)每周以s-pac-1進行24小時連續(xù)速率輸注(四次連續(xù)處理)的患有淋巴瘤的狗,d)隔周以s-pac-1進行72小時恒定速率輸注(2次連續(xù)處理)的患有淋巴瘤的狗。a)c)d)wbc-白細胞,alt-丙氨酸轉移酶,bun-血漿尿素氮,alp-堿性磷酸酶。材料和方法總述所有要求無水條件的反應都在經烘干的玻璃器皿中在氮氣或氬氣的正氣氛下進行。標準注射技術用于液體的無水添加。干的四氫呋喃是通過穿過市售溶劑純化系統(tǒng)(innovativetechnologies)中經過活化的鋁柱或分子篩得到。除非另外注明,否則所有原料、溶劑和試劑都購自市售供應商并且不經進一步純化而直接使用??焖偕V法是用230-400目的硅膠進行?;衔?、2和5(naganawa,bioorgmedchem,2006,14,7121-7137)依照文獻方法制備?;衔锓治鏊衝mr實驗都在varianunity400mhz或500mhz的光譜儀上在d2o(sigma)、cd3od(sigma)或丙酮-d6(sigma)中記錄,以殘留的非氘化溶劑作為內參。記錄了化學位移δ(ppm);耦合常數(shù)j(hz);多峰性(s=單峰,d=雙峰,t=三重峰,q=四重峰,m=多重峰);以及積分。高分辨質譜數(shù)據(jù)是用伊利諾伊大學質譜實驗室的micromassq-tofultimahybridquadrupole/time-of-flightesi質譜儀記錄。所有熔點都未校正。lc-ms在c18柱(2.1×5mm)上進行,流動相a為0.1%的tfa的h2o溶液,b為乙腈,使用的梯度系統(tǒng)為在0-2分鐘恒定為0%的b,然后在2-5分鐘從0%至50%的b,然后在5-7分鐘從50%至100%的b,在7-8分鐘恒定為100%,然后在8-10分鐘從100%至0%的b。方案7:s-pac-1的毫克級(minigram-scale)合成方案8:s-pac-1的克級合成2-(4-(4-氨磺?;S基)哌嗪-1-基)乙酸乙酯(3)向攪拌的1(108g,440.7mmol,1.4當量)和k2co3(132.4g,958.2mmol,3當量)在3∶2thf/丙酮(總計2192ml)中的混合物中加入2-(哌嗪-1-基)乙酸乙酯2(79.9g,319.4mmol,1當量)。將所述反應物回流24h,通過tlc進行監(jiān)測。將所述溶液過濾并用丙酮(80ml)洗滌所得固體。將所述濾液在真空中濃縮,然后通過在乙醇中重結晶純化得到淺黃色固體3(57.4g,60%)。對于毫克級,將所述粗品通過快速柱色譜法在硅膠上純化(1∶4meoh/etoac)。1h-nmr(500mhz,cd3od):δ7.86(d,j=8.0hz,2h),7.52(d,j=8.0hz,2h),4.17(q,j=7.1hz,2h),3.61(s,2h),3.24(s,2h),2.58(寬d,j=50.4hz,8h),1.26(t,j=7.1hz,3h).13cnmr(126mhz,cd3od):δ170.4,142.8,142.4,129.7,126.0,61.9,60.6,58.5,52.5,52.4,13.3.hrms(esi):測定值:342.1487(m+1);c15h24n3o4s計算值:342.1488.m.p.:153.0-154.5.ir(純的):3319,1739,1160cm-1。4-((4-(2-肼基-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)甲基)苯磺酰胺(4)向攪拌的3(110.9g,324.8mmol,1當量)的2∶1乙醇/甲醇(總計650ml,0.5m)溶液中加入無水肼(30.6ml,974.5mmol,3當量)。將所述反應物回流16h,通過tlc進行監(jiān)測(1∶1meoh/etoac)。將所述反應混合物在真空中濃縮。將所得殘留物溶解于ch2cl2并用水(100ml)和鹽水(100ml)洗滌。將水層用ch2cl2(3×18ml)和etoac(80ml)萃取。將合并的有機層用na2so4干燥、過濾并在真空中濃縮。通過在甲醇中重結晶純化,得到白色固體4(96.3g,91%)。對于毫克級,在乙醇(0.06m)中進行所述反應。1hnmr(500mhz,cd3od):δ7.85(d,j=8.2hz,2h),7.51(d,j=8.2hz,2h),3.61(s,2h),3.04(s,2h),2.54(寬s,8h)。13cnmr(126mhz,cd3od):δ170.2,142.8,142.4,129.7,126.0,61.9,59.8,53.0,52.6.hrms(esi):測定值:328.1436(m+1);c13h22n5o3s計算值:328.1443.m.p.:194.5-196.0.ir(純的):3320,1670,1158cm-1。(e)-4-((4-(2-(2-(3-烯丙基-2-羥基亞芐基)肼基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)甲基)苯磺酰胺(s-pac-1)向攪拌的5(28.8g,177.3mmol,1當量)的1∶2乙腈/甲醇(總計1180ml,0.15m)溶液中加入4(98.7g,301.4mmol,1.7當量)和hcl(7mol%)。將所述反應物回流48h,通過tlc進行監(jiān)測。將所述溶液在真空中濃縮。將粗品通過快速柱色譜法在硅膠上純化(1∶4meoh/etoac),然后通過在甲醇中重結晶得到灰白色固體s-pac-1(45.9g,55%)。對于毫克級,在乙醇(0.02m)中進行所述反應。1hnmr(500mhz,(cd3)2co):δ11.86(s,1h),10.79(s,1h),8.51(s,1h),7.85(d,j=8.2hz,2h),7.53(d,j=8.2hz,2h),7.19(d,j=7.6hz,2h),6.86(t,j=7.6hz,1h),6.56(s,2h),6.02(tdd,1h,j=6.7hz,j=10.1hz,j=16.9hz),5.04(m,2h),3.60(s,2h),3.42(d,j=6.7hz,2h),3.18(s,2h)2.57(寬d,j=46.5hz,8h)。13cnmr(126mhz,(cd3)2co):δ165.7,156.4,150.0,143.4,143.2,136.9,131.8,129.32,129.30,127.9,126.2,119.1,117.8,115.1,62.0,61.1,53.7,52.9,33.8。hrms(esi):測定值:472.2014(m+1);c23h30n5o4s計算值:472.2019.m.p.:108.5-111.0.ir(純的):3227,1684,1606,1157cm-1。純度:>99.5%(lc-ms)。4-(哌嗪-1-基甲基)苯磺酰胺(6)將無水哌嗪(860mg,10.0mmol,5當量)加入至thf(10ml)中,將所述混合物加熱回流,直到哌嗪完全溶解。向該溶液中加入1(500mg,2.0mmol,1當量)。將所述反應混合物回流2.5hr,通過tlc進行監(jiān)測。將所述反應混合物用1m的koh溶液中和,然后在真空中濃縮。通過快速柱色譜法在硅膠上純化(1∶4meoh/etoac),得到淺黃色半固體6(250mg,49%)。1hnmr(400mhz,d2o/(cd3)2co):δ7.84(d,j=8.4hz,2h),7.51(d,j=8.4hz,2h),3.69(s,2h),3.42(s,2h),3.22(m,4h),2.74(m,4h),1.87(表觀s,1h).13cnmr(126mhz,cdci3):δ140.93,140.87,131.0,126.3,61.1,49.0,43.13。hrms(esi):測定值:256.1114(m+1);c11h18n3o2s計算值:256.1120。ir(純的):3142,1158cm-1。實施例7.制藥實施方案以下描述了與制藥和藥理實施方案有關的信息,并進一步補充本領域普通技術人員能獲得的信息。確切的制劑、給藥途徑和劑量可由各個醫(yī)師考慮患者狀況選擇(參見例如fingletal.,inthepharmacologicalbasisoftherapeutics,1975,ch.lp.1)。應該注意,主治醫(yī)師將知道由于毒性、器官功能障礙等如何且在何時停止、中斷或調節(jié)給藥。相反,主治醫(yī)師還將知道,如果臨床響應不足(根據(jù)或排除毒性方面),如何將治療調節(jié)至較高水平。治療目的病癥中給藥劑量的大小可隨要待治療病癥的嚴重程度和給藥途徑而變化。例如,所述病癥的嚴重程度可通過標準的預后評估方法部分地評估。此外,劑量和可能的給藥頻率還可根據(jù)情況——例如各個患者的年齡、體重和響應——估變化。與以上討論的程序相當?shù)某绦蜻€可用于獸醫(yī)學。取決于要治療的具體病癥和所選的靶向方法,可配制這類試劑并進行全身給藥或局部給藥。配制和給藥的技術可見于alfonsoandgennaro(1995)和本領域中它處。合適的途徑可包括,例如口服給藥、直腸給藥、經皮給藥、陰道給藥、經粘膜給藥或腸內給藥;腸胃外送遞,包括肌內注射、皮下注射或髓內注射,以及眼內給藥、鞘內給藥、靜脈給藥或腹膜內給藥。對于注射或其它途徑,本發(fā)明的試劑可以配制在水性溶液中,優(yōu)選生理上相容的緩沖液,例如hank’s溶液、ringer’s溶液、注射用水、生理鹽水緩沖液或其它溶液。對于經粘膜給藥,可將適于要穿透的屏障的滲透劑用于所述制劑中。這類滲透劑是本領域中公知的。使用可藥用載體來將本文中所公開的可用于實施本發(fā)明的化合物配制成適于全身給藥或其它方式給藥的劑量是在本發(fā)明的范圍內。通過合適地選擇載體和適合的制造過程,本發(fā)明的組合物,特別是配制成溶液的那些組合物,可以被腸胃外給藥,例如通過靜脈注射或其它途徑。可容易地將合適的化合物使用本領域中熟知的可藥用載體配制成適于口服給藥的劑量。這類載體能使本發(fā)明的化合物被配制成片劑、丸劑、膠囊劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、酏劑、溶液劑、懸浮劑等,例如用于由要治療患者口服攝取。對于其它途徑,可將制劑制備成乳劑、軟膏劑、洗劑等。意在被胞內給藥的試劑可使用本領域普通技術人員熟知的技術給藥。例如,可將這類試劑包囊至脂質體中、其它膜易位促進部分或其它靶向部分中;然后如上文所述給藥。脂質體可包括具有水性內部的球形類脂雙層。在脂質體形成時存在于水性溶液中的所有分子都可被納入所述水性內部中。脂質體的內容物不僅被與外部微環(huán)境隔離,而且由于脂質體與細胞膜融合而可被有效地送遞至細胞質中。此外,由于疏水屬性,有機小分子可直接胞內給藥。適合用于本發(fā)明的藥物組合物包括其中包含有效量活性成分以實現(xiàn)預期目標的組合物。確定有效量是本領域技術人員力所能及的,尤其是考慮到本文提供的公開內容和本領域的其它信息之后。除了所述活性成分之外,這些藥物組合物還可包含合適的可藥用載體,包括有利于所述活性化合物被加工成可用于制藥的制品的賦形劑和助劑。配制用于口服給藥的制劑可為片劑、錠劑、膠囊劑或溶液劑的形式,包括配制用于緩釋或僅在藥物到達小腸或大腸時釋放的形式。本發(fā)明的藥物組合物可以以本身已知的方式制造,例如借助于常規(guī)的混合、溶解、懸浮、顆粒化、制錠、漂浮、乳化、包囊、制粒(entrapping)、凍干和其它方法。用于腸胃外給藥的藥物制劑包括水溶形式的活性化合物的水性溶液。此外,活性化合物的懸浮劑可被制備成合適的油性注射懸浮劑。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油(例如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或脂質體。水性注射懸浮劑可包含增加所述懸浮劑粘度的物質,例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地,所述懸浮劑還可包含合適的穩(wěn)定劑或者增加所述化合物溶解度以使得可制備高濃縮溶液的試劑??诜褂玫乃幬镏苿┛赏ㄟ^以下方法獲得:將活性化合物與固體賦形劑結合,任選研磨所得混合物,并加工顆粒的混合物,在加入合適的助劑后(根據(jù)需要),得到片劑或錠劑核。合適的賦形劑為,特別是填充劑例如糖,包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇;纖維素制品例如玉米淀粉、小麥淀粉、水稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍樹膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)。如果需要,可加入分解劑,例如交聯(lián)的聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或其鹽(例如藻酸鈉)。任選地為錠劑核提供合適的包衣。為此目的,可使用濃縮的糖溶液,其任選地可包含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羧乙烯凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物??蓪⑷玖匣蝾伭霞尤胫了銎瑒┗蝈V劑包衣中用于識別或表征活性化合物劑量的不同組合??煽诜褂玫乃幬镏破钒ㄓ擅髂z制成的壓接式膠囊劑以及由明膠和增塑劑(例如甘油或山梨糖醇)制成的密封軟膠囊。壓接式膠囊可包含活性化合物,混有填充劑(例如乳糖)、粘合劑(例如淀粉)和/或潤滑劑(例如滑石或硬脂酸鎂)和任選的穩(wěn)定劑。在軟膠囊中,可將活性化合物溶解或懸浮于合適的液體中(例如脂肪油、液體石蠟、液體聚乙二醇)。此外,可加入穩(wěn)定劑。本申請通過引用的方式全文納入以下申請,用于所有目的:2005年5月26日提交、發(fā)明人為paulj.hergenrother、karsons.putt、gracew.chen、jenniferm.pearson的美國臨時申請60/684,807[代理所卷號47-05p];2006年3月28日提交、發(fā)明人為paulj.hergenrother、karsons.putt、gracew.chen、jenniferm.pearson的美國臨時申請60/743,878[代理所卷號47-05p1];2006年5月25日提交、發(fā)明人為paulj.hergenrother,karsons.putt,gracew.chen,jenniferm.pearson的美國專利申請11/420,425[代理所卷號47-05us];2006年5月26日提交、發(fā)明人為paulj.hergenrother、karsons.putt、gracew.chen、jenniferm.pearson的pct國際申請pct/us06/020910[代理所卷號47-05wo];2008年4月25日提交、發(fā)明人為paulj.hergenrother、karsons.putt、josephs.sandhurst、quinnp.peterson和valeriefako的pct國際申請pct/us2008/061510[代理所卷號73-07wo];2007年4月27日提交、發(fā)明人為paulj.hergenrother;karsons.putt;josephs.sandhurst;quinnp.peterson;valeriefako的美國臨時申請60/914,592[代理所卷號73-07p]。2009年10月23日提交的美國專利申請?zhí)?2/597,287[代理所卷號73-07us]。在本文列出的具有與本申請相同發(fā)明人的專利申請中作為主題組合物要求保護的化合物不是意欲作為本申請的主題組合物要求保護,意欲本申請中出現(xiàn)的充分公開內容能夠從權利要求中單獨或結合地排除每個化合物。關于通過引用方式納入和變化方案的聲明本申請全文的所有參考文獻——例如專利文獻,包括授予或授權的專利或同族專利;專利申請公開文本;未公開的專利申請;和非專利文獻或其它來源的資料——的全部內容通過引用的方式納入本文,就像各個通過引用納入一樣,至每篇參考文獻至少部分不與本申請的公開內容不一致的程度(例如對于部分不一致的參考文獻,除了該參考文獻部分不一致的部分之外通過引用的方式納入)。本文的任何附錄和附件都通過引用的方式作為說明書和/或附圖的一部分納入本文。在本文中使用術語“包含”、“包括”、“被包含”、“含有”處,應將其解釋為存在提及的所述特性、整數(shù)、步驟或組分,但不排除存在或添加一個或多個其它特性、整數(shù)、步驟、組分或一組上述內容。還意欲包括這樣的本發(fā)明的單獨實施方案,即其中術語“包含”、“包括”或“被包含”任選被語法上類似的術語替代,例如:“組成/構成”或“基本上由......組成/基本上由......構成”,以從而描述不必同延的其它實施方案。為了清楚起見,本文使用的“包含”與“具有”、“包括”、“含有”或“特征是”同義,并且是可兼的或開放式的,不排除其它未述及的要素或方法步驟。本文使用的“由......組成”排除所主張要素中沒有明確指出的任何要素、步驟、組分或成分。本文使用的“基本上由......組成”不排除不實質影響主張的基礎和新特征(例如不影響活性成分)的材料或步驟。在本文的每個實例中,術語“包含”、“主要由......組成”和“由......組成”的任一個可用另外兩個術語替代。本文示例性描述的本發(fā)明可在不存在本文未明確公開的任一種或多種元素、一個或多個限制條件下合適地實施。已參考多個具體且優(yōu)選的實施方案和技術描述了本發(fā)明。但是,應理解,在保持本發(fā)明的主旨和范圍的同時,可進行多種變化和修改。本領域普通技術人員應了解,本文具體描述之外的組合物、方法、裝置、裝置元件、材料、任選的特征、過程和技術都可作為本文廣義公開的內容被應用于實施本發(fā)明,無需借助過度的實驗。本文所述的組合物、方法、裝置、裝置元件、材料、過程和技術的所有本領域已知功能性等價物;及其部分;都意欲包括在本發(fā)明內。任何時候公開一個范圍,都意欲包括所有子范圍和單個的值。本發(fā)明不受公開的實施方案的限制,所述公開的實施方案包括附圖中所示的和說明書中示例性的任何實施方案,它們通過實例或示例而非限制的方式給出。本發(fā)明的范圍將僅被權利要求書限制。參考文獻2005年5月26日提交的美國臨時申請60/684,807;2006年3月28日提交的美國臨時申請60743878;2006年5月25日提交的美國專利申請11/420,425(2007年3月1日公開為us20070049602);2006年5月26日提交的pct國際申請pct/us06/020910(2006年11月30日公開為wo2006/128173)與本申請的主題有關,這些申請通過引用的方式納入本文。這些申請通過引用的方式具體地全文納入本文:2003年10月30日提交的hergenrother等人的美國臨時申請60/516556;2004年8月20日提交的hergenrother等人的美國臨時申請60/603246;2004年10月27提交的hergenrother等人的u.s.10/976,186。2005年5月26日提交的美國臨時申請60/684,807;2006年3月28日提交的美國臨時申請60743878;2006年5月25日提交的美國專利申請11/420,425;2006年5月26日提交的pct國際申請pct/us06/020910;2007年4月27日提交的美國臨時申請60/914,592。us6,762,045membranederivedcaspase-3,compositionscomprisingthesameandmethodsofusetherefore;us6,534,267polynucleotidesencodingactivatorsofcaspases;us6,403,765truncatedapaf-1andmethodsofusethereof;choong等人的us6,303,329;6,878,743,于2005年4月12日授權;wang,xiaodong等人的us20040077542,2004年4月22日公開;shi,yigong的us20040180828,2004年9月16日公開。sleeeaetal.,benzyloxycarbonyl-val-ala-asp(ome)fluoromethylketone(z-vad.fmk)inhibitsapoptosisbyblockingtheprocessingofcpp32,biochemj.1996apr1;315(pt1):21-4.1.papadopoulos,n.,kinzler,k.w.&vogelstein,b.theroleofcompaniondiagnosticsinthedevelopmentanduseofmutation-targetedcancertherapies.natbiotechnol24,985-95(2006).2.vogelstein,b.&kinzler,k.w.cancergenesandthepathwaystheycontrol.natmed10,789-99(2004).3.druker,b.j.etal.effectsofaselectiveinhibitoroftheabltyrosinekinaseonthegrowthofbcr-ablpositivecells.natmed2,561-6(1996).4.ciardiello,f.etal.antitumoreffectandpotentiationofcytotoxicdrugsactivityinhumancancercellsbyzd-1839(iressa),anepidermalgrowthfactorreceptor-selectivetyrosinekinaseinhibitor.clinicalcancerresearch6,2053-2063(2000).5.sala,e.etal.brafsilencingbyshorthairpinrnaorchemicalblockadebyplx4032leadstodifferentresponsesinmelanomaandthyroidcarcinomacells.molcancerres6,751-9(2008).6.salemo,p.etal.cytostaticactivityofadenosinetriphosphate-competitivekinaseinhibitorsinbrafmutantthyroidcarcinomacells.jclinendocrinolmetab(2009).7.hanahan,d.&weinberg,r.a.thehallmarksofcancer.cell100,57-70(2000).8.igney,f.h.&krammer,p.h.deathandanti-death:tumorresistancetoapoptosis.naturerev.cancer2,277-288(2002).9.zornig,m.,hueber,a.-o.,baum,w.&evan,g.apoptosisregulatorsandtheirroleintumorigenesis.biochim.biophys.acta1551,f1-f37(2001).10.fesik,s.w.promotingapoptosisasastrategyforcancerdrugdiscovery.natrevcancer5,876-885(2005).11.vassilev,l.t.etal.invivoactivationofthep53pathwaybysmall-moleculeantagonistsofmdm2.science303,844-848(2004).12.tovar,c.etal.small-moleculemdm2antagonistsrevealaberrantp53signalingincancer:implicationsfortherapy.proc.natl.acad.sci.usa103,1888-1893(2006).13.oltersdorf,t.etal.aninhibitorofbcl-2familyproteinsinducesregressionofsolidtumours.nature435,677-681(2005).14.li,l.etal.asmallmoleculesmacmimicpotentiatestrail-andtnfalpha-mediatedcelldeath.science305,1471-1474(2004).15.sun,h.etal.designofsmall-moleculepeptidicandnonpeptidicsmacmimetics.acc.chem.res.41,1264-1277(2008).16.o′donovan,n.etal.caspase3inbreastcancer.clincancerres9,738-42(2003).17.roy,s.etal.maintenanceofcaspase-3proenzymedormancybyanintrinsic″safetycatch″regulatorytripeptide.proc.natl.acad.sci.98,6132-6137(2001).18.krepela,e.,prochazka,j.,liul,x.,fiala,p.&kinkor,z.increasedexpressionofapaf-1andprocaspase-3andthefunctionalityofintrinsicapoptosisapparatusinnon-smallcelllungcarcinoma.biolchem385,153-68(2004).19.lzban,k.f.etal.characterizationoftheinterleukin-1β-convertingenzyme/ced-3-familyprotease,caspase-3/cpp32,inhodgkin′sdisease.am.j.pathol.154,1439-1447(1999).20.nakagawara,a.etal.highlevelsofexpressionandnuclearlocalizationofinterleukin-1βconvertingenzyme(ice)andcpp32infavorablehumanneuroblastomas.cancerres.57,4578-4584(1997).21.fink,d.etal.elevatedprocaspaselevelsinhumanmelanoma.melanomaresll,385-393(2001).22.persad,r.etal.overexpressionofcaspase-3inhepatocellularcarcinomas.modpathol.17,861-867(2004).23.putt,k.s.etal.small-moleculeactivationofprocaspase-3tocaspase-3asapersonalizedanticancerstrategy.natchembiol2,543-550(2006).24.peterson,q.p.etal.pac-1activatesprocaspase-3invitrothroughreliefofzinc-mediatedinhibition.jmolbiol388,144-158(2009).25.peterson,q.p.etal.procaspase-3activationasananti-cancerstrategy:structure-activityrelationshipofpac-1,anditscellularco-localizationwithprocaspase-3.jmedchem52,5721-5731(2009).26.paoloni,m.&khanna,c.translationofnewcancertreatmentsfrompetdogstohumans.natrevcancer8,147-156(2008).27.maría-lsabel,d.etal.neuraloverexcitationandimplicationofnmdaandampareceptorsinamousemodeloftemporallobeepilepsyimplyingzincchelation.epilepsia47,887-899(2006).28.domnguez,m.i.,blasco-ibez,j.m.,crespo,c.,marqus-mar,a.i.&martnez-guijarro,f.j.zincchelationduringnon-lesioningoverexcitationresultsinneuronaldeathinthemousehippocampus.neuroscience116,791-806(2003).29.clark,d.e.insilicopredictionofblood-brainbarrierpermeation.drugdiscovtoday8,927-33(2003).30.lavoie,n.etal.extracellularchelationofzincdoesnotaffecthippocampalexcitabilityandseizure-inducedcelldeathinrats.jphysiol578,275-89(2007).31.huang,s.,clark,r.j.&zhu,l.highlysensitivefluorescentprobesforzincionbasedontriazolyl-containingtetradentatecoordinationmotifs.org.lett.9,4999-5002(2007).32.bose,k.,pop,c.,feeney,b.&clark,a.c.anuncleavableprocaspase-3mutanthasalowercatalyticefficiencybutanactivesitesimilartothatofmaturecaspase-3.biochemistry42,12298-12310(2003).33.vichai,v.&kirtikara,k.sulforhodaminebcolorimetricassayforcytotoxicityscreening.nat.protocols1,1112-1116(2006).34.zalupski,m.etal.phaseiiicomparisonofdoxorubicinanddacarbazinegivenbybolusversusinfusioninpatientswithsoft-tissuesarcomas:asouthwestoncologygroupstudy.j.natl.cancerinst.83,926-932(1991).35.tagawa,m.etal.low-dosecytosinearabinosideregimeninducedacompleteremissionwithnormalkaryotypesinacasewithhypoplasticacutemyeloidleukaemiawithno.8-trisomy:invitroandinvivoevidencefornormalhaematopoieticrecovery.brjhaematol60,449-55(1985).36.anderson,h.,thatcher,n.,walling,j.&hansen,h.aphaseistudyofa24hourinfusionofgemcitabineinpreyiouslyuntreatedpatientswithinoperablenon-small-celllungcancer.brjcancer74,460-2(1996).37.satoh,t.etal.phaseistudyofym155,anovelsurvivinsuppressant,inpatientswithadvancedsolidtumors.clin.cancerres.15,3872-3880(2009).38.breen,m.&modiano,j.f.evolutionarilyconservedcytogeneticchangesinhematologicalmalignanciesofdogsandhumans--manandhisbestfriendsharemorethancompanionship.chromosomeres16,145-54(2008).39.dom,c.r.,taylor,d.o.&schneider,r.theepidemiologyofcanineleukemiaandlymphoma.biblhaematol,403-15(1970).40.kahl,b.chemotherapycombinationswithmonoclonalantibodiesinnon-hodgkin′slymphoma.seminhematol45,90-4(2008).41.garrett,l.d.,thamm,d.h.,chun,r.,dudley,r.&vail,d.m.evaluationofa6-monthchemotherapyprotocolwithnomaintenancetherapyfordogswithlymphoma.jvetintemmed16,704-9(2002).42.chun,r.,garrett,l.d.&vail,d.m.evaluationofahigh-dosechemotherapyprotocolwithnomaintenancetherapyfordogswithlymphoma.jvetinternmed14,120-4(2000).43.rassnick,k.m.etal.moppchemotherapyfortreatmentofresistantlymphomaindogs:aretrospectivestudyof117cases(1989-2000).jvetinternmed16,576-80(2002).44.veterinaryco-operativeoncologygroup-commonterminologycriteriaforadverseevents(vcog-ctcae)followingchemotherapyorbiologicalantineoplastictherapyindogsandcatsvl.o.vetcomponcol2,195-213(2004).45.padhani,a.r.&ollivier,l.therecist(responseevaluationcriteriainsolidtumors)criteria:implicationsfordiagnosticradiologists.brjradiol74,983-6(2001).46.frederickson,c.j.,koh,j.-y.&bush,a.i.theneurobiologyofzincinhealthanddisease.natrevneurosci6,449-462(2005).47.karakas,e.,simorowski,n.&furukawa,h.structureofthezinc-boundamino-terminaldomainofthenmdareceptornr2bsubunit.emboj28,3910-3920(2009).48.adler,m.,dinterman,r.e.&wannemacher,r.w.protectionbytheheavymetalchelatorn,n,n′,n′-tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine(tpen)againstthelethalactionofbotulinumneurotoxinaandb.toxicon35,1089-1100(1997).49.khanna,c.etal.thedogasacancermodel.natbiotechnol24,1065-6(2006).50.franklin,r.b.,milon,b.,feng,p.&costello,l.c.zincandzinctransportersinnormalprostateandthepathogenesisofprostatecancer.frontbiosci10,2230-2239(2005).51.beyersmann,d.&haase,h.functionsofzincinsignaling,proliferationanddifferentiationofmammaliancells.biometals14,331-341(2001).52.aiuchi,t.etal.zincionspreventprocessingofcaspase-3duringapoptosisinducedbygeranylgeraniolinhl-60cells.j.biochem.(tokyo)124,300-303(1998).53.chai,f.,truong-tran,a.q.,ho,l.h.&zalewski,p.d.regulationofcaspaseactivationandapoptosisbycellularzincfluxesandzincdeprivation:areview.immunol.cellbiol.77,272-278(1999).54.chimienti,f.,seve,m.,richard,s.,mathieu,j.&favier,a.roleofcellularzincinprogrammedcelldeath:temporalrelationshipbetweenzincdepletion,activationofcaspases,andcleavageofspfamilytranscriptionfactors.biochem.pharmacol.62,51-62(2001).55.huesca,m.etal.anovelsmallmoleculewithpotentanticanceractivityinhibitscellgrowthbymodulatingintracellularlabilezinchomeostasis.molecularcancertherapeutics8,2586-2596(200g).huang,s.;clark,r.j.;zhu,l.,highlysensitivefluorescentprobesforzinclonbasedontriazolyl-containingtetradentatecoordinationmotifs.org.lett.2007,9,4999-5002.patton,c.;thompson,s.;epel,d.,someprecautionsinusingchelatorstobuffermetalsinbiologicalsolutions.cellcalcium2004,35,427-431.naganawa,a.;matsui,t.;ima,m.;saito,t.;murota,m.;aratani,y.;kijima,h.;yamamoto,h.;maruyama,t.;ohuchida,s.;nakaia,h.;todaaet,m.,furtheroptimizationofsulfonamideaualogsasep1receptorantagonists:synthesisandevaluationofbioisosteresforthecarboxylicacidgroup.bioorgmedchem2006,14,7121-7137.putt,k.s.;chen,g.w.;pcarson,j.m.;sandhorst,j.s.;hoagland,m.s.;kwon,j.-t.;hwang,s.-k.;jin,h.;churchwell,m.i.;cho,m.-h.:doerge,d.r.;helferich,w.g.;hergenrother,p.j.,smallmoleculeactivationofprocaspase-3tocaspase-3asapersonalizedanticancerstrategy.naturechembiol2006,2,543-550.dauzonne,d.;folléas,b.;martinez,l.;chabot,g.g.,synthesisandinvitrocytotoxicityofaseriesof3-aminoflavones.europeanjournalofmediciaalchemistry1997,32,(1),71-82.hanahan,d.&weinberg,r.a.thehallmarksofcancer.cell100,57-70(2000).okada,h.&mak,t.w.pathwaysofapoptoticandnon-apoptoticdeathintumourcells.naturerev.cancer4,592-603(2004).roy,s.etal.maintenanceofcaspase-3proenzymedormancybyanintrinsic″safetycatch″regulatorytripeptide.proc.natl.acad.sci.98,6132-6137(2001).svingen,p.a.etal.componentsofthecelldeathmachineanddrugsensitivityof.thenationalcancerinstitutecelllinepanel.clin.cancerres.10,6807-6820(2004).lowe,s.w.,cepero,e.&evan,g.intrinsictumorsuppression.nature432,307-315(2004).vogelstein,b.&kinzler,k.w.achilles′heelofcancer.nature412,865-866(2001).traven,a.,huang,d.c.&lithgow,t.proteinhijacking:keyproteiusheldcaptiveagaiusttheirwill.cancercell5,107-108(2004).soengas,m.s.etal.inactivationoftheapoptosiseffectorapaf-1inmalignantmelanoma.nature409,207-211(2001).wajant,h.targetingthefliceinhibitoryprotein(flip)incancertherapy.mol.interv.3,124-127(2003).denicourt,c.&dowdy,s.f.targetingapoptoticpathwaysincancercells.science305,1411-1413(2004).vassilev,l.t.etal.invivoactivationofthep53pathwaybysmall-moleculeantagonistsofmdm2.science303,844-848(2004).degterev,a.etal.identificationofsmall-moleculeinhibitorsofinteractionbetweenthebh3domainandbcl-xl.naturecellbiol.3,173-182(2001).becattini,b.etal.rationaldesignandrealtime,in-celldetectionoftheproapoptoticactivityofanovelcompoundtargetingbcl-xl.chem.biol.11,389-395(2004).wang,j.-l.etal.structure-baseddiscoveryofanorganiccompoundthatbindsbcl-2proteinandinducesapoptosisoftumorcells.proc.natl.acad.sci.97,7124-7129(2000).li,l.etal.asmallmoleculesmacmimicpotentiatestrail-andtnfa-mediatedcelldeath.science305,1471-1474(2004).nguyen,j.t.&wells,j.a.directactivationoftheapoptosismachineryasamechanismtotargetcancercells.proc.natl.acad.sci.u.s.a.100,7533-7538(2003).jiang,x.etal.distinctiverolesofphapproteinsandprothymosin-αinadeathregulatorypathway.science299,223-226(2003).boatright,k.m.&salvesen,g.s.mechanismsofcaspaseactivation.curr.opin.cell.biol.15,725-731(2003).nakagawara,a.etal.highlevelsofexpressionandnuclearlocalizationofinterleukin-1βconvertingenzyme(ice)andcpp32infavorablehumanneuroblastomas.cancerres.57,4578-4584(1997).izban,k.f.etal.characterizationoftheinteleeukin-1β-convertingenzyme/ced-3-familyprotease,caspase-3/cpp32,inhodgkin′sdisease.am.j.pathol.154,1439-1447(1999).persad,r.etal.overexpressionofcaspase-3inhepatocellularcarcinomas.modernpatholo.17,861-867(2004).pop,c.,feeney,b.,tripathy,a.&clark,a.c.mutationsintheprocaspase-3dimerinterfaceaffecttheactivityofthezymogen.biochemistry42,12311-12320(2003).stennicke,h.r.etal.j.biol.chem.273,27084-27090(1998).denault,j.-b.&salvesen,g.s.humancaspase-7activityandregulationbyitsn-terminalpeptide.j.biol.chem.278,34042-24050(2003).putt,k.s.,beilman,g.j.&hergenrother,p.j.directquantitationofpoly(adp-ribose)polymerase(parp)activityasameanstodistinguishnecroticandapoptoticdeathincellandtissuesamples.chembiochem6,53-55(2005).liang,y.,nylander,k.d.,yan,c.&schor,n.f.roleofcaspase3-dependentbcl-2cleavageinpotentiationofapoptosisbybcl-2.mol.pharmacol.61,142-149(2002).fujita,n.,nagahshi,a.,nagashima,k.,rokudai,s.&tsuruo,t.accelerationofapoptoticcelldeathafterthecleavageofbcl-xlproteinbycaspase-3-likeproteases.oncogene17,1295-1304(1998).earnshaw,w.c.,martins,l.m.&kaufmann,s.h.mammaliancaspases:structure,activation,substrates,andfunctionsduringapoptosis.annu.rev.biochem.68,383-424(1999).koty,p.p.,zhang,h.&levitt,m.l.antisensebcl-2treatmentincreasesprogrammedcelldeathinnon-smallcelllungcancercelllines.lungcancer23,115-127(1999).nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)databaseofthenationallibraryofmedicine/nationallnstitutesofhealth(nih)website:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/usingthegenedatabasetosearchfbrcasp3(caspase3,apoptosis-relatedcysteineprotease[homosapiens]geneid:836locustag:hgnc:1504;mim:600636updated15-may-2005.otheraliases:hgnc;1504,apopain,cpp32,cpp32b,sca-1;otherdesignations:humanprocaspase3codingsequence;parpcleavageprotease;srebpcleavageactivityl;yama;caspase3;cysteineproteasecpp32).hergenrotherpj.obtainingandscreeningcompoundcollections:auser′sguideandacalltochemists.curropinchembiol.2006silvermansk,hergenrotherpj.combinatorialchemistryandmoleculardiversitytoolsfbrmoleculardiversificationandtheirapplicationsinchemicalbiology.curropinchembiol.2006.goodedr,sharmaak,hergenrotherpj.usingpeptidicinhibitorstosystematicallyprobethes1′siteofcaspase-3andcaspase-7.orglett.2005aug4;7(16):3529-32.pmid:16048334dothagerrs,puttks,allenbj,lesliebj,nesterenkov,hergenrotherpj.synthesisandidentificationofsmallmoleculesthatpotentlyinduceapoptosisinmelanomacellsthroughg1cellcyclearrest.jamchemsoc.2005jun22;127(24):8686-96.pmid:15954774puttks,hergenrotherpj.anonradiometric,high-throughputassayforpoly(adp-ribose)glycohydrolase(parg):applicationtoinhibitoridentificationandevaluation.analbiochem.2004oct15;333(2):256-64.pmid:15450800puttks,hergenrotherpj.anenzymaticassayforpoly(adp-ribose)polymerase-1(parp-1)viathechemicalquantitationofnad(+):applicationtothehigh-throughputscreeningofsmallmoleculesaspotentialinhibitors.analbiochem.2004mar1;326(1):78-86.pmid:14769338nesterenkov,puttks,hergenrotherpj.identificationfromacombinatoriallibraryofasmallmoleculethatselectivelyinducesapoptosisincancercells.jamchemsoc.2003dec3;125(48):14672-3.pmid:14640619putt,karsoneetal.,smallscaleactivationofprocaspase-3asapersonalizedanticancerstrategy,naturechemicalbiology2(10):543-550,s543/1-s543/29(2006).peterson,j.mol.biol2009,388,144-158.charkoudian,j.am.chem.soc.,2006,128,12424-12425.peterson,j.med.chem.,2009,52,5721-5731.當前第1頁12當前第1頁12