本發(fā)明屬于害蟲生物防治領(lǐng)域，涉及一株球孢白僵菌及其應(yīng)用，具體涉及一株對(duì)蠐螬具有高致病力的球孢白僵菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蠐螬,為鞘翅目金龜甲的幼蟲，別名核桃蟲、白土蠶，是國內(nèi)外公認(rèn)難于測(cè)報(bào)和防治的重大土棲性害蟲。其種類多達(dá)30000余種,我國目前已記錄約1800種,植物地下部受害的86%是由蠐螬造成。

蠐螬食性雜、食量大，棲息于地下，具有隱蔽性和滯后性，時(shí)常造成根莖嚴(yán)重受損，植株萎蔫死亡，農(nóng)作物減產(chǎn)甚至絕收。近幾年隨著種植結(jié)構(gòu)調(diào)整和大面積保護(hù)性耕作體制的快速發(fā)展，許多地區(qū)的蠐螬蟲口密度不斷上升，危害程度加重，為害規(guī)律有所改變，為害損失逐年加劇。由于蠐螬的生物習(xí)性和生活環(huán)境特點(diǎn)，使化學(xué)農(nóng)藥的施用和防治效果受到限制，而且頻繁使用化學(xué)農(nóng)藥造成的殘留問題、環(huán)境污染問題已引起各界人士擔(dān)憂。因此，防治蠐螬的難度比較大。

目前，對(duì)于蠐螬的防治主要采用物理、化學(xué)和生物防治。在物理防治上，可采用燈光誘捕成蟲、翻耕拾撿幼蟲、適時(shí)澆水處理等措施，不但浪費(fèi)勞動(dòng)力，且見效慢。在化學(xué)防治上，曹耿全等人（蠐螬對(duì)花生的為害特點(diǎn)及防治措施.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2004，10（2）:66）一直主要依靠化學(xué)殺蟲劑辛硫磷，多屬于中高毒性，以直接灌溉或藥劑拌撒的方式進(jìn)行防治，不但在土壤滲透過程中有許多不確定的因素，造成投入成本高、污染環(huán)境的問題，而且出現(xiàn)蠐螬產(chǎn)生抗藥性、作物產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問題。在生物防治上，利用昆蟲病原真菌可作為控制花生蠐螬的安全方法和有效途徑，張冰等人（綠僵菌防治高爾夫草坪蠐螬試驗(yàn)[J].草業(yè)科學(xué)，2008，（11）：125-128）利用綠僵菌分生孢子對(duì)蠐螬進(jìn)行防治,但是由于防治效果的不穩(wěn)定性和緩效性,而限制了它的廣泛應(yīng)用。宋益良等人（吉林乳狀菌的分離與防治大黑金龜幼蟲試驗(yàn)初報(bào)[J]．吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，1983，2:64-68）報(bào)道了利用乳狀菌對(duì)蠐螬進(jìn)行防治，由于環(huán)境因素影響，乳狀菌對(duì)蠐螬的致病作用非常緩慢，通常需要幾個(gè)月或一年以上，效果并不明顯。

目前雖然已有一些關(guān)于綠僵菌菌株的篩選和田間防治效果的報(bào)道，其穩(wěn)定性和時(shí)效性較差。但利用球孢白僵菌對(duì)蠐螬進(jìn)行防治的報(bào)道很少，缺乏一種穩(wěn)定優(yōu)良性狀的白僵菌菌株，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的效益和農(nóng)作物的產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)。此外，白僵菌具有易培養(yǎng)、易儲(chǔ)藏、施用簡便等優(yōu)點(diǎn)，而且在土壤中的存活時(shí)間較長，用它防治地下害蟲，不僅在防治期間效果明顯，而且殘效期長，所以利用白僵菌來控制地下害蟲危害的潛力很大。因此，篩選對(duì)蠐螬高致病力的球孢白僵菌菌株是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)研究工作，使之能夠在土壤中存活定殖并融入生態(tài)環(huán)境中，建立起可持續(xù)控制蠐螬的生態(tài)機(jī)制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服缺乏優(yōu)良的白僵菌菌株而限制了對(duì)蠐螬的生物防治，本發(fā)明的首要目的是提供一株對(duì)蠐螬具有高致病力的球孢白僵菌菌株。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述球孢白僵菌菌株在防治蠐螬方面的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一株對(duì)蠐螬具有高致病力的球孢白僵菌菌株菌株為球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbQLU1，已于2015年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），保藏編號(hào)：CGMCC NO.11618。

該球孢白僵菌菌株BbQLU1具有以下特征：

在SDAY培養(yǎng)基上25～28℃條件下生長4～5天，菌落的平均直徑17mm,16天后達(dá)到65mm。菌落初期為乳白色絨毛狀，后期有淡黃色粉狀孢子層呈中心凸起狀態(tài)。分生孢子多數(shù)近似為球形，少數(shù)為卵圓形，透明光滑，平均大小為2.67（2.26～4.38）×1.86（1.54～2.49）μm。

本發(fā)明所提供的或所述的菌劑可用于防治蠐螬幼蟲。

本發(fā)明所提供球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbQLU1對(duì)蠐螬幼蟲具有較強(qiáng)的侵染致病能力。實(shí)驗(yàn)室采用體壁侵染的方法，將一組30～40頭一齡蠐螬幼蟲在30ml 10⁸個(gè)孢子/ml的懸液中浸漬10s，并以0.02%吐溫-80的浸漬作為空白對(duì)照。每組幼蟲置于直徑15cm的大號(hào)培養(yǎng)皿中，在25℃和12:12h條件下保持50天，每隔一天觀察記錄死亡數(shù)，各處理重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)期間處理組和對(duì)照組蠐螬的累計(jì)死亡數(shù)量，計(jì)算半致死時(shí)間LT_5O，評(píng)估防治效果。

本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：本發(fā)明提供了一株對(duì)蠐螬幼蟲具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其應(yīng)用，對(duì)防治蠐螬幼蟲提供了一種生物防治資源。同時(shí)利用白僵菌進(jìn)行生物防治具有安全可靠、無污染、藥性持久、致病力強(qiáng)的特點(diǎn)，利用白僵菌幼蟲，解決了用化學(xué)方法防治蠐螬產(chǎn)生的農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題，具有良好的開發(fā)潛力和生產(chǎn)價(jià)值。

附圖說明

圖1是本發(fā)明球孢白僵菌（Beauveria bassiana）分子鑒定的N-J系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是蠐螬被球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbQLU1的感染狀。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所使用的試劑、材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

下述實(shí)施例中的SADY培養(yǎng)基為薩氏培養(yǎng)基，其具體配方為葡萄糖40g，瓊脂20g，酵母浸膏10g，水1000ml。

實(shí)施例1球孢白僵菌BbQLU1的鑒定

1.1分離純化

本次采用的分離方法是僵蟲分離法。從山東省農(nóng)科院長清科研基地采集到的蠐螬僵蟲放在滅菌的培養(yǎng)皿中，經(jīng)0.1%升汞酒精（用95%的酒精1000ml溶解1g升汞）表面消毒3～4min，再用無菌水洗滌三次，將消毒的僵蟲放置于SDAY平板的培養(yǎng)基的中央，在26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14天，將其體表的白粉狀物輕輕抖落到盛有0.1%的吐溫-80的水溶液的三角瓶中，用磁力攪拌子劇烈震蕩使白僵菌分生孢子單個(gè)分開。將孢子懸浮液進(jìn)行梯度稀釋，利用移液槍吸取少量菌液滴到SDAY培養(yǎng)基平板上，并利用涂布器均勻涂布，置于26～28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

當(dāng)在培養(yǎng)基上長出單個(gè)純白色的菌落，及時(shí)用接種環(huán)挑出并及時(shí)轉(zhuǎn)到另一個(gè)滅菌的SDAY培養(yǎng)基平板上，繼續(xù)培養(yǎng)觀察并沒有其他雜菌侵染，純化培養(yǎng)即完成。

1.2形態(tài)學(xué)鑒定

將分離純化的球孢白僵菌菌株在直徑為90mm平板SADY培養(yǎng)基上于上25～28℃條件下培養(yǎng)，3～4天后從平板上挑取白色菌絲制片在顯微鏡下觀察菌株的菌絲和分生孢子的形態(tài)；12天后挑取成熟的分生孢子制片觀察分生孢子的形態(tài)與大小。14～16天觀察記錄菌落的形態(tài)特征。菌落初期為乳白色絨毛狀，后期有淡黃色的粉狀的孢子層呈中心凸起狀態(tài)。菌絲呈簇狀生長，有分枝，無色光滑；在后期由于營養(yǎng)缺乏等各種限制條件，細(xì)胞均生于對(duì)稱成直角的茸狀產(chǎn)孢細(xì)胞頂端，分生孢子梗呈直角分支聚團(tuán)成簇。分生孢子多數(shù)近似為球形，少數(shù)為卵圓形，透明，光滑，平均大小為2.67（2.26～4.38）×1.86（1.54～2.49）um。

1.3菌株的ITS序列擴(kuò)增、序列測(cè)定及分子測(cè)定

將分離純化的5種菌株分別制成孢子懸液，分別接種于SDAY平板表面的玻璃紙上，于25℃下培養(yǎng)3～4天后收獲菌絲，參照Raeder&Broda(1985)的方法提取DNA，步驟如下：

稱取1g鮮菌絲置于預(yù)冷研缽中，液氮研磨至粉末。加入4mL DNA提取液[0.2M Tris·HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,10mM EDTA,1%SDS]，繼續(xù)研磨后轉(zhuǎn)移至離心管，冰浴3～5min。加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合液，劇烈震蕩3min，4℃下1840g離心10min。吸取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液，顛倒混勻后于4℃下1200g離心10min。吸取上清液，加入1/10體積3M NaAC緩沖液(pH 5.3)和2.5倍體積乙醇，混勻后在-20℃下沉淀1h。4℃下10000g離心10min，棄上清后再用0.5mL 75%乙醇洗滌沉淀，再4℃下9300g離心5min。自然干燥3～5min后，加入0.6mL無菌水溶解，再加入2μL RNAase，在37℃下保溫15min。重復(fù)一輪酚/氯仿抽提，最后用0.2mL無菌水溶解DNA。

白僵菌樣品DNA-ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增體系為25μl:其中上述提取的DNA 1.0μl;委托公司合成真菌ITS區(qū)通用引物ITS-4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS-5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）各1.0μl；2×Taq PCR MasterMix(含染料)12.5μl；ddH2O 9.5μl。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃復(fù)性30s，72℃延伸40s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min，用無菌水代替模板作為陰性對(duì)照。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳條帶檢測(cè)后確認(rèn)樣品DNA-ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增產(chǎn)物符合測(cè)序要求后。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化之后，送到鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)定的結(jié)果與NCBI基因數(shù)據(jù)庫的白僵菌菌株序列進(jìn)行比對(duì)。

測(cè)序結(jié)果與NCBI基因數(shù)據(jù)庫比對(duì)表明：經(jīng)引物ITS4單項(xiàng)引物測(cè)序的結(jié)果顯示分離的5株白僵菌核糖體DNA-ITS的長度為560-581bp,其中BbQLU1菌株DNA-ITS堿基序列為572bp,與NCBI數(shù)據(jù)庫的5株球孢白僵菌的同源性達(dá)99.21%。因此，BbQLU1為球孢白僵菌菌株（Beauveria bassiana）。

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbQLU1，已于2015年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡稱CGMCC），登記入冊(cè)編號(hào)為：CGMCC NO.11618。

實(shí)施例2球孢白僵菌BbQLU1的生物學(xué)特性

2.1營養(yǎng)生長速率的測(cè)定

將球孢白僵菌BbQLU1采用十倍稀釋法涂布于貼有玻璃紙SDAY平板培養(yǎng)基上，25～28℃和12:12(L:D)h條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用十字交叉法每天測(cè)量1次菌落的直徑，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，共觀察15天。

表1球孢白僵菌BbQLU1的生長速率測(cè)定

由表1可見，球孢白僵菌BbQLU1的菌落的生長比較快，9天后菌落的平均直徑為26mm，15天菌落的直徑達(dá)67mm。

2.2產(chǎn)孢量測(cè)定

將培養(yǎng)好的100μl分生孢子液涂布于SDAY上，在25℃和12:12(L:D)h條件下培養(yǎng)3d后，用打孔器從平板上截取直徑5mm的菌片，在超聲波破碎儀上將菌片上的分生孢子振動(dòng)洗入2ml 0.02%吐溫80中，濾去菌絲，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算測(cè)定孢子濃度，再換算為每cm²平板上的產(chǎn)孢量。每個(gè)平板打3個(gè)孔進(jìn)行孢子含量測(cè)定取其平均值,作為1個(gè)重復(fù)的孢子數(shù)。各菌株重復(fù)測(cè)定3次。

表2球孢白僵菌BbQLU1的生長量測(cè)定

由表2可見，球孢白僵菌BbQLU1的菌株第四天開始出現(xiàn)白色分生孢子，產(chǎn)孢量為0.05×10⁸個(gè)/cm²。

2.3致病力的測(cè)定

取5株菌株BbQLU1、BbQLU2、BbCPS1、BbCPS2、BbCPS3進(jìn)行蠐螬幼蟲致病力的測(cè)定，菌株分別采自山東濟(jì)南市、山東煙臺(tái)市和江蘇常州市，經(jīng)過分離純化獲得，經(jīng)鑒定均為球孢白僵菌。用含有0.1%的吐溫-80的無菌水將原液配制成1×10⁸孢子/ml的孢子懸浮液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)區(qū)，每區(qū)30頭，每只浸蘸10s，每天觀察記錄幼蟲的死亡情況,連續(xù)觀察50天。

表3不同菌株對(duì)蠐螬幼蟲的致病力的測(cè)定

由表3可知，本發(fā)明的菌株BbQLU1對(duì)蠐螬幼蟲的致病力最強(qiáng)，使蠐螬的幼蟲的致病率達(dá)到95.6%，略高于其他供試菌株BbQLU2。

實(shí)施例3球孢白僵菌BbQLU1對(duì)蠐螬幼蟲的防治效果

3.1孢懸液的制備

將單孢分離純化的球孢白僵菌菌種置于SDAY培養(yǎng)基培養(yǎng)13-16天，讓其長出大量的分生孢子，用滅菌的不銹鋼鑰匙將培養(yǎng)好的分生孢子刮入一個(gè)滅過菌的盛有0.1%的吐溫-80無菌水的100ml的離心管中，在快速振蕩器上充分震蕩混勻，用規(guī)格為（25格×16格）血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子懸浮液（該懸浮液即為球孢白僵菌BbQLU1菌劑）中的孢子的個(gè)數(shù)，并按照公式計(jì)算分生孢子的濃度，進(jìn)而將原液按照一定的比例進(jìn)行稀釋配制成濃度為1×10⁸個(gè)/ml，備用。

3.2試蟲接種

本次試驗(yàn)的致病性的測(cè)定是利用浸蘸法，根據(jù)以上配制成的1×10⁸個(gè)/ml的孢子懸浮液對(duì)1齡健康的蠐螬幼蟲進(jìn)行浸蘸，浸蘸時(shí)間為10s，置于無菌的濾紙上，任其爬行晾干身體上的水分，然后放入無菌的塑料飯盒中，并以碎木屑為食物。每個(gè)濃度梯度3次重復(fù)，每重復(fù)20頭試蟲，以0.1%的吐溫-80作為對(duì)照。處理后每天觀測(cè)1次，記錄試蟲的死亡數(shù)。死蟲保濕培養(yǎng)觀察菌絲生長及產(chǎn)孢情況（蟲尸上長出肉眼可見的菌絲及孢子），并挑片在顯微鏡下觀察是否為白僵菌感染致死，統(tǒng)計(jì)死亡率以及感染率。

白僵菌BbQLU1采用10⁸個(gè)/ml的孢子懸浮液接種蠐螬幼蟲30天后，蠐螬幼蟲的死亡率達(dá)到90%以上，死亡高峰期在15-25天。實(shí)驗(yàn)組5天后就出現(xiàn)死蟲，經(jīng)保濕培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，感染率為90%以上，而對(duì)照組未出現(xiàn)感染的現(xiàn)象。統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)期間處理組和對(duì)照組蠐螬的累計(jì)死亡數(shù)量，經(jīng)DPS統(tǒng)計(jì)分析得到LT₅₀(半致死時(shí)間)。結(jié)果表明，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbQLU1菌株對(duì)一齡蠐螬幼蟲的LT₅₀為22.6天，顯著優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)菌株的防治效果。