本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00673的應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

口腔頜面部惡性腫瘤是常見高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，容易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。研究表明，這種腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，其中抑癌基因的失活與癌基因的激活發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。

長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200nt、缺少特異完整的開放閱讀框、無(wú)或很少有蛋白編碼功能的RNAs分子。最近的研究表明，lncRNAs通過(guò)在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平廣泛調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，它們參與了生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老及死亡等重要生命活動(dòng)的調(diào)控。越來(lái)越多的研究表明lncRNAs的異常表達(dá)或功能缺失與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一些lncRNAs分子在腫瘤的診斷和治療方面具有重要的意義，且可以作為腫瘤預(yù)后判斷新的分子標(biāo)記。目前，已經(jīng)克隆的人類lncRNAs基因已超過(guò)4萬(wàn)多個(gè)，但絕大部分lncRNA的功能未知。

我們檢測(cè)了LINC00673在臨床離體腫瘤樣本中的表達(dá)水平，并分析了LINC00673表達(dá)水平與臨床病例資料的相關(guān)性。我們從口腔腫瘤及相對(duì)應(yīng)的正常對(duì)照組織中抽提RNA后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)了LINC00673的表達(dá)情況，結(jié)果顯示LINC00673在口腔腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。我們隨后又利用原位雜交的方法，進(jìn)一步在存檔石蠟樣本驗(yàn)證了LINC00673在口腔腫瘤中表達(dá)顯著上調(diào)，因此針對(duì)LINC00673的檢測(cè)制劑可用于口腔腫瘤的輔助診斷，結(jié)合臨床回訪資料進(jìn)行生存曲線分析發(fā)現(xiàn)LINC00673表達(dá)高的患者其生存時(shí)間短于該lncRNA表達(dá)低的患者，因此針對(duì)該lncRNA的檢測(cè)制劑也可以用于口腔腫瘤的預(yù)后判斷。

我們還針對(duì)該lncRNA基因的序列設(shè)計(jì)并合成了用于抑制LINC00673表達(dá)的小RNA干擾序列(siRNAs)，利用siRNAs在口腔腫瘤細(xì)胞系中抑制了LINC00673的表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)抑制該lncRNA表達(dá)可抑制口腔腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移能力。因此針對(duì)該lncRNA的抑制制劑也具有口腔腫瘤基因治療的潛在用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供lncRNALINC00673的應(yīng)用方法，利用檢測(cè)LINC00673的試劑可以制備用于口腔腫瘤輔助診斷或者預(yù)后預(yù)測(cè)的制劑。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00673的應(yīng)用，檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00673的試劑用于制備口腔腫瘤輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的試劑，該長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00673的序列見SEQ NO:1。

所述的口腔腫瘤輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的試劑為實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)制劑。用于實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)LINC00673表達(dá)的引物序列：

正向引物：5’-TTCTCCTGTAACGTGTGGCC-3’，

反向引物：5’-CTGGTGGGAATGTGGATCAGT-3’。

一種口腔腫瘤輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的試劑盒，包括用于實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)LINC00673表達(dá)的引物：

正向引物：5’-TTCTCCTGTAACGTGTGGCC-3’，

反向引物：5’-CTGGTGGGAATGTGGATCAGT-3’。

試劑盒中還含有內(nèi)參基因GAPDH特異性PCR引物：

正向引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

試劑盒中還含有：

(1)從口腔腫瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無(wú)酶水；

(2)以總RNA為模板將LncRNA LINC00673逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及隨機(jī)引物；

(3)將cDNA實(shí)時(shí)定量PCR所用試劑，包括實(shí)時(shí)熒光定量SYBR染料、無(wú)酶水。

我們從口腔腫瘤及正常口腔上皮樣本中抽提RNA后逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)了LINC00673的表達(dá)，結(jié)果顯示LINC00673在口腔腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。提示LINC00673可作為口腔腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志。本發(fā)明為口腔腫瘤的輔助診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)工具，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和重要的推廣應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)口腔腫瘤離體樣本中LINC00673的表達(dá)水平；

LINC00673在口腔腫瘤(T)中的表達(dá)比正常對(duì)照(N)樣本中顯著上調(diào)；

圖2原位雜交檢測(cè)LINC00673在口腔腫瘤及正常口腔粘膜中的表達(dá)；

左圖為正?？谇徽衬そM織，右圖為口腔腫瘤組織(放大倍數(shù)：200×)，LINC00673在口腔腫瘤中表達(dá)水平較高；

圖3為口腔腫瘤中LINC00673的表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性；

LINC00673低表達(dá)的患者預(yù)后比LINC00673高表達(dá)或不表達(dá)者好，即LINC00673高表達(dá)的患者更快死亡。

圖4為在口腔癌細(xì)胞中導(dǎo)入LINC00673的干擾siRNA序列，可顯著抑制LINC00673在口腔癌細(xì)胞中的表達(dá)；圖中si673為導(dǎo)入LINC00673的干擾siRNA序列的口腔癌細(xì)胞，NC為陰性對(duì)照；

在口腔癌細(xì)胞系Tca8113中導(dǎo)入靶向LINC00673的siRNA混合物后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了口腔癌細(xì)胞中LINC00673的表達(dá)情況，LINC006730的表達(dá)均受到明顯的抑制。陰性對(duì)照(NC)為Scramble干擾siRNA序列。

圖5為在口腔癌細(xì)胞中導(dǎo)入LINC00673的siRNA抑制LINC00673表達(dá)后，細(xì)胞遷移能力降低；圖中si673為導(dǎo)入LINC00673的干擾siRNA序列的口腔癌細(xì)胞，NC為陰性對(duì)照；

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在口腔癌細(xì)胞系Tca8113中轉(zhuǎn)入靶向LINC00673的siRNA，抑制LINC00673的表達(dá)后，劃痕愈合速度減慢，表明細(xì)胞向劃痕中央遷移的能力降低。

圖6為在口腔癌細(xì)胞中導(dǎo)入LINC00673的siRNA抑制LINC00673表達(dá)后，細(xì)胞侵襲能力降低；圖中si673為導(dǎo)入LINC00673的干擾siRNA序列的口腔癌細(xì)胞，NC為陰性對(duì)照；

細(xì)胞穿膜(transwell)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在口腔癌細(xì)胞系Tca8113中轉(zhuǎn)入靶向LINC00673的siRNA，抑制LINC00673的表達(dá)后，能穿過(guò)基質(zhì)膠膜的口腔癌細(xì)胞數(shù)目顯著減少，表明細(xì)胞侵襲能力降低。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

實(shí)施例1，實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)證實(shí)LINC00673在口腔腫瘤中表達(dá)上調(diào)

1.材料與方法：

15例正?？谇徽衬ず?5例口腔腫瘤組織抽提總RNA，2μg RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

正向引物：5’-TTCTCCTGTAACGTGTGGCC-3’，

反向引物：5’-CTGGTGGGAATGTGGATCAGT-3’。

用于對(duì)照的內(nèi)參看家基因GAPDH特異性PCR引物：

正向引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)步驟

反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，各基因的表達(dá)強(qiáng)度根據(jù)CT值(threshold cycle values)、內(nèi)參基因(GAPDH)標(biāo)化后，采用group t-test檢驗(yàn)計(jì)算P值。

2.結(jié)果

LncRNA LINC00673在正常對(duì)照組織中表達(dá)較低，而在口腔腫瘤組織中有較高表達(dá)P＝0.02(圖1)

實(shí)施例2，原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LINC00673在口腔腫瘤中的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)

1.材料方法

1.1用于口腔腫瘤和正常對(duì)照組織原位雜交的寡核苷酸探針

根椐LINC00673基因序列分析設(shè)計(jì)出雜交參數(shù)最佳特異性最好的3條寡核苷酸探針，另外，以看家基因GAPDH為陽(yáng)性對(duì)照。

用于原位雜交檢測(cè)LINC00673表達(dá)的寡核苷酸探針：

LINC00673探針1：

5’-GAAAAACCTCTTGCACCACCTTAGTCTCCAAAGA-3’；

LINC00673探針2：5’-CTTTCCTGTTCTTTCTCCTACCCTTCCTGACTAG-3’；

LINC00673探針3：5’-CATGAAGTAATAATAAAGGTTCCGCTTATCAACC-3’。

陽(yáng)性對(duì)照探針(檢測(cè)看家基因GAPDH)：

GAPDH探針1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'；

GAPDH探針2：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'；

GAPDH探針3：5’-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3’。

寡核苷酸探針采用化學(xué)合成方法合成

1.2寡核苷酸探針標(biāo)記試劑盒和原位雜交檢測(cè)試劑

Dig Oligonucleitide Tailing Kit(2^nd Generation)試劑盒(Roche公司)，抗地高辛-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物檢測(cè)試劑盒(Anti-Digoxigenin-POD，F(xiàn)ab fragments，Roche公司)。增強(qiáng)原位表達(dá)檢測(cè)信號(hào)的TSA信號(hào)放大系統(tǒng)(TSA^TM Biotin System，NEL700試劑盒，PerkinElmer公司)。DAB染色試劑盒(北京中山公司)。20×SSC，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去離子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脫氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，變性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(yeast t-RNA，tRNA)，DTT，50×Denhardts’s solution，PBS buffer，胃蛋白酶K，BSA(牛血清清蛋白)，三乙醇胺(TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.5％Blocking Reagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)醋酸酐，阻斷試劑(Blocking reagent agent，Roche公司)。

1.3其他主要試劑和材料

無(wú)水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松節(jié)油、雙蒸水、PBS緩沖液(pH7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L)；3％甲醇-雙氧水溶液(80％甲醇和30％雙氧水配置)；0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(citrate buffer,CB，pH6.0±0.1，9ml 0.1M檸檬酸溶液和41ml 0.1M檸檬酸鈉溶液加入450ml蒸餾水中臨時(shí)配置后再校正工作液pH值)；0.1％胰蛋白酶；蘇木素；1％鹽酸酒精(1ml濃鹽酸+99ml 70％酒精配置)；組織微陣列專用封片膠(PTS Cure MountⅡ)；專用蓋玻片(480×240mm²)定制于鄭州玻璃儀器廠。Leica低熔點(diǎn)(58℃)石蠟，國(guó)產(chǎn)蜂蠟，無(wú)水酒精，二甲苯，10％中性多聚甲醛(0.01mol/L,pH7.4，DEPC雙蒸水和PBS緩沖液配制)，蘇木素，伊紅，中性封片樹膠，蓋玻片，載玻片。

1.4寡核苷酸探針的標(biāo)記

利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit進(jìn)行寡核苷酸探針標(biāo)記，反應(yīng)體系如下。

100pmol oligonucleotide+ddH2O＝9μl(control:control oligonucleutide 5μl+ddH₂O 4μl)

混勻，稍離心。37℃水浴反應(yīng)30min，加2ul EDTA(0.2M，pH 8.0)中止反應(yīng)。

1.5寡核苷酸探針標(biāo)記后純化

為了增加標(biāo)記探針的純度，需對(duì)已標(biāo)記的探針進(jìn)行純化，具體操作如下：

a)探針?lè)磻?yīng)混合物(22μl)+2.5μl 4M LiCL+75μl 100％冷乙醇(-20℃).

b)-70℃沉淀60min，or-20℃2h。

c)13.000×g 4℃離心15min。

d)棄上清，用50μl冰冷的70％(V/V)乙醇洗滌。

e)13.000xg 4℃，離心5min。

f)棄上清，真空4℃干燥。

g)用無(wú)菌雙蒸水重溶探針。

1.6組織切片雜交前處理

a)4℃保存的組織切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蠟。

b)二甲苯依次脫蠟3×5min。

c)梯級(jí)酒精洗滌，100％酒精2×2min→95％酒精1×5min→70％酒精1×5min→50％酒精1×5min→DEPC水洗滌2×3min→DEPC-PBS洗滌2×5min。

d)滴加300μl胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。

e)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗滌1min，中止反應(yīng)。

f)切片入0.2N HCL，于37℃反應(yīng)20-30min，增加組織的通透性。

g)切片用4％多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定10min，室溫。

h)為了增加組織陽(yáng)性雜交強(qiáng)度，對(duì)切片進(jìn)行乙?；幚?。切片入0.25％乙酸酐BufferⅠ(0.1M三乙醇胺)，室溫10min。

i)1M PBS洗滌2×5min。

1.7組織預(yù)雜交和雜交

a)預(yù)雜交：-20℃保存的預(yù)雜交液，先置于37℃孵育60min，預(yù)雜交液的用量為每平方厘米切片面積12.5μl，相應(yīng)大小的石蠟?zāi)じ采w切片，37℃濕盒中預(yù)雜交2小時(shí)。(預(yù)雜交液成份包括：2XSSC，10％Dextran sulphate，1X Denhardt’s solution，50mM Phosphate Buffer(PH 7.0)，50mM DTT，250μl，100μg/ml poly A，5μg/ml poly dA，250μg/ml yeast t-RNA，500μg/ml ssDNA，47％Deionized formamide)。

b)移去石蠟?zāi)?，甩掉預(yù)雜交液，切片置于2×SSC中5min。

c)雜交反應(yīng)：37℃雜交過(guò)夜(18-20h)。每一切片加入250μl雜交液并用石蠟?zāi)じ采w。預(yù)雜交液中加入相應(yīng)的探針就成為雜交液。雜交液在預(yù)雜交時(shí)配制，放置37℃孵育，使探針充分溶解于雜交液中，本實(shí)驗(yàn)用多條寡核苷酸探針混合，按每一探針500ng/ml濃度配制成探針雜交液。地高辛加尾標(biāo)記試劑盒標(biāo)記探針濃度計(jì)算依據(jù)：每一探針的濃度按其與陽(yáng)性定量探針時(shí)檢測(cè)反應(yīng)時(shí)顯色進(jìn)行比對(duì)和100pmol 30個(gè)堿基的裸探針標(biāo)記反應(yīng)理論探針產(chǎn)量為900ng兩種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合計(jì)算出標(biāo)記探針的濃度。

d)雜交后洗滌，切片浸入2×SSC，10min，揭去石蠟?zāi)ぁＲ来斡趽u床上搖動(dòng)洗滌，2×SSC(0.5％SDS)，2×15min→0.25×SSC(0.5％SDS)，2×15min。

1.8雜交后顯色檢測(cè)反應(yīng)

a)采用Anti-Digoxigenin-POD檢測(cè)地高辛探針與目的RNA結(jié)合復(fù)合物；TSA放大系統(tǒng)增強(qiáng)原位雜交反應(yīng)顯色反應(yīng)的陽(yáng)性信號(hào)，DAB顯色。

b)切片轉(zhuǎn)至TNT緩沖液中，3×5min。

c)滴加TNB阻斷緩沖液，300μl/TMAs，室溫，30min。

d)不洗，吸去多余阻斷劑，1:100稀釋的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1％Triton X-100+1％阻斷劑)，室溫4小時(shí)。

e)TNT Buffer(0.1M Tris-HCl,PH7.5,0.15M NaCL,0.05％Tween 20)洗3×5min。

f)切片上滴加信號(hào)放大試劑Biotinyl Tyamid，300μl/TMAs，(Biotinyl Tyramid貯存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO，Biotinyl Tyramid工作液：1×稀釋液，1:50稀釋Biotinyl Tyramid貯存液)，室溫10分鐘。

g)TNT洗，3×5min。

h)切片滴加SA-HRP(鏈霉卵白素-辣根過(guò)氧化物酶)，300μl/TMAs，室溫30min。

i)TNT洗，3×5min。

j)蒸溜水洗滌，1×1min。

k)DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)。

l)蘇木素復(fù)染，

m)酒精梯級(jí)脫水，切片干燥。

n)滴加組織切片專用封片膠，相應(yīng)規(guī)格的蓋玻片蓋片，切片膠帶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)配備的紫外燈下交聯(lián)切片1min。

1.9結(jié)果判斷及標(biāo)準(zhǔn)

應(yīng)用光學(xué)顯微鏡分別在低倍和高倍鏡下進(jìn)行觀察，首先觀察目標(biāo)RNA的陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)在觀察目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的定位：位于細(xì)胞核、細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。

再分別以該檢測(cè)RNA表達(dá)部位陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)度和陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)兩種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評(píng)分，判斷標(biāo)準(zhǔn)為：(1)依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度判斷：a.細(xì)胞無(wú)染色，記0分；b.細(xì)胞染成淺棕色為弱陽(yáng)性，記1分；c.細(xì)胞染成棕色且無(wú)背景著色，或細(xì)胞染成深棕色并有淺棕色背景為中等陽(yáng)性，記2分；d.細(xì)胞染成深棕色且無(wú)背景著色為強(qiáng)陽(yáng)性，記3分。(2)依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)計(jì)分：a.無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，記0分；b.陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≤25％，記1分；c.25％＜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜50％，記2分；d.陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≥50％，記3分。

為了盡量降低評(píng)分結(jié)果的主觀因素，由兩位病理學(xué)專家分別按上述標(biāo)準(zhǔn)之一各自進(jìn)行判斷和評(píng)分，再將兩者評(píng)分相乘，結(jié)果為：①0分者最終計(jì)為0分，認(rèn)為陰性表達(dá)；②1分和2分者最終計(jì)為1分，認(rèn)為弱陽(yáng)性表達(dá)；③3分和4分者最終計(jì)為2分，認(rèn)為中等陽(yáng)性表達(dá)；④6分到9分者最終計(jì)為3分，認(rèn)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

1.10分析和統(tǒng)計(jì)軟件

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用χ²test或Fisher exact test，相關(guān)性分析采用Spearmen correlation方法；P＜0.05即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存曲線分析采用Kaplan-Meier method及l(fā)og-rank test；多變量分析采用Cox’s proportional hazards model；P＜0.05即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

1)lncRNA LINC00673在口腔腫瘤及正常對(duì)照組織中的表達(dá)

LINC00673在正常對(duì)照組織中均不表達(dá)或者表達(dá)很低(圖2左)，而在大部分口腔腫瘤組織中表達(dá)較高(圖2右)，兩者之間具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2)Kaplan-Meier生存分析

我們對(duì)所有202例口腔腫瘤患者進(jìn)行了電話隨訪，詳細(xì)詢問(wèn)了他們的首發(fā)時(shí)間、治療情況、有無(wú)復(fù)發(fā)、有無(wú)再患其他疾病、復(fù)發(fā)及死亡時(shí)間等，并登記了生存時(shí)間和狀態(tài)，并對(duì)口腔腫瘤組織中LINC00673的表達(dá)與病人的生存時(shí)間和狀態(tài)進(jìn)行的生存分析，發(fā)現(xiàn)LINC00673高表達(dá)的患者生存時(shí)間較LINC00673表達(dá)低或者不表達(dá)的患者要短(圖3)。說(shuō)明LINC00673是一個(gè)與口腔腫瘤預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記，該lncRNA表達(dá)低，病人預(yù)后好。

實(shí)施例3，siRNA干擾LINC00673的表達(dá)

1.材料方法

1.1試劑及試劑盒

TRIZOL^TM Reagent(Invitrogen)；

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(#A3500，Promega)；

抗生素G418(Ameresc)。

1.2shRNA的設(shè)計(jì)

首先將LINC00673序列輸入Invitrogen公司的Block-It RNAi designer軟件，尋找該lncRNA的siRNA最佳靶點(diǎn)，挑選最佳的2條相應(yīng)的靶點(diǎn)序列如下：

siRNA-1：:5'-CCAGUUGUCCUUGACUGCAUGGUUU-3'，

siRNA-2：5'-AGGGAACCACAGGAUUCCAUGUGAU-3'

陰性對(duì)照Scramble序列：5’-GACACGCGACUUGUACCAC-3’。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

口腔癌細(xì)胞系Tca8113購(gòu)自中南大學(xué)細(xì)胞中心，細(xì)胞培養(yǎng)所用RPMI 1640培基和胎牛血清，及消化細(xì)胞所用的胰蛋白酶均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的口腔癌細(xì)胞系Tca8113按2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，將6孔板置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50-70％密度即可開始siRNA的轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染過(guò)程如下：

在無(wú)菌EP管中加入3μl的Hipefect于100μl無(wú)血清培養(yǎng)基中混勻靜置5min；

將2條siRNA混合加入100μl無(wú)血清培養(yǎng)基中；然后與上述包含Hipefect的100μl無(wú)血清培養(yǎng)基溫和混勻，室溫靜置30分鐘，使siRNA與脂質(zhì)體形成復(fù)合體；

用D-Hank's液洗滌細(xì)胞3次；

將上述混合物中加入800μl無(wú)血清培養(yǎng)基(無(wú)抗生素)，溫和混勻后加入6孔板中的1個(gè)孔；

將6孔板置于CO₂培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)6小時(shí)，然后棄上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)siRNA干擾lncRNA表達(dá)的效果：

將siRNA轉(zhuǎn)染后的口腔癌細(xì)胞抽提總RNA，2μg RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

LINC00673正向引物：5’-TTCTCCTGTAACGTGTGGCC-3’，

LINC00673反向引物：5’-CTGGTGGGAATGTGGATCAGT-3’。

用于對(duì)照的GAPDH

正向引物為5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)步驟

反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，各基因的表達(dá)強(qiáng)度根據(jù)CT值(threshold cycle values)、內(nèi)參基因(GAPDH)標(biāo)化后，采用group t-test檢驗(yàn)計(jì)算P值。

2.結(jié)果

siRNA轉(zhuǎn)染口腔癌細(xì)胞Tca8113后，可顯著下調(diào)口腔癌細(xì)胞中LINC00673的表達(dá)水平(圖4)。

實(shí)施例5，LINC00673 siRNA抑制口腔癌細(xì)胞中LINC00673的表達(dá)和口腔癌的侵襲遷移

1.材料方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的口腔癌細(xì)胞Tca8113按2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，將6孔板置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50-70％密度即可開始LINC00673 siRNA轉(zhuǎn)染。

1.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞遷移能力的實(shí)驗(yàn)方法。轉(zhuǎn)染了LINC00673 siRNA干擾序列或?qū)φ招蛄?scramble)的口腔癌細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到90％時(shí)，用200ul pipet在每個(gè)6孔板中劃一條直線(劃痕)，隨后在0、24、48、60小時(shí)等各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(視不同細(xì)胞遷移能力而定)在顯微鏡下觀察劃痕愈合情況，拍照，并計(jì)算各組細(xì)胞遷移速度。

1.3細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞穿膜((Transwell)實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞侵襲能力的實(shí)驗(yàn)方法。Transwell小室(孔徑8μm)及基質(zhì)膠(Matrigel)購(gòu)自美國(guó)BD公司，4％多聚甲醛固定液、結(jié)晶紫染液(0.1％g/ml)購(gòu)自Sigma公司。將Matrigel按1:8稀釋，包被在Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30分鐘使Matrigel聚合成凝膠。使用前按BD公司說(shuō)明書進(jìn)行基質(zhì)膠膜水化。

在每個(gè)Transwell小室上層加入無(wú)血清培養(yǎng)基和1×10⁵個(gè)轉(zhuǎn)染了LINC00673siRNA和陰性對(duì)照的口腔癌細(xì)胞，在Transwell小室下層加入含20％胎牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)36小時(shí)后，用4％多聚甲醛固定液固定，結(jié)晶紫染色，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍。在顯微鏡下觀察穿過(guò)基質(zhì)膠膜的口腔癌細(xì)胞。

2.結(jié)果

2.1在口腔癌細(xì)胞中導(dǎo)入LINC00673的干擾序列抑制LINC00673表達(dá)后，細(xì)胞遷移能力降低

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在口腔癌細(xì)胞系Tca8113中轉(zhuǎn)入靶向LINC00673的干擾序列，抑制LINC00673的表達(dá)后，口腔癌細(xì)胞從劃痕兩邊往劃痕中央遷移的速度減慢，劃痕愈合的時(shí)間延長(zhǎng)，表明細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力降低(圖5)。

2.2在口腔癌細(xì)胞中導(dǎo)入LINC00673 siRNA抑制LINC00673后，細(xì)胞侵襲能力降低

細(xì)胞穿膜(Transwell)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在口腔癌細(xì)胞系Tca8113中轉(zhuǎn)入靶向LINC00673 siRNA，抑制LINC00673的表達(dá)后，能穿過(guò)基質(zhì)膠膜的口腔癌細(xì)胞數(shù)目顯著減少，表明細(xì)胞侵襲能力降低(圖6)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大學(xué)

<120> 長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00673的應(yīng)用

<130> 無(wú)

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2275

<212> RNA

<213> LINC00673 RNA序列

<400> 1

agggcgcgca ggcggcgcgg gugcgcggug cggcgcuggu auccagagga cgcggucacc 60

gccucuggca uuugucguuc ugcgcuucuc cgcaaggacc cucuguuagg caggcgccca 120

ccguaagccu cccgggccuu gugaaccugc aaacccaagu cugagagacg auccgccuuc 180

agcgcuuucc agcuuggcag agaggcuuuc ccggcgggga ucuuugguug gcgcuggcga 240

ugcgcgggga agaaaggcga ggagcggcgu ccaggcuggg ugauguccca gcacgaguag 300

gcgggaugcg cucgcuuggu ccuccgggcg cccggucccu gcccgcgucg cgcgcccacc 360

ccuggggacg agaaggcggc cgccugagga cccccgcccg cgaccuccgc gagucuggag 420

cgcagaggac agggucuggc ugcucuuugg ccuuggaugg aaagugggga auuggguggg 480

gggcugcgga ccccuuaacg uggauuacuu gguguguauc agcugggcuc agaagaccca 540

cgaccucuuc uccauccgug gauugauuug uucugcuuaa cagcuggguc gccaagcugg 600

agguauuuuu cccucuccac ccuggucuuc uccuguaacg uguggccgcc uuuuccagca 660

cggccuccug ccuuccuggu gcacuuuuug gagaacgugg uggaaucaga gguuucuggc 720

ugacucggug ggugcuuuga accaggaaag gacaagaaag aggaugggaa ggacugaucc 780

acauucccac caggaaguuu agcagaaccc ccgcgugcca ccuggacccc uuggaaggac 840

cuggcucagg cuggaccacc ucuugagagg caggagcucu ggauuugauc aagaauucuu 900

ugcugagcau ggugccucau gccuauaauc ccaacacuuu gggaggccag ugugggagga 960

ucucuugagc ccaggaguuc aagacuagcc ugggcaacac agagagaccc caucucuaaa 1020

auaauaauaa uaauaaaaua aaaaauuagc agggcauggu ggcaugugcc uguaguccca 1080

gcuacccagg aggcugaggc aagaggaugg cuggagccug ggauguugag gcugcaauga 1140

acugugauua ccccacugca cuccagccug ggcaaaagag cgagagaccc ugucucaaau 1200

aauaauaaua auaauaaucu uauuuuggag aauaaagaga ccucuggauu ugaggugcca 1260

uuuggguaga aagaaaagac guuuacaccg agaaauaguc uguguugccc ugaaggagca 1320

gagggaugca ucgcuggagg ugaccuacag uugaagaaga cucauuauga cagaccuugu 1380

ccuucuuccu uguggaaagu guuuccucug cugcuacugc ucaugagacu cuucccccuc 1440

ccugucccag ggaaccaaag ggcuuucuac cacacccuuu cuugcccccc gccucccaug 1500

ucugcugugc cuuuguacuc agcaauucuu guuugcucca uuaucuucca gccggauaca 1560

gagugaauag uuaaccacac uuaggucaaa uaggaucuaa auuuuuguuc cugcuccgug 1620

uaaagaggcc aguguuugug uguugcaagc agccuuggaa uaguaacucu ucucauuugu 1680

uugggaucug gccaccaagu uccagaauga uacacggauc agugcagaag uucaucaggc 1740

ucucggaccu uagggcuguu ggagaaggcu ucagcagcag aacugauggu gaaggcucgu 1800

guucuccauc cucaacuuuc uuugcuucga ucauacacaa gaauacauuu ggaagggcaa 1860

aaaaugaaca cugucguuca uugcagccgu guuuugugac acagaugcac agucugcugu 1920

gaagaccuuc ucucaagugg cauuugggag uccaugccag aucauggugc uucaugagag 1980

acugacagcu aucagggguu guggcacuua gugaggacuc uccuccccca gugugugcug 2040

augacacaua cacaccugac aauagcuuga gucuucucug uuccuuuuac ucuguagcca 2100

acauacacau gauuuaaaac ccuuucuaaa uaucuaucau gguucauccu uguccaaaug 2160

cagagucaga gcuauuugua cuucauuauu auuuccaagg cgaauaguug gcuuucuuuu 2220

ugcaaaaaua auuaaaguuu uuguauguug caguugcaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2275

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)LINC00673表達(dá)的正向引物

<400> 2

ttctcctgta acgtgtggcc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)LINC00673表達(dá)的反向引物

<400> 3

ctggtgggaa tgtggatcag t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 內(nèi)參基因GAPDH特異性PCR正向引物

<400> 4

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 內(nèi)參基因GAPDH特異性PCR反向引物

<400> 5

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 原位雜交檢測(cè)LINC00673表達(dá)的寡核苷酸探針1

<400> 6

gaaaaacctc ttgcaccacc ttagtctcca aaga 34

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 原位雜交檢測(cè)LINC00673表達(dá)的寡核苷酸探針2

<400> 7

ctttcctgtt ctttctccta cccttcctga ctag 34

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 原位雜交檢測(cè)LINC00673表達(dá)的寡核苷酸探針3

<400> 8

catgaagtaa taataaaggt tccgcttatc aacc 34

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> GAPDH探針1

<400> 9

ccactttacc agagttaaaa gcagccctgg 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> GAPDH探針2

<400> 10

gtcagaggag accacctggt gctcagtgta 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> GAPDH探針3

<400> 11

cagtagaggc agggatgatg ttctggagag 30

<210> 12

<211> 25

<212> RNA

<213> siRNA-1

<400> 12

ccaguugucc uugacugcau gguuu 25

<210> 13

<211> 25

<212> RNA

<213> siRNA-2

<400> 13

agggaaccac aggauuccau gugau 25

<210> 14

<211> 19

<212> RNA

<213> 陰性對(duì)照Scramble序列

<400> 14

gacacgcgac uuguaccac 19