本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種內(nèi)皮祖細胞氧化應(yīng)激模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類具有游走特性的能定向增殖分化為成熟血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，主要起源于骨髓，在成人的外周血中少量存在，其對于缺血組織的血管新生和損傷血管的再內(nèi)皮化起著重要作用。氧化應(yīng)激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子活性自由基(FR)產(chǎn)生過多，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，大量FR不斷聚積，從而導(dǎo)致組織損傷，引發(fā)各種疾病。氧化應(yīng)激的標志物包括活性氧自由基(ROS)如:陰離子(O^2－)、羥自由基(OH)和過氧化氫(H₂O₂)等和活性氮自由基(RNS)，如:一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO₂)和過氧化亞硝酸鹽(ONOO^－)等。雖然，對氧化應(yīng)激的高抵抗力是干細胞的特征性表現(xiàn)，內(nèi)皮祖細胞線粒體基質(zhì)中抗氧化酶MnGSH-PX和GPx-1高表達，具有一定的抗氧化應(yīng)激能力。但在長期氧化應(yīng)激存在的情況下，氧化應(yīng)激通過減弱其抗氧化酶的表達，增加氧化酶的表達，促進內(nèi)皮祖細胞的凋亡和老化而影響其功能及數(shù)量，抑制內(nèi)皮祖細胞的增殖和遷移，影響其動員。

氧化低密度脂蛋白是低密度脂蛋白氧化修飾后的產(chǎn)物，氧化低密度脂蛋白具有很強的細胞毒性，可選擇性作用于細胞循環(huán)周期的S期，對增殖活躍期細胞的細胞毒作用更強。氧化低密度脂蛋白可以阻止VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細胞分化，促進其老化，導(dǎo)致細胞功能失調(diào)。

現(xiàn)有技術(shù)經(jīng)常用高糖作用于內(nèi)皮祖細胞，研究糖尿病等高糖處理模型相關(guān)疾病。目前還未見關(guān)于內(nèi)皮祖細胞氧化應(yīng)激模型建立方法的研究報道。氧化低密度脂蛋白處理內(nèi)皮細胞建立氧化應(yīng)激模型，對于研究動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等心血管疾病和相應(yīng)的抗氧化物質(zhì)以及機理有廣闊的應(yīng)用空間。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種內(nèi)皮祖細胞氧化應(yīng)激模型的構(gòu)建方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

所述內(nèi)皮祖細胞氧化應(yīng)激模型建立的方法包括如下步驟：

(1)將購買的人外周血單個核細胞接種在人纖連蛋白涂層(FN)的多孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加入1mL M199培養(yǎng)液，于37℃，5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(2)培養(yǎng)2—4d，優(yōu)選3d后洗去未貼壁細胞，添加M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔2—4d，優(yōu)選3d換M199培養(yǎng)液；

(3)用胰酶消化經(jīng)步驟(2)培養(yǎng)的細胞制成細胞懸液，取細胞懸液并加入與細胞懸液等體積的氧化低密度脂蛋白，得混合液，氧化低密度脂蛋白在混合液中的終濃度為50至200μg/mL，優(yōu)選為100μg/mL；再于37℃5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20—30h，優(yōu)選24h；

(4)用胰酶消化經(jīng)步驟(3)培養(yǎng)的細胞，離心后用PBS洗滌，然后用MTT法測定細胞生長抑制率，用細胞樣用流式細胞儀測定細胞凋亡情況，并測定代表細胞氧化應(yīng)激情況的參數(shù)，構(gòu)建成內(nèi)皮祖細胞氧化應(yīng)激模型；優(yōu)選的離心條件為在1000g離心5min。

其中，所述M199培養(yǎng)液中含有胎牛血清、VEGF、bFGF、青霉素及鏈霉素；所述胎牛血清的重量百分比含量為10％，VEGF的濃度為10ng/mL，bFGF的濃度為10ng/mL，青霉素的濃度為100U/mL，鏈霉素的濃度為100U/mL。

步驟(3)氧化低密度脂蛋白的制備方法如下：將低密度脂蛋白在EDTA的0.01mol/L PBS中4℃透析24h，去除EDTA，然后在終濃度含80μmol/LCuCl₂的PBS中37℃氧化24h，冷卻至4℃終止氧化，即得氧化低密度脂蛋白。

步驟(4)所述代表細胞氧化應(yīng)激情況的參數(shù)包括活性氧、GSH-Px和線粒體膜電位。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明內(nèi)皮祖細胞氧化應(yīng)激模型首次為內(nèi)皮祖細胞的研究構(gòu)建了模型，且所用的氧化低密度脂蛋白對于內(nèi)皮祖細胞的損傷也鮮見報導(dǎo)，本發(fā)明所述的培養(yǎng)條件和方法，能夠幫助內(nèi)皮祖細胞氧化應(yīng)激的研究人員，比較順利的完成內(nèi)皮祖細胞氧化應(yīng)激模型的構(gòu)建。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。

實施例1：

所述內(nèi)皮祖細胞氧化應(yīng)激模型的構(gòu)建方法包括如下步驟：

1、將購買的人外周血單個核細胞接種在人纖連蛋白涂層(FN)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每孔加入1mL包含有10％胎牛血清、VEGF(10ng/mL)、bFGF(10ng/mL)、青霉素(100U/mL)及鏈霉素(100U/mL)的M199培養(yǎng)基，置37℃，5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2、3天后洗去未貼壁細胞，添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔3天換培養(yǎng)液。

3、制備氧化低密度脂蛋白:新購置的低密度脂蛋白在EDTA的0.01mol/L PBS中4℃透析24h，去除EDTA，然后在終濃度含80μmol/LCuCl₂的PBS中37℃氧化24h，冷卻至4℃終止氧化，鑒定氧化低密度脂蛋白氧化程度后再使用。

4、用胰酶消化細胞制成細胞懸液，取適量的紅細胞懸液，加入與懸液等體積的氧化低密度脂蛋白，其終濃度分別為0、50、100、150、200μg/mL，37℃5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

5、將培養(yǎng)后的內(nèi)皮祖細胞用胰酶消化，在1000g離心3分鐘，PBS洗兩次后，細胞樣用MTT法測定其生長抑制率，用流式細胞儀測定凋亡情況，并測定活性氧，GSH-Px和線粒體膜電位等代表其氧化應(yīng)激情況的參數(shù)。(結(jié)果見表1).

表1不同濃度氧化低密度脂蛋白產(chǎn)生活性氧、GSH-Px的量和線粒體膜電位及細胞生長抑制率和凋亡比例

通過以上結(jié)果可以看出，氧化低密度脂蛋白可以誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞的氧化應(yīng)激，且隨著濃度的增大內(nèi)皮祖細胞的氧化損傷效果也越明顯，因此，可以以氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)構(gòu)建內(nèi)皮祖細胞的氧化應(yīng)激模型。在具體應(yīng)用此模型來評估具抗氧化能力的活性物質(zhì)的功效時，可將藥物組與損傷組、正常組作比較，通過各個組氧化應(yīng)激參數(shù)的比較來衡量，此時，100μmol/ml損傷效果明顯但不過于嚴重，為較適宜的濃度。

實施例2：應(yīng)用氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)構(gòu)建的內(nèi)皮祖細胞的氧化應(yīng)激模型進行具有抗氧化能力的活性物質(zhì)的篩選

經(jīng)實施例1損傷方法處理內(nèi)皮祖細胞，選取1—3號樣品進行試驗，待細胞單層鋪滿80％，用無血清M199培養(yǎng)基配置成不同濃度的樣品溶液，每孔加入不同濃度的藥液至800μL，使每孔終濃度與實驗設(shè)計相符，每組設(shè)3個復(fù)孔。分別按實施例1中方法，檢測氧化應(yīng)激相關(guān)參數(shù)。(結(jié)果見表2)

表2不同樣品處理內(nèi)皮祖細胞后產(chǎn)生活性氧、GSH-Px的量和線粒體膜電位及細胞生長抑制率和凋亡比例

與對照組比較，模型組(藥物濃度100μmol/ml)氧化損傷嚴重，細胞損傷最大。與模型組比較，53個候選樣品，均能降低凋亡比例、細胞生長抑制率，并減少活性氧的產(chǎn)生，升高線粒體膜電位，增加GSH-Px的量。據(jù)此可認為3種活性物質(zhì)對氧化應(yīng)激造成的內(nèi)皮祖細胞損傷具有一定的保護作用。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。