本發(fā)明屬于基因工程制藥領(lǐng)域，涉及全人源抗人死亡受體5(deathreceptor5，DR5)的單鏈抗體篩選、鑒定、表達(dá)和純化，及其在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用。發(fā)明背景腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducingligand，也稱APO2L)是腫瘤壞死因子超家族的成員，含281個氨基酸，與其他TNF超家族成員一樣，TRAIL是II型跨膜蛋白，包含N端的跨膜區(qū)域和C端的胞外區(qū)域[NaganeM.，etal.Neuro-oncology2010，12(7)：687-700]。TRAIL在體內(nèi)僅以膜結(jié)合型存在，但胞外區(qū)域可以通過基因工程方法以可溶形式表達(dá)出來并保持一定的活性。目前已知TRAIL在體外均能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，作用范圍廣。體外實(shí)驗表明，無論膜結(jié)合型TRAIL，還是單獨(dú)以可溶形式存在的胞外區(qū)截斷型TRAIL，都能迅速誘導(dǎo)多種細(xì)胞表面具有TRAIL特異性受體的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[FanQ.，etal.SciRep.2013，3：3565]。體內(nèi)外實(shí)驗表明，TRAIL與死亡受體結(jié)合可選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而對大多數(shù)正常細(xì)胞無明顯的殺傷作用[SubbiahV.，etal.MolCancerTher2012，11(11)：2541-2546]，因此受到廣泛關(guān)注。TRAIL可選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而對大多數(shù)正常細(xì)胞無明顯的殺傷作用的機(jī)制，目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為是由于TRAIL有四種膜結(jié)合受體，分別是兩種死亡受體DR4、DR5，大多分布于腫瘤細(xì)胞表面；兩種誘騙受體DcR1、DcR2，大多分布于正常細(xì)胞表面。死亡受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)包含了死亡結(jié)構(gòu)域，能夠介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而DcR1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)不含死亡結(jié)構(gòu)域，DcR2的死亡結(jié)構(gòu)域被截斷，因此兩個誘騙受體都不能介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[SheridanJ.，etal.Science，1997，277：818-821]。但也正是因為其具有多個結(jié)合受體，使得其容易產(chǎn)生耐藥性[Sheridan，J.，etal.Science，1997，277:818-821；MerinoD.，etal.Molecularandcellularbiology2006，26(19)：7046-7055]，而且其在體內(nèi)半衰期短(約30分鐘)[HerbstRS.，etal.Journalofclinicaloncology：officialjournaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology2010，28(17)：2839-2846]。研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL對于肝臟細(xì)胞存在一定的毒性，而這種毒性的產(chǎn)生主要是由于死亡受體DR4介導(dǎo)的[JoM.，etal.NatMed.2000May；6(5)：564-7；SecchieroP.，etal.Blood.2004Jan15；103(2)：517-22；DiPietroR.，etal.Blood2001，97(9)：2596-2603]。為了克服TRAIL的這些缺點(diǎn)，篩選死亡受體DR5特異性的激活性抗體被認(rèn)為是一種有效方法[HollandPM.Cytokine&growthfactorreviews2014，25(2)：185-193]。DR5作為一個與TRAIL特異性結(jié)合的死亡受體，屬I型跨膜蛋白，富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域及死亡結(jié)構(gòu)域。研究表明，死亡受體DR5高水平地表達(dá)于許多腫瘤組織，如結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、胰腺癌、睪丸癌、前列腺癌等[MengRD.，etal.MolTher.2000Feb；1(2)：130-144；NavalJ.，etal.ExpCellRes.2007Jul1；313(11)：2378-2388；El-DeiryWS.，etal.SeminCancerBiol.2003Apr；13(2)：135-147]。由于死亡受體DR5在細(xì)胞分布及作用機(jī)制的獨(dú)特性，使其成為抗腫瘤藥物開發(fā)的理想靶點(diǎn)。2001年Ichikawa制備出人死亡受體DR5特異的激活型單克隆抗體TRA-8，這是特異性針對人細(xì)胞膜表面死亡受體DR5而合成的單克隆抗體，它能特異性地與死亡受體DR5相結(jié)合，發(fā)揮配體的作用，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，目前單克隆抗體TRA-8作為抗腫瘤藥物也正處于臨床研究階段[KendrickJE.，etal.Gynecologiconcology2008，108(3)：591-597]。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種新的并具有潛在藥用價值的全人源抗人死亡受體DR5的單鏈抗體。本發(fā)明通過噬菌體展示技術(shù)，以人死亡受體DR5胞外區(qū)蛋白做為靶抗原從高容量的全人源噬菌體抗體庫中經(jīng)五輪篩選，獲得特征為特異性結(jié)合人死亡受體DR5的胞外區(qū)，在體外能夠激活死亡受體DR5誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的單鏈抗體TR2-3。本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：一種全人源的抗人死亡受體5的單鏈抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過柔性肽連接，所述重鏈可變區(qū)包含重鏈CDR1、CDR2和CDR3域，所述重鏈CDR1域的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，重鏈CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，重鏈CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；所述輕鏈可變區(qū)包含輕鏈CDR1、CDR2和CDR3域，所述輕鏈CDR1域的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，輕鏈CDR2域的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，輕鏈CDR3域的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；所述柔性肽氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。所述重鏈CDR1、CDR2、CDR2域和/或輕鏈CDR1、CDR2、CDR2域可以是經(jīng)過氨基酸置換或者修飾后得到的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO：1，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO：2，或者所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)被取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。本發(fā)明所述全人源抗死亡受體DR5單鏈抗體TR2-3基因序列全長735個核苷酸，預(yù)期有245個氨基酸。具有122個氨基酸的重鏈可變區(qū)(SEQIDNO：1，見圖3)和108個氨基酸的輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO：2，見圖4)，通過15個氨基酸的柔性肽SEQIDNO.9連接。本發(fā)明的另一個目的是提供一種可以表達(dá)和純化上述抗死亡受體DR5的單鏈抗體的方法。全人源單鏈抗體TR2-3基因連接到表達(dá)載體PCANTAB5E，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主HB2151。經(jīng)0.5mMIPTG、30℃誘導(dǎo)表達(dá)20h，利用超聲破碎細(xì)胞，低溫離心去除細(xì)胞碎片，將上清液用鎳離子親和層析柱和分子排阻層析柱進(jìn)行分離純化單鏈抗體TR2-3。WesternBlot鑒定分離純化得到的單鏈抗體TR2-3。本發(fā)明的另一目的是提供表達(dá)本發(fā)明所述的全人源的抗人死亡受體5的單鏈抗體的表達(dá)載體和/或宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明所述的全人源的抗人死亡受體5的單鏈抗體在制備具有抗腫瘤作用的藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。所述腫瘤選自結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、胰腺癌、睪丸癌、前列腺癌等。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供的一種全人源的抗人死亡受體5的單鏈抗體通過體外試驗表明，該單鏈抗體對結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205和乳腺癌細(xì)胞MDA-MA-231均有著明顯的抑制作用，具有明顯的抗腫瘤活性。同時該單鏈抗體還實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌的可溶性表達(dá)，具有制備工藝簡單、產(chǎn)品純度高和易擴(kuò)大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1：ELISA檢測噬菌體展示單鏈抗體的結(jié)合活性。NC，陰性對照；1-20，克隆序列號。OD450nm數(shù)值大于陰性對照3倍以上即為陽性克隆。圖2：MTT法進(jìn)行的單鏈抗體對結(jié)腸癌COLO205細(xì)胞活性鑒定結(jié)果圖。圖3：TR2-3重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列用下劃線標(biāo)注。圖4：TR2-3輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。所述VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列用下劃線標(biāo)注。圖5：單鏈抗體TR2-3基因的表達(dá)載體示意圖。圖6：單鏈抗體TR2-3通過鎳柱進(jìn)行分離純化的SDS-PAGE電泳圖。1，大腸桿菌破碎上清；2，鎳柱純化穿透液；3，含50mM咪唑的PBS緩沖液洗脫雜蛋白；4，含100mM咪唑的PBS緩沖液洗脫雜蛋白；5，含500mM咪唑的PBS緩沖液洗脫目的蛋白TR2-3；M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖7：純化所得TR2-3蛋白利用SEC-HPLC法進(jìn)行純度分析結(jié)果圖。圖8：WesternBlot法鑒定純化得到的TR2-3單鏈抗體。圖9：MTT法檢測單鏈抗體TR2-3對結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205及乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞增值抑制作用。圖10：WesternBlot法檢測單鏈抗體TR2-3對結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205中Caspase蛋白活化的作用。具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例說明本發(fā)明的具體步驟，但不受實(shí)施例限制。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體實(shí)施例并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，該實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。下述實(shí)例中所用的材料、試劑、裝置、儀器、設(shè)備等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1.人死亡受體DR5蛋白的表達(dá)純化以人死亡受體DR5的cDNA(北京義翹神州公司產(chǎn)品)為模板，PCR擴(kuò)增死亡受體DR5胞外區(qū)(1-130aa)的基因片段，克隆到表達(dá)載體pET21b上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行蛋白表達(dá)。表達(dá)條件為：按2％的接種量將種子液接種于2×YT-AG培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)至OD600nm＝0.6，加入終濃度為0.5mM的IPTG，20℃誘導(dǎo)20h。6000rpm，4℃離心15min，收集菌體；PBS重懸菌體，超聲破碎(超聲3s，間隙3s，共20min)；12000rpm，4℃離心30min，收集上清；上清分別通過鎳離子親和柱(GE公司產(chǎn)品)及分子排阻層析柱Superdex75(GE公司產(chǎn)品)進(jìn)行分離純化，得到的死亡受體DR5胞外區(qū)蛋白作為抗原用于后續(xù)的單鏈抗體篩選。實(shí)施例2.噬菌體人源單鏈抗體庫的構(gòu)建噬菌體人源單鏈抗體庫的構(gòu)建參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[SblatteroD.，etal.NatBiotechnol，2000，18∶74-80；SblatteroD.，etal.Immunotechnology，1998，3：271-278]。以105份健康人外周血及58份腫瘤病人外周血為來源，使用密度梯度離心的方法分離產(chǎn)生抗體的外周血淋巴細(xì)胞，提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(寶生物公司產(chǎn)品)，以此為模版，選用人特異性抗體可變區(qū)6條重鏈上游引物、4條重鏈下游引物、7條λ鏈上游引物和3條λ鏈下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[SblatteroD.，etal.NatBiotechnol，2000，18：74-80；SblatteroD.，etal.Immunotechnology，1998，3：271-278]，再于其兩端分別加上SfiI，NotI兩個酶切位點(diǎn)序列和Linker序列，經(jīng)SOE-PCR連接重鏈和輕鏈序列得到單鏈抗體scFv片段。按常規(guī)分子克隆操作，將單鏈抗體scFv片段克隆到噬菌粒載體pCANTAB5E的SfiI，NotI兩個酶切位點(diǎn)間。將單鏈抗體scFv片段與噬菌粒pCANTAB5E的連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1超級感受態(tài)細(xì)胞(biorad公司產(chǎn)品)，收集陽性菌落，得到人源單鏈抗體庫。通過滴度測定表明，最終獲得庫容為1.1×108的噬菌體人源單鏈抗體庫。實(shí)施例3.全人源的抗人死亡受體DR5單鏈抗體的篩選以包被緩沖液(50mMNaHCO3，pH9.6)稀釋死亡受體DR5胞外區(qū)蛋白至20ug/ml，取2ml加入免疫管中，室溫包被過夜；次日，棄上清，PBS迅速洗滌免疫管3次；2％MPBS(含有2％脫脂牛奶的PBS)，37℃封閉2h；棄封閉液，用PBS迅速洗滌免疫管3次；將噬菌體抗體庫(～1012pfu)懸浮于4ml2％MPBS并加入到免疫管中，置于旋轉(zhuǎn)搖床上反復(fù)旋轉(zhuǎn)2h，以含有0.1％Tween-20的PBS洗滌免疫管15次，再以PBS洗滌免疫管15次；加入1ml100mM三乙胺，室溫旋轉(zhuǎn)孵育10min，進(jìn)行特異性洗脫；0.5ml1MTris-HCl(pH7.4)緩沖液用于迅速中和洗脫下來的噬菌體；中和后的噬菌體用于感染對數(shù)期的大腸桿菌TG1，進(jìn)行擴(kuò)增和制備，用于下一輪篩選。實(shí)施例4.ELISA鑒定單鏈抗體的抗原結(jié)合活性挑取第五輪篩選后獲得的噬菌體單克隆到96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，每孔加入200ul含109pfuM13KO7的2×YT-AG培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)2h，2000rpm離心10min，棄上清，每孔重懸于200μ12×YT-AK培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)過夜。2000rpm，4℃離心10min，上清液于4℃保存，用于抗原結(jié)合活性ELISA鑒定。酶標(biāo)板的包被：用包被緩沖液(50mMNaHCO3，pH9.6)稀釋死亡受體DR5胞外區(qū)蛋白至5ug/ml，100ul每孔加入到96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過夜。取出后，用2％MPBS封閉液37℃封閉2h，離心去除封閉液。將上述獲得的單克隆噬菌體上清液加入到包被好抗原的96孔酶標(biāo)板中，37℃溫育2h。TBST洗板10次，每孔加入HRP標(biāo)記的anti-M13抗體(北京義翹神州產(chǎn)品)，37℃溫育1h。TBST洗板10次，加底物TMB顯色，酶標(biāo)儀測定OD450nm值。以M13KO7孔作為陰性對照，以高于陰性對照值三倍以上的作為陽性克隆(圖1)。陽性克隆送基因測序公司進(jìn)行基因測序。實(shí)施例5.抗人死亡受體DR5單鏈抗體的可溶性表達(dá)及分離純化按常規(guī)分子克隆操作，將實(shí)施例4中得到的8個單鏈抗體基因3’末端加上6×His標(biāo)簽序列后亞克隆至表達(dá)載體PCANTAB5E，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株HB2151。挑選陽性克隆，培養(yǎng)至OD600nm＝0.6，加入終濃度為0.5mM的IPTG，30℃誘導(dǎo)表達(dá)20h。6000rpm，4℃離心15min，收集菌體；PBS重懸菌體，超聲破碎(超聲3s，間隙3s，共30min)；12000rpm，4℃離心30min，收集上清；將上清液經(jīng)鎳離子親和層析柱(GE公司產(chǎn)品)進(jìn)行分離純化，用含不同濃度咪唑的PBS緩沖液洗脫雜蛋白與目的蛋白；12％SDS-PAGE檢測收集的樣品，將含有目的蛋白成分的洗脫液超濾濃縮，再通過分子排阻層析法(Superdex75，GE公司產(chǎn)品)進(jìn)一步純化單鏈抗體，對于獲得的蛋白樣品經(jīng)0.22um無菌濾膜過濾除菌后分裝，并于-80℃保存。結(jié)果如下表所示，有5個單鏈抗體蛋白實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，其余3個單鏈抗體蛋白以包涵體形式表達(dá)。單鏈抗體名稱表達(dá)形式TR2-1可溶性表達(dá)TR2-2包涵體TR2-3可溶性表達(dá)TR2-4包涵體TR2-5可溶性表達(dá)TR2-6可溶性表達(dá)TR2-7可溶性表達(dá)TR2-8包涵體實(shí)施例6.抗人死亡受體DR5單鏈抗體的活性鑒定選用細(xì)胞表面死亡受體DR5高表達(dá)的結(jié)腸癌COLO205細(xì)胞對獲得的5個單鏈抗體蛋白進(jìn)行活性檢測。在37℃、5％CO2的條件下將COLO205細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，0.5％胰酶消化細(xì)胞后用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并以5.0×104cells/ml的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，200μl/孔，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后用2％血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。加入不同濃度的單鏈抗體，孵育48h，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，以不加單鏈抗體孵育的細(xì)胞作為陰性對照；每孔加入10μl的MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150μ1DMSO，在酶標(biāo)儀570nm波長處測定光吸收值(OD值)。細(xì)胞增殖抑制率計算公式如下，細(xì)胞抑制率＝(1-(ODsample-ODblank)/(ODcontrol-ODblank))×100％。MTT分析結(jié)果顯示，單鏈抗體TR2-3對結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205有著明顯的抑制作用并存在劑量依賴關(guān)系，其余4個單鏈抗體活性較弱(圖2)，因此優(yōu)選得到人死亡受體DR5激動劑單鏈抗體TR2-3。實(shí)施例7.抗人死亡受體DR5單鏈抗體TR2-3的純度分析及WesternBlot鑒定對實(shí)施例5中純化得到的TR2-3蛋白利用分子排阻法在HPLC系統(tǒng)(LC-2010AHT，SHIMADZUCorp.，Japan)上進(jìn)行純度分析，所用色譜柱為ShodexPROTEINKW-802.5(SHOWADENKOK.K.，Japan)，流動相為0.2M磷酸緩沖液(pH7.6)，含0.1MNa2SO4，流速為0.7ml/min。結(jié)果顯示，純化后的TR2-3蛋白純度為>96％(圖7)。用BCA法進(jìn)行蛋白含量測定(biouniquer公司產(chǎn)品)，結(jié)果顯示，TR2-3產(chǎn)量達(dá)12mg/L，實(shí)現(xiàn)單鏈抗體TR2-3在大腸桿菌的高效可溶性表達(dá)與分離純化。峰#保留時間面積高度面積％高度％10.19213461320.0980.25729.29023221250.1690.244310.8974396213663.1942.661411.86813225614947096.09996.345515.07460612540.4400.494總計137625251347100.000100.000將純化得到的單鏈抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，4℃，100mA恒流轉(zhuǎn)印100min，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜(Millipore公司產(chǎn)品)；轉(zhuǎn)印結(jié)束，將膜置于5％MilkTBST(含有5％脫脂牛奶和0.1％吐溫20的TBS)中室溫封閉1h；用5％MilkTBST按1∶5000稀釋Anti-6×Hisrabbitpolyclonalantibody抗體(上海生工產(chǎn)品)，室溫孵育2h，TBST洗滌3遍，每次10min；用5％MilkTBST按1∶2500稀釋HRP-conjugatedGoatAnti-RabbitIgG二抗(上海生工產(chǎn)品)，室溫孵育1h，TBST洗滌3遍，每次10min；用ECL顯色。WesternBlot分析結(jié)果顯示，在25KD與35KD之間有一個特異性條帶(圖8)，與單鏈抗體TR2-3理論分子量27.5KD大小一致，證明純化得到的蛋白即為單鏈抗體TR2-3。實(shí)施例8.抗人死亡受體DR5單鏈抗體對結(jié)腸癌、乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制選用結(jié)腸癌細(xì)胞COL0205和乳腺癌細(xì)胞MDA-MA-231，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)至對數(shù)期，0.5％胰酶消化細(xì)胞后用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并以5.0×104cells/ml的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，200μl/孔，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后用2％血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。加入不同濃度的單鏈抗體，孵育48h，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，以不加單鏈抗體孵育的細(xì)胞作為陰性對照；每孔加入10μl的MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150μlDMSO，在酶標(biāo)儀570nm波長處測定光吸收值(OD值)。細(xì)胞增殖抑制率計算公式如下，細(xì)胞抑制率＝(1-(ODsample-ODblank)/(ODcontrol-ODblank))×100％。MTT分析結(jié)果顯示，單鏈抗體TR2-3對結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205和乳腺癌細(xì)胞MDA-MA-231均有著明顯的抑制作用并存在劑量依賴關(guān)系(圖9)，結(jié)果表明，單鏈抗體TR2-3具有明顯的抗腫瘤活性。實(shí)施例9.抗人死亡受體DR5單鏈抗體對結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205caspase通路活化的檢測結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205在37℃和5％CO2的條件下培養(yǎng)至對數(shù)期，0.5％胰酶消化細(xì)胞后用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并以5.0×105cells/孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，500ul/孔，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后用無血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。加入1uM濃度的單鏈抗體，分別孵育1、2、4h，以未加藥物處理的細(xì)胞作為陰性對照，標(biāo)記為0h；藥物處理后將細(xì)胞從6孔板消化下來，加入適量的RIPA裂解緩沖液冰上裂解30min，12000rpm離心10min，得到的上清液用于SDS-PAGE電泳，4℃，100mA恒流轉(zhuǎn)印2h，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜(Millipore公司產(chǎn)品)；轉(zhuǎn)印結(jié)束，將膜置于5％MilkTBST(含有5％脫脂牛奶的TBS)中室溫封閉1h；用5％MilkTBST按1∶500稀釋抗capase3、caspase8及β-actin抗體(上海生工產(chǎn)品)，室溫孵育2h，TBS洗滌3遍，每次10min；用5％MilkTBST按1∶2500稀釋HRP-conjugatedGoatAnti-RabbitIgG二抗(上海生工產(chǎn)品)，室溫孵育1h，TBS洗滌3遍，每次10min；ECL顯色。WesternBlot分析結(jié)果顯示，caspase3與caspase8均檢測到明顯的切割條帶，且隨著單鏈抗體TR2-3作用時間的延長，切割條帶越明顯。結(jié)果表明，單鏈抗體TR2-3可以活化caspase通路中關(guān)鍵蛋白caspase3和caspase8(圖10)，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。SEQUENCELISTING<110>中國藥科大學(xué)<120>一種全人源的抗人死亡受體5的激動劑單鏈抗體及應(yīng)用<130>1<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>122<212>PRT<213>Homosapiens<400>1GlnValGlnLeuGlnGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGlyThrLeuSerLeuThrCysAlaValSerGlyGlySerIleSerSerSerAsnTrpTrpSerTrpValArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIleGlyGluIleTyrHisSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuLysSerArgValThrIleSerValAspLysSerLysAsnGlnPheSerLeuLysLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgGlyAlaAlaAlaGlyThrAlaAsnAspAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThrMetValThrValSerSer<210>2<211>108<212>PRT<213>Homosapiens<400>2GluThrThrLeuThrGlnSerProGlyIleLeuSerLeuSerProGlyGluArgAlaSerLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValProHisAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIleTyrGlyAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAspArgPheSerGlySerGlySerGluThrAspPheThrLeuThrValThrArgLeuAlaProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnTyrGlyArgSerLeuThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysArg<210>3<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>3GlyGlySerIleSerSerSerAsnTrpTrpSer<210>4<211>16<212>PRT<213>Homosapiens<400>4GluIleTyrHisSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuLysSer<210>5<211>15<212>PRT<213>Homosapiens<400>5AlaArgGlyAlaAlaAlaGlyThrAlaAsnAspAlaPheAspIle<210>6<211>7<212>PRT<213>Homosapiens<400>6GlnSerValProHisAsnTyr<210>7<211>7<212>PRT<213>Homosapiens<400>7GlyAlaSerAsnArgAlaThr<210>8<211>8<212>PRT<213>Homosapiens<400>8GlnGlnTyrGlyArgSerLeuThr<210>9<211>15<212>PRT<213>Homosapiens<400>9GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer當(dāng)前第1頁1 2 3