本發(fā)明屬于食用菌
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種純白真姬菇菌株及其分子標(biāo)記、特異性引物對(duì)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：真姬菇(拉丁文名稱Hypsizygusmarmoreus)，隸屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、離褶菌族、玉蕈屬，因它具有獨(dú)特的蟹鮮味，故又稱它為蟹味菇。目前栽培的有淺灰色和純白色兩個(gè)品系，白色品系又稱“白玉蘑”、“玉龍菇”，深受市場(chǎng)歡迎，純白真姬菇多為工廠化栽培。最初的人工栽培于1978年前后開始于日本，其味道鮮美、食感脆嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富，其味比平菇鮮，其肉比滑菇厚,其質(zhì)比香菇韌，口感甚佳，其干品還香味濃溢。真姬菇含有豐富維生素和17種氨基酸，子實(shí)體中提取的β-1，3-D葡聚糖具有很高的抗腫瘤活性，是一種低熱量、低脂肪的保健食品，未來(lái)具有廣闊的市場(chǎng)前景。但是目前市場(chǎng)的真姬菇品種只有短柄品種，品種較為單一，存在無(wú)法滿足市場(chǎng)需求多樣性的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種純白真姬菇菌株，用以解決目前真姬菇品種的菌柄較短、品種單一的問(wèn)題。本發(fā)明提供的純白真姬菇菌株名稱為Finc-W-6，屬于真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.12523，保藏日期為2016年6月30日。培養(yǎng)所述純白真姬菇菌株Finc-W-6得到的孢子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述純白真姬菇菌株Finc-W-6作為親本在育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。進(jìn)一步的，所述育種方法選自單孢自交、單孢雜交、多孢自交或多孢雜交育種。培養(yǎng)所述純白真姬菇菌株Finc-W-6得到的菌絲體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。栽培所述純白真姬菇菌株Finc-W-6得到的子實(shí)體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，通過(guò)隨機(jī)引物獲得了純白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體的特異DNA片段，分子量為833bp，將該片段克隆測(cè)序，以此片段的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異PCR擴(kuò)增引物對(duì)H16-F和H16-R，序列如下：H16-F：5'-CACGAAATCTGGAGCAACGA-3'，H16-R：5'-GCCATGGACATGGAGTCCTT-3'。采用上述特異引物對(duì)對(duì)純白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增，獲得特異片段，分子量大小為736bp，提取特異性引物對(duì)之間片段，獲得分子量大小為696bp的特異片段，將其作為純白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體的分子標(biāo)記。特異引物對(duì)擴(kuò)增獲得的特異片段，序列如下：5'-CACGAAATCTGGAGCAACGACCCAGGAACGCTATGTATTGGCGGTTGGCGCAGAAGACTTCGCGCGCTTCCAGGCCATCTGCGAACGCGAGCGTTGCCCGTTTGCAGTAGTTGGCGAAGCCACTGCCGAGCCACAGCTGACGGTTACCGACAGCCACTTCGGCAACAGCCCGGTGGACATGCCGCTGGAAGTGCTGCTGGGCAAAGCCCCGCGCATGCACCGTTCGGCGGTACGTGAAGCCGAGTTGGGCGATGATTTCGACCCAAGCACGCTGGAACTGGCTGACAGCATCGAACGCGTGCTGCACCACCCGGCCGTGGCGAGCAAAAGTTTCCTGATCACCATCGGCGACCGCACCATCACTGGCCTGGTGGCCCGTGACCAAATGGTTGGCCCATGGCAGGTCCCGGTGGCTGACGTTGCCGTCACCGCCACCAGCTTCGACGTCTACACCGGTGAAGCCATGGCCATGGGCGAGCGTACGCCGCTGGCCCTGCTGGACGCTCCCGCGTCGGGCCGCATGGCCATTGGTGAAACCCTCACCAACATCGCCGCCTCGCGCATCGGTAAATTGTCCGACATCAAACTGTCGGCCAACTGGATGTCCGCTGCCGGCCACCCAGGTGAAGACGCCCGCCTGTACGACACCGTCAAGGCGGTCGGCATGGAGTTGTGCCCGGAGCTGGGCATCACCATTCCGGTGGGCAAGGACTCCAGCCATGGACATGGAGTCCTT-3'本發(fā)明提供了所述純白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體中的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的序列為：5'-CCCAGGAACGCTATGTATTGGCGGTTGGCGCAGAAGACTTCGCGCGCTTCCAGGCCATCTGCGAACGCGAGCGTTGCCCGTTTGCAGTAGTTGGCGAAGCCACTGCCGAGCCACAGCTGACGGTTACCGACAGCCACTTCGGCAACAGCCCGGTGGACATGCCGCTGGAAGTGCTGCTGGGCAAAGCCCCGCGCATGCACCGTTCGGCGGTACGTGAAGCCGAGTTGGGCGATGATTTCGACCCAAGCACGCTGGAACTGGCTGACAGCATCGAACGCGTGCTGCACCACCCGGCCGTGGCGAGCAAAAGTTTCCTGATCACCATCGGCGACCGCACCATCACTGGCCTGGTGGCCCGTGACCAAATGGTTGGCCCATGGCAGGTCCCGGTGGCTGACGTTGCCGTCACCGCCACCAGCTTCGACGTCTACACCGGTGAAGCCATGGCCATGGGCGAGCGTACGCCGCTGGCCCTGCTGGACGCTCCCGCGTCGGGCCGCATGGCCATTGGTGAAACCCTCACCAACATCGCCGCCTCGCGCATCGGTAAATTGTCCGACATCAAACTGTCGGCCAACTGGATGTCCGCTGCCGGCCACCCAGGTGAAGACGCCCGCCTGTACGACACCGTCAAGGCGGTCGGCATGGAGTTGTGCCCGGAGCTGGGCATCACCATTCCGGTGGGCAAGGACTCCA-3'。本發(fā)明提供了所述純白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體的特異性引物對(duì)H16-F和H16-R，對(duì)純白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體進(jìn)行擴(kuò)增，獲得所述Finc-W-6或其子實(shí)體的分子標(biāo)記，所述特異性引物對(duì)的序列如下：H16-F：5'-CACGAAATCTGGAGCAACGA-3'，H16-R：5'-GCCATGGACATGGAGTCCTT-3'。需要指出的是，上述特異性引物對(duì)不是唯一的可以獲得所述分子標(biāo)記片段的特異性引物對(duì)。本發(fā)明還提供了通過(guò)所述特異引物對(duì)對(duì)待測(cè)樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)而鑒定所述白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體的用途。本發(fā)明還提供了通過(guò)所述分子標(biāo)記鑒定所述白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體的用途。本發(fā)明還公開了一種純白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體的鑒定方法，其包括如下步驟：從待測(cè)樣品中提取DNA樣本，采用所述特異性引物對(duì)對(duì)DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的DNA片段與所述分子標(biāo)記進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定待測(cè)樣品是否為純白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體。需要指出的是，上述的鑒定方法只是鑒定純白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體的一種方式，本領(lǐng)域所知的其他方式也可用于純白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體的鑒定。本發(fā)明還提供了所述純白真姬菇菌株Finc-W-6的子實(shí)體的一種栽培方法，包括如下步驟：1)接種與發(fā)菌：將所述純白真姬菇菌株Finc-W-6的栽培種接入栽培種培養(yǎng)基，在溫度18～23℃，空氣相對(duì)濕度65-75％，二氧化碳濃度2000～4000ppm條件下培養(yǎng)70-85天；2)子實(shí)體原基形成:出菇溫度設(shè)定為13℃～15℃，空氣相對(duì)濕度93％～100％，二氧化碳濃度1000～2000ppm，前6天光照強(qiáng)度10～50Lux，之后光照強(qiáng)度200～300Lux，每天間隙式開啟層架燈刺激出菇，菇蓋接近成熟時(shí)采收。所述純白真姬菇菌株Finc-W-6的子實(shí)體在食品加工中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。比如將純白真姬菇菌株Finc-W-6的子實(shí)體做成菌菇干、菌菇粉、油炸菌菇、調(diào)味料等。本發(fā)明所述純白真姬菇菌株Finc-W-6的形態(tài)特征如下：菌絲：白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲致密，菌落邊緣圓整；菌蓋：直徑為1.6±0.3cm，顏色為純白色，斷面圓山型，通體雪白，肉厚、肉質(zhì)脆，斑紋清晰、中央分布，無(wú)龜裂；菌褶：波狀卷曲；孢子印顏色為白色；菌柄：長(zhǎng)度為10-14cm，中粗、雪白、無(wú)毛，與菌蓋中心生，肉質(zhì)脆。通過(guò)對(duì)其子實(shí)體、菌絲體及孢子形態(tài)特征的觀察，判斷該菌株的生物學(xué)分類命名。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的純白真姬菇菌株Finc-W-6具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)菌柄較現(xiàn)有純白真姬菇品種長(zhǎng)了至少50％，填補(bǔ)了純白真姬菇無(wú)長(zhǎng)柄品種的空白；(2)子實(shí)體培養(yǎng)和栽培周期短，單產(chǎn)高，大大提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本；(3)單株之間以及單株內(nèi)單根子實(shí)體之間的外觀均一度高，有利于機(jī)械化和自動(dòng)化作業(yè)；(4)保鮮期長(zhǎng)，有利于存儲(chǔ)；(5)目前純白真姬菇種植資源稀缺，本發(fā)明提供的菌株綜合特性優(yōu)良，可以作為重要親本從而培育出更多性能優(yōu)良的菌株，豐富真姬菇種類。綜上所述，本發(fā)明提供的技術(shù)方案，獲得的長(zhǎng)柄純白真姬菇，滿足了市場(chǎng)多樣性需求，并且栽培周期短,出菇時(shí)間較為集中，單產(chǎn)高，朵型優(yōu)美，保鮮期長(zhǎng)，非常適合于大面積推廣種植，市場(chǎng)前景廣闊。附圖說(shuō)明圖1是實(shí)施例2中純白真姬菇菌株H-W和Finc-W-6的拮抗試驗(yàn)正面圖，左側(cè)為H-W，右側(cè)為Finc-W-6；圖2是實(shí)施例2中純白真姬菇菌株H-W和Finc-W-6的拮抗試驗(yàn)背面圖，左側(cè)為H-W，右側(cè)為Finc-W-6；圖3是本發(fā)明所述純白真姬菇Finc-W-6和H-W栽培的子實(shí)體柄長(zhǎng)對(duì)比照片；圖4是實(shí)施例8中所述電泳圖譜。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的Finc-W-247、Finc-W-62、Finc-W-90和Finc-W-227菌株是上海豐科生物科技股份有限公司培育菌株,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，F(xiàn)inc-W-247菌株保藏號(hào)CCTCCNO:M2012378；Finc-W-62菌株保藏號(hào)CCTCCNO:M2012375；Finc-W-90菌株保藏號(hào)CCTCCNO:M2012376；Finc-W-227菌株保藏號(hào)CCTCCNO:M2012377。H-W菌株從市場(chǎng)上購(gòu)買的一種純白真姬菇菌株，它的原基為純白色，采收期菌柄為純白色，菌蓋為純白色，在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院菌種保藏中心也有保藏。下述實(shí)施例所用各種培養(yǎng)基的配方如下：母種培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：每1L培養(yǎng)基用馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g。原種培養(yǎng)基：按重量百分比計(jì)包括38-40％的原種培養(yǎng)料和60％～62％的水，所述原種培養(yǎng)料按重量百分比計(jì)包括木屑65％(重量百分比，下同)、米糠18％、麩皮7％、玉米粉10％。栽培種培養(yǎng)基：所述栽培種培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)，其中含水量64％～66％。包括34-36％的栽培種培養(yǎng)料和64～66％的水，所述栽培種培養(yǎng)料包括玉米芯21％、雜木屑15％、米糠20％、麩皮20％，玉米粉5％、棉籽殼19％。實(shí)施例1多孢自交獲得Finc-W-6采用多孢自交育種方法獲得純白真姬菇菌株Finc-W-6。具體步驟如下：1)市場(chǎng)購(gòu)得親本菌株H-W；2)配制母種培養(yǎng)基、原種培養(yǎng)基和栽培種培養(yǎng)基：各培養(yǎng)基配方已經(jīng)給出，在此不再贅述；3)擔(dān)孢子的分離：將親本菌株H-W置于培養(yǎng)皿中，24小時(shí)后，收集落在培養(yǎng)皿中的孢子，在無(wú)菌水中稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛?，并涂布在PDA培養(yǎng)基平板上。在23℃下培養(yǎng)10天，待孢子萌發(fā)后用接種環(huán)分別接種到PDA斜面試管上。將這些試管在23℃下培養(yǎng)12天，然后從試管中分離出菌絲，并在顯微鏡下觀察鎖狀聯(lián)合的形成。將沒(méi)有鎖狀聯(lián)合的菌株儲(chǔ)存在冰箱中備用；4)自交：將一個(gè)單核體和另一個(gè)單核體彼此相隔2.5cm接種到新鮮的馬鈴薯瓊脂板中，然后在恒溫培養(yǎng)箱中23℃下培養(yǎng)10天。分離菌絲并通過(guò)顯微鏡觀察以確定鎖狀聯(lián)合的形成，選擇具有鎖狀聯(lián)合的菌株，通過(guò)此方法獲得500個(gè)菌株；5)把獲得的菌株根據(jù)常規(guī)的方法進(jìn)行栽培試驗(yàn)和篩選；6)獲得目標(biāo)菌株：通過(guò)系統(tǒng)篩選，從500個(gè)菌株中，獲得一個(gè)純白真姬菇菌株，菌柄長(zhǎng)，培養(yǎng)及栽培周期短，單產(chǎn)高，朵型優(yōu)美，瘤蓋菇出現(xiàn)率低，可食率高，保鮮期長(zhǎng)，菌株活性穩(wěn)定，該菌株被命名為Finc-W-6。實(shí)施例2拮抗實(shí)驗(yàn)本發(fā)明Finc-W-6和親本菌株H-W為試驗(yàn)材料，所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。Finc-W-6和親本菌株H-W在平板培養(yǎng)基上分別對(duì)峙接種和培養(yǎng)，接種點(diǎn)相距2.5cm，23℃恒溫培養(yǎng)18-20天，本試驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參閱表1。表1不同純白真姬菇菌株間拮抗試驗(yàn)品種H-WFinc-W-6拮抗如圖1-2所示，在對(duì)峙培養(yǎng)菌落交界處之間有明顯拮抗線，說(shuō)明Finc-W-6是與親本菌株H-W不同的純白真姬菇菌株。實(shí)施例3栽培實(shí)驗(yàn)本發(fā)明Finc-W-6與親本菌株H-W分別進(jìn)行培養(yǎng)和栽培，從70天到85天設(shè)置4個(gè)菌齡，每增加5天為一個(gè)菌齡，每個(gè)菌齡96瓶，然后對(duì)小批量栽培的結(jié)果進(jìn)行匯總比較，總結(jié)出本發(fā)明菌株Finc-W-6的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)。本實(shí)施例培養(yǎng)基參加栽培種培養(yǎng)基，不再贅述。栽培瓶容積：850cc，瓶口直徑58mm。培養(yǎng)：溫度18～23℃，空氣相對(duì)濕度65-75％，二氧化碳濃度2000～3500ppm條件下培養(yǎng)70-85天；栽培：出菇溫度設(shè)定為13℃～15℃，空氣相對(duì)濕度93％～100％，二氧化碳濃度1000～2000ppm，前6天，光照強(qiáng)度10～50Lux，之后光照強(qiáng)度200～300Lux，每天間隙式開啟層架燈刺激出菇，菇蓋接近成熟時(shí)采收。表2為Finc-W-6與親本菌株H-W栽培試驗(yàn)結(jié)果，具體包括培養(yǎng)周期，栽培周期，單產(chǎn)。表2純白真姬菇菌株栽培試驗(yàn)結(jié)果H-W最佳菌齡為85天，相應(yīng)栽培周期為24天，平均單產(chǎn)為155克/瓶；Finc-W-6最佳菌齡為80天，相應(yīng)栽培周期為23天，平均單產(chǎn)為175克/瓶；Finc-W-6在周期和單產(chǎn)方面均表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例4菌絲生長(zhǎng)的溫度梯度試驗(yàn)本實(shí)施例以培養(yǎng)溫度為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計(jì)4組實(shí)驗(yàn)，從接種了Finc-W-6和H-W馬鈴薯瓊脂板板上分別切取直徑為5.0mm的接種塊接種到PDA培養(yǎng)基上，分別于18℃、23℃、28℃和33℃培養(yǎng)15天，試驗(yàn)結(jié)果見表3。表3溫度對(duì)不同純白真姬菇菌絲生長(zhǎng)速率的影響結(jié)果表明：Finc-W-6菌絲生長(zhǎng)速度較H-W快；Finc-W-6的菌絲在23℃生長(zhǎng)速度最快，達(dá)到3.74mm/d；當(dāng)溫度降低至18℃時(shí)，則生長(zhǎng)速度逐漸下降為3.42mm/d，當(dāng)升高到28℃，菌絲生長(zhǎng)速度大幅下降為1.5mm/d，當(dāng)33℃時(shí)，2個(gè)菌株均不能生長(zhǎng)，由此可見，純白真姬菇菌株Finc-W-6菌株的適宜培養(yǎng)溫度為18-23℃。實(shí)施例5形態(tài)特征和生物學(xué)特性形態(tài)特征：Finc-W-6及其親本H-W具體形態(tài)特征的差異請(qǐng)參閱表4。表4不同菌株形態(tài)特征對(duì)比如圖3所示，F(xiàn)inc-W-6的形態(tài)特征：菌絲：白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲密度中等，菌落邊緣圓整；菌蓋：直徑為1.6±0.3cm，顏色雪白，斷面呈圓山型，斑紋清晰，主要分布在菌蓋中央，菌蓋邊緣圓整，表面無(wú)龜裂，質(zhì)地脆嫩；菌褶：白色、排列方式呈波狀卷曲；孢子印顏色為白色；菌柄：長(zhǎng)度為10～14cm，白色，實(shí)心，與菌蓋連接方式為中生，菌柄相互離生。如圖3所示，H-W的形態(tài)特征：菌絲：白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲致密，菌落邊緣圓整；菌蓋：直徑為2±0.5cm，顏色雪白，斷面呈圓山型，斑紋清晰，主要分布在菌蓋中央，菌蓋邊緣圓整，表面無(wú)龜裂，質(zhì)地脆嫩；菌褶：白色、排列方式呈波狀卷曲；孢子印顏色為白色；菌柄：長(zhǎng)度為6～8cm，白色，實(shí)心，與菌蓋連接方式為中生，菌柄相互離生。如圖3所示，從外形上看，F(xiàn)inc-W-6的菌柄長(zhǎng)度較H-W有了明顯的區(qū)別，其他幾個(gè)菌株的柄長(zhǎng)與H-W近似，因此，F(xiàn)inc-W-6填補(bǔ)了市場(chǎng)供應(yīng)純白真姬菇長(zhǎng)柄品種的空白。Finc-W-247的形態(tài)特征：菌絲：白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲密度中等，菌落邊緣圓整；菌蓋：直徑為1.8±0.44cm，顏色雪白，斷面呈圓山型，斑紋清晰，主要分布在菌蓋中央，菌蓋邊緣圓整，表面無(wú)龜裂，質(zhì)地脆嫩；菌褶：白色、筆直排列；孢子印顏色為白色；菌柄：長(zhǎng)度為7～8cm，白色，實(shí)心，與菌蓋連接方式為略偏心生，菌柄相互離生。Finc-W-62的形態(tài)特征：菌絲：白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲密度中等，菌落邊緣圓整；菌蓋：直徑為1.6±0.3cm，顏色雪白，斷面呈圓山型，斑紋清晰，主要分布在菌蓋中央，菌蓋邊緣圓整，表面無(wú)龜裂，質(zhì)地脆嫩；菌褶：白色、排列方式呈波狀卷曲；孢子印顏色為白色；菌柄：長(zhǎng)度為6～9cm，白色，實(shí)心，與菌蓋連接方式為略偏心生，菌柄相互離生。Finc-W-90的形態(tài)特征：菌絲：白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲密度中等，菌落邊緣圓整；菌蓋：直徑為1.5±0.3cm，顏色雪白，斷面呈圓山型，斑紋清晰，主要分布在菌蓋中央，菌蓋邊緣圓整，表面無(wú)龜裂，質(zhì)地脆嫩；菌褶：白色、排列方式呈波狀卷曲；孢子印顏色為白色；菌柄：長(zhǎng)度為6.6～7.5cm，白色，實(shí)心，與菌蓋連接方式為略偏心生，菌柄相互離生。Finc-W-227的形態(tài)特征：菌絲：白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲密度中等，菌落邊緣不圓整；菌蓋：直徑為1.3±0.5cm，顏色雪白，斷面呈圓山型，斑紋清晰，主要分布在菌蓋中央，菌蓋邊緣圓整，表面無(wú)龜裂，質(zhì)地脆嫩；菌褶：白色、排列方式呈波狀卷曲；孢子印顏色為白色；菌柄：長(zhǎng)度為6～8cm，白色，實(shí)心，與菌蓋連接方式為略偏心生，菌柄相互離生。Finc-W-6生物學(xué)特征：Finc-W-6菌絲體培養(yǎng)溫度23℃～28℃，濕度75％，CO2濃度2000ppm～3500ppm，培養(yǎng)周期70d～85d。適宜出菇溫度為13℃～15℃，濕度93％～100％，CO2濃度1000～2000ppm，前6天，光照強(qiáng)度10Lux～50Lux，之后光照強(qiáng)度200Lux～300Lux，每天間隙式開啟層架燈刺激出菇，栽培周期約22-24d。菌絲體的致死溫度為45℃30min，擔(dān)孢子的致死溫度為50℃15min。實(shí)施例6保鮮試驗(yàn)本實(shí)施例開展真姬菇菌株H-W和Finc-W-6保鮮試驗(yàn)。H-W和Finc-W-6采收后隨即抽取20包，置于冷庫(kù)(3℃～8℃)保藏至60天，有一株子實(shí)體開始霉腐，即為開始變質(zhì)。不同品種在(3℃～8℃)的保質(zhì)期請(qǐng)參閱表5。表5保質(zhì)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總對(duì)比項(xiàng)目H-WFinc-W-6保質(zhì)期(天)2430由表5可知，F(xiàn)inc-W開始變質(zhì)時(shí)間為24天，F(xiàn)inc-W-6保質(zhì)期為30天。實(shí)施例7分子標(biāo)記及特異引物的設(shè)計(jì)純白色真姬菇Finc-W-6的分子標(biāo)記的獲得方法，包括如下步驟：1)菌株培養(yǎng)和氣生菌絲獲得把低溫保藏的Finc-W-6和H-W、Finc-W-247、Finc-W-262、Finc-W-90、Finc-W-227菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，在溫度22℃、濕度75％的條件下培養(yǎng)20天，刮取氣生菌絲，-20℃凍存。2)基因組DNA提取在本實(shí)施例中，按照生工生物工程(上海)股份有限公司(以下簡(jiǎn)稱“生工”)進(jìn)行SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書提取菌株基因組，將所得到的DNA溶液置于-20℃冷藏，備用。3)RAPD法分析選用21條隨機(jī)引物，見表6，進(jìn)行RAPD分析。表6隨機(jī)引物經(jīng)過(guò)篩選，隨機(jī)引物S38能擴(kuò)增得到Finc-W-6菌株所特有的DNA條帶，切取Finc-W-6特有的DNA條帶，回收DNA。回收方法按照生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說(shuō)明。回收的DNA采用常規(guī)測(cè)序方法，其為833bp的DNA片段，序列如下：5'-AGGTGACCGTGGTGGCCGTTTCGAACTGCGCAATATTCCTAACGACGAGCCGGGCATGGCCCCGCACGAAATCTGGAGCAACGAATCCCAGGAACGCTATGTATTGGCGGTTGGCGCAGAAGACTTCGCGCGCTTCCAGGCCATCTGCGAACGCGAGCGTTGCCCGTTTGCAGTAGTTGGCGAAGCCACTGCCGAGCCACAGCTGACGGTTACCGACAGCCACTTCGGCAACAGCCCGGTGGACATGCCGCTGGAAGTGCTGCTGGGCAAAGCCCCGCGCATGCACCGTTCGGCGGTACGTGAAGCCGAGTTGGGCGATGATTTCGACCCAAGCACGCTGGAACTGGCTGACAGCATCGAACGCGTGCTGCACCACCCGGCCGTGGCGAGCAAAAGTTTCCTGATCACCATCGGCGACCGCACCATCACTGGCCTGGTGGCCCGTGACCAAATGGTTGGCCCATGGCAGGTCCCGGTGGCTGACGTTGCCGTCACCGCCACCAGCTTCGACGTCTACACCGGTGAAGCCATGGCCATGGGCGAGCGTACGCCGCTGGCCCTGCTGGACGCTCCCGCGTCGGGCCGCATGGCCATTGGTGAAACCCTCACCAACATCGCCGCCTCGCGCATCGGTAAATTGTCCGACATCAAACTGTCGGCCAACTGGATGTCCGCTGCCGGCCACCCAGGTGAAGACGCCCGCCTGTACGACACCGTCAAGGCGGTCGGCATGGAGTTGTGCCCGGAGCTGGGCATCACCATTCCGGTGGGCAAGGACTCCATGTCCATGGCCACCCGTTGGAACGAAGACGGCGTCGACAAGACGGTCACCT-3'。4)特異引物的獲得根據(jù)上述DNA片段，設(shè)計(jì)特異引物序列對(duì)H16-F和H16-R，序列分別為：H16-F：5'-GAGTTTCCCCACCCCTTTTC-3'和H16-R：5'-GCATTTTGCAATGGCGATG-3'。在本實(shí)施例中采用Primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)上述特異引物序列。5)分子標(biāo)記的確定采用設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)，對(duì)Finc-W-6進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的DNA片段分子量為696bp，將其作為Finc-W-6或其子實(shí)體的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的序列為：5'-CCCAGGAACGCTATGTATTGGCGGTTGGCGCAGAAGACTTCGCGCGCTTCCAGGCCATCTGCGAACGCGAGCGTTGCCCGTTTGCAGTAGTTGGCGAAGCCACTGCCGAGCCACAGCTGACGGTTACCGACAGCCACTTCGGCAACAGCCCGGTGGACATGCCGCTGGAAGTGCTGCTGGGCAAAGCCCCGCGCATGCACCGTTCGGCGGTACGTGAAGCCGAGTTGGGCGATGATTTCGACCCAAGCACGCTGGAACTGGCTGACAGCATCGAACGCGTGCTGCACCACCCGGCCGTGGCGAGCAAAAGTTTCCTGATCACCATCGGCGACCGCACCATCACTGGCCTGGTGGCCCGTGACCAAATGGTTGGCCCATGGCAGGTCCCGGTGGCTGACGTTGCCGTCACCGCCACCAGCTTCGACGTCTACACCGGTGAAGCCATGGCCATGGGCGAGCGTACGCCGCTGGCCCTGCTGGACGCTCCCGCGTCGGGCCGCATGGCCATTGGTGAAACCCTCACCAACATCGCCGCCTCGCGCATCGGTAAATTGTCCGACATCAAACTGTCGGCCAACTGGATGTCCGCTGCCGGCCACCCAGGTGAAGACGCCCGCCTGTACGACACCGTCAAGGCGGTCGGCATGGAGTTGTGCCCGGAGCTGGGCATCACCATTCCGGTGGGCAAGGACTCCA-3'。實(shí)施例8Finc-W-6鑒定采用實(shí)施例7設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)，對(duì)Finc-W-6和H-W、Finc-W-247、Finc-W-262、Finc-W-90、Finc-W-227進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系見表7，PCR循環(huán)條件見表8。表7PCR反應(yīng)體系試劑體積(μl)Template(基因組DNA20-50ng/μl)0.510×Buffer(withMg2+)2.5dNTP(各2.5mM)1酶0.2F(10uM)0.5R(10uM)0.5加雙蒸H2O至25表8PCR循環(huán)條件取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6μL，與1μL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5％的瓊脂糖凝膠上，于0.5×TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用EB染色，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像儀上照相，其結(jié)果請(qǐng)參閱圖4電泳圖譜。從圖4可知，只有本發(fā)明純白色真姬菇新菌株Finc-W-6菌株有專一擴(kuò)增條帶，說(shuō)明只有Finc-W-6擴(kuò)增出了特異DNA片段，可以通過(guò)電泳圖譜清晰的判斷是否為Finc-W-6，進(jìn)一步可對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行測(cè)序，與實(shí)施例7中所述分子標(biāo)記進(jìn)行比對(duì)，確定是否為Finc-W-6。本實(shí)施例建立的純白真姬菇Finc-W-6菌株的SCAR分子標(biāo)記，能夠?qū)inc-W-6菌種進(jìn)行快速鑒定。其包括如下步驟：從待測(cè)樣品中提取DNA樣本，采用實(shí)施例7所述特異性引物對(duì)對(duì)DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳法或基因測(cè)序法與所述分子標(biāo)記進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定待測(cè)樣品是否為純白真姬菇菌株Finc-W-6或其子實(shí)體。以上描述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，諒能理解，在不偏離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，對(duì)本發(fā)明的簡(jiǎn)單修改和替換皆應(yīng)包含在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思之內(nèi)。發(fā)明名稱：純白真姬菇菌株及其分子標(biāo)記、特異性引物對(duì)和應(yīng)用申請(qǐng)人：上海豐科生物科技股份有限公司青島豐科生物科技有限公司河北豐科生物科技有限公司分子標(biāo)記（696bp）：CCCAGGAACGCTATGTATTGGCGGTTGGCGCAGAAGACTTCGCGCGCTTCCAGGCCATCTGCGAACGCGAGCGTTGCCCGTTTGCAGTAGTTGGCGAAGCCACTGCCGAGCCACAGCTGACGGTTACCGACAGCCACTTCGGCAACAGCCCGGTGGACATGCCGCTGGAAGTGCTGCTGGGCAAAGCCCCGCGCATGCACCGTTCGGCGGTACGTGAAGCCGAGTTGGGCGATGATTTCGACCCAAGCACGCTGGAACTGGCTGACAGCATCGAACGCGTGCTGCACCACCCGGCCGTGGCGAGCAAAAGTTTCCTGATCACCATCGGCGACCGCACCATCACTGGCCTGGTGGCCCGTGACCAAATGGTTGGCCCATGGCAGGTCCCGGTGGCTGACGTTGCCGTCACCGCCACCAGCTTCGACGTCTACACCGGTGAAGCCATGGCCATGGGCGAGCGTACGCCGCTGGCCCTGCTGGACGCTCCCGCGTCGGGCCGCATGGCCATTGGTGAAACCCTCACCAACATCGCCGCCTCGCGCATCGGTAAATTGTCCGACATCAAACTGTCGGCCAACTGGATGTCCGCTGCCGGCCACCCAGGTGAAGACGCCCGCCTGTACGACACCGTCAAGGCGGTCGGCATGGAGTTGTGCCCGGAGCTGGGCATCACCATTCCGGTGGGCAAGGACTCCAH16-F（20bp）：CACGAAATCTGGAGCAACGAH16-R（20bp）：GCCATGGACATGGAGTCCTT實(shí)施例7隨機(jī)引物提取的DNA片段（833bp）：AGGTGACCGTGGTGGCCGTTTCGAACTGCGCAATATTCCTAACGACGAGCCGGGCATGGCCCCGCACGAAATCTGGAGCAACGAATCCCAGGAACGCTATGTATTGGCGGTTGGCGCAGAAGACTTCGCGCGCTTCCAGGCCATCTGCGAACGCGAGCGTTGCCCGTTTGCAGTAGTTGGCGAAGCCACTGCCGAGCCACAGCTGACGGTTACCGACAGCCACTTCGGCAACAGCCCGGTGGACATGCCGCTGGAAGTGCTGCTGGGCAAAGCCCCGCGCATGCACCGTTCGGCGGTACGTGAAGCCGAGTTGGGCGATGATTTCGACCCAAGCACGCTGGAACTGGCTGACAGCATCGAACGCGTGCTGCACCACCCGGCCGTGGCGAGCAAAAGTTTCCTGATCACCATCGGCGACCGCACCATCACTGGCCTGGTGGCCCGTGACCAAATGGTTGGCCCATGGCAGGTCCCGGTGGCTGACGTTGCCGTCACCGCCACCAGCTTCGACGTCTACACCGGTGAAGCCATGGCCATGGGCGAGCGTACGCCGCTGGCCCTGCTGGACGCTCCCGCGTCGGGCCGCATGGCCATTGGTGAAACCCTCACCAACATCGCCGCCTCGCGCATCGGTAAATTGTCCGACATCAAACTGTCGGCCAACTGGATGTCCGCTGCCGGCCACCCAGGTGAAGACGCCCGCCTGTACGACACCGTCAAGGCGGTCGGCATGGAGTTGTGCCCGGAGCTGGGCATCACCATTCCGGTGGGCAAGGACTCCATGTCCATGGCCACCCGTTGGAACGAAGACGGCGTCGACAAGACGGTCACCT當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3