本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種低pH條件下抑菌復(fù)合微生物制劑。

背景技術(shù)：

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、隱窩炎和羅恩氏病是炎性腸病(IBD)的主要類型，所述炎性腸病的特征在于腸中的慢性炎癥。臨床癥狀是腹瀉、腹痛、偶然性直腸出血、體重減輕、疲倦和有時(shí)發(fā)熱。盡管會(huì)發(fā)生在任何年齡，IBD最常見于青少年和年輕的成年人中，所以這些人可能遭受延遲的發(fā)育和矮化的生長(zhǎng)。資料顯示，每年美國(guó)UC患病率為200/10萬(wàn)人，治療UC的花費(fèi)在1至1.5億美元左右，截止到2012年，UC患者總數(shù)是2000年的2.5倍，且復(fù)發(fā)率達(dá)72％；近年來(lái)我國(guó)UC的患病人數(shù)呈明顯上升趨勢(shì)。

在醫(yī)學(xué)上，通過(guò)減少炎癥并從而控制胃腸道征狀來(lái)治療IBD。但是，目前尚不能在醫(yī)學(xué)上治愈IBD。IBD的臨床進(jìn)程有很大差異，具有輕度至中度征狀的患者無(wú)需住院治療，但是，10-15％的患者會(huì)發(fā)生該疾病的嚴(yán)重進(jìn)程，其在許多情況下繼之以外科手術(shù)，結(jié)腸切除術(shù)可以消除UC，但是會(huì)降低生活質(zhì)量和增加并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。

用于治療IBS的藥物已經(jīng)獲得普及，盡管它們?cè)谂R床試驗(yàn)中的效力是不大的，并且它們的臨床實(shí)用性受到不利副作用的限制，可利用的藥物包括：使用5-對(duì)氨水楊酸(5-ASA)、皮質(zhì)類固醇和免疫調(diào)節(jié)藥物。通常使用5-ASA進(jìn)行輕度至中度IBD征狀的長(zhǎng)期治療，而皮質(zhì)類固醇和免疫調(diào)節(jié)藥物被用于治療嚴(yán)重的征狀；腹瀉或腹痛作為5-ASA的副作用而出現(xiàn)，而皮質(zhì)類固醇的長(zhǎng)期使用經(jīng)常顯示出嚴(yán)重的副作用，包括骨質(zhì)減輕、感染、糖尿病、肌肉消瘦和精神病學(xué)障礙；免疫調(diào)節(jié)藥物會(huì)抑制免疫系統(tǒng)，這會(huì)控制IBD征狀。但是，產(chǎn)生的免疫受損的狀態(tài)會(huì)使患者易感許多疾病。血清素能性藥劑已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)IBS的總體征狀的效力，但是，最近關(guān)于安全性的憂慮已經(jīng)嚴(yán)重地限制了它們的應(yīng)用。

益生菌被定義為“活的微生物，其在以特定數(shù)目攝入以后，會(huì)發(fā)揮超出固有的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)以外的健康益處”(Araya M.等人,2002；Guarner F.等人,1998)。來(lái)自雙歧桿菌屬的幾種乳酸細(xì)菌和種是益生菌，這暗示，已經(jīng)證實(shí)它們會(huì)促進(jìn)特定健康效應(yīng)。益生細(xì)菌必須滿足與沒(méi)有毒性、生存力、附著和有益效果有關(guān)的幾個(gè)要求。然而，現(xiàn)有益生菌對(duì)治療腸炎效果不佳。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的第一目的在于提供一種低pH條件下抑菌復(fù)合微生物制劑。

本發(fā)明的第二目的在于提供上述復(fù)合微生物制劑在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三目的在于提供上述復(fù)合微生物制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四目的在于提供上述復(fù)合微生物制劑在制備治療腸炎藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種低pH條件下抑菌復(fù)合微生物制劑，包括羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08；所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，，保藏單位地址：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)，郵政編碼為430072，保藏編號(hào)為：CCTCC No.M 2016546，保藏日期為2016年10月10日；所述鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，，保藏單位地址：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)，郵政編碼為430072，保藏編號(hào)為：CCTCC NO.M 2016548，保藏日期為2016年10月10日。

優(yōu)選地，所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的質(zhì)量比為(1-1.5)：1，優(yōu)選1.2:1。

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02的生理活性特征如下：

所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02在MRS培養(yǎng)基平板上菌落較小，乳白色，直徑1-2mm，表面平滑，邊緣較規(guī)則。

所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02菌體為桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，不形成芽孢，產(chǎn)生乳酸，兼性厭氧。

羅伊氏乳桿菌的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。將所測(cè)16SrDNA序列通過(guò)BLAST比對(duì)，鑒定其為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)。

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的生理活性特征如下：

所述鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08在MRS培養(yǎng)基平板上菌落較小，乳白色，直徑1-2mm，表面平滑，邊緣較規(guī)則。

所述鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08菌體為桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，不形成芽孢，產(chǎn)生乳酸，兼性厭氧。

鼠李糖乳桿菌的16SrDNA序列如SEQ ID No.2所示。將所測(cè)16SrDNA序列通過(guò)BLAST比對(duì)，鑒定其為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。

所述的復(fù)合微生物制劑是在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

所述的復(fù)合微生物制劑是在制備治療胃腸道疾病藥物中的應(yīng)用。

所述的復(fù)合微生物制劑是在制備治療腸炎藥物中的應(yīng)用。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

(1)本發(fā)明提供的復(fù)合微生物制劑對(duì)多種病原菌具有抑制作用；對(duì)病原菌的作用方式多樣化；繁殖速度快；能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產(chǎn)應(yīng)用；抗逆能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

(2)本發(fā)明提供的復(fù)合微生物制劑培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、發(fā)酵時(shí)間短、容易保存，適于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02的菌落圖。

圖2為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02的菌落放大圖。

圖3為菌種第一批次功能性評(píng)價(jià)生長(zhǎng)曲線。

圖4為菌種第二批次功能性評(píng)價(jià)生長(zhǎng)曲線。

圖5為菌株耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖6為乳酸菌數(shù)量與腸炎小鼠的體重關(guān)系曲線。

圖7為乳酸菌數(shù)量與腸炎小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度關(guān)系曲線。

圖8為治療前后腸炎小鼠切片圖。

圖9為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的菌落圖。

圖10為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的菌落放大圖。

圖11為菌種第一批次功能性評(píng)價(jià)生長(zhǎng)曲線。

圖12為菌種第二批次功能性評(píng)價(jià)生長(zhǎng)曲線。

圖13為菌株耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖14為鼠李糖乳桿菌數(shù)量與腸炎小鼠的體重關(guān)系曲線。

圖15為鼠李糖乳桿菌數(shù)量與腸炎小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度關(guān)系曲線。

圖16為治療前后腸炎小鼠切片圖。

圖17為鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02混合培養(yǎng)液抑菌效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)例詳細(xì)闡述本發(fā)明的應(yīng)用。

實(shí)施例1

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02的分離

1、菌種和培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

(1)菌源

來(lái)自中國(guó)某軍區(qū)健康士兵糞便。

(2)培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基：1000mL蒸餾水，蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉9g，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三銨2g，半胱氨酸0.5g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，吐溫1ml，瓊脂粉15-20g，pH5.5-6.5。

2、菌株的分離和鑒定

(1)菌株的分離

預(yù)先經(jīng)滅菌處理后的手套箱中取適量新鮮糞便置于盛裝有無(wú)菌培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，充分震蕩渦旋混勻；

以上述充分震蕩渦旋混勻的糞便溶液為原液，做十倍梯度稀釋至合適梯度，取100μl均勻涂布于MRS+0.05％半胱氨酸固體平板培養(yǎng)基上，隨后取出置于厭氧罐中，37℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜。

次日可見平板上長(zhǎng)有形態(tài)大小各異的菌落，結(jié)合羅伊氏乳桿菌典型菌落形態(tài)特征，挑取若干有代表性的菌落作二代劃線純化處理，平板厭氧活化1天，得培養(yǎng)物，隨后做菌株鑒定。

(2)菌株的鑒定

革蘭氏染色形態(tài)學(xué)鑒定：

a、涂片：取滅過(guò)菌的載玻片于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在玻片上用記號(hào)筆做記號(hào)，便于觀察，隨后將玻片倒置，然后用移液器吸取10μl無(wú)菌生理鹽水均勻涂布在記號(hào)處，繼而用移液槍挑取純培養(yǎng)物均勻溶于生理鹽水中，涂布面不宜過(guò)大。

b、干燥：將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以防標(biāo)本烤枯而變形。

c、固定：固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰處盡快的來(lái)回通過(guò)2-3次，共約2-3秒種，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺(jué)過(guò)燙為宜(不超過(guò)60℃)，放置待冷后，進(jìn)行染色。

d、初染：在涂片薄膜上滴加草酸銨結(jié)晶紫1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。

e、水洗：斜置載玻片，在自來(lái)水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無(wú)色為止。

f、媒染：用100-1000ul移液槍吸取約300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。

g、水洗：斜置載玻片，在自來(lái)水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無(wú)色為止。

h、脫色：斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時(shí)20-30S，隨即水洗。

i、復(fù)染：在涂片薄膜上滴加沙黃染液1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。

j、水洗：斜置載玻片，在自來(lái)水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無(wú)色為止。

k、干燥、觀察：用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)及顏色，紫色的是革蘭氏陽(yáng)性菌，紅色的是革蘭氏陰性菌。

結(jié)果顯示：該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌。

16S rRNA序列的測(cè)定：

16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增使用的引物是一般細(xì)菌的引物——8F(5′-CACGGATCCAGAGTTTGAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG-3′)和1510R(5′-GTGAAGCTTAGGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′)產(chǎn)物委托有資質(zhì)的第三方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行sanger測(cè)序。應(yīng)用BLAST算法在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中把序列和16S rRNA基因進(jìn)行比較，應(yīng)用MEGA 4.0程序建立鄰接樹。

BLAST分析表明TR02菌十分接近羅伊氏乳桿菌(99％親緣性)。

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02的評(píng)價(jià)

(一)菌種功能性評(píng)價(jià)

A.生長(zhǎng)曲線及各監(jiān)測(cè)點(diǎn)pH值的測(cè)定

1.標(biāo)記

取11支無(wú)菌大試管，用記號(hào)筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，即0、2、4、6、8、24h。

2.接種

分別用5mL無(wú)菌吸管吸取2.5mL TR02過(guò)夜培養(yǎng)液(培養(yǎng)8-16h)轉(zhuǎn)入盛有50mLMRS+0.05％半胱氨酸培養(yǎng)液的三角瓶?jī)?nèi)，混合均勻后分別取5mL混合液放入上述標(biāo)記的11支無(wú)菌大試管中。

3.培養(yǎng)

將已接種的試管置37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、2、4、6、8、24h，將標(biāo)有相應(yīng)時(shí)間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測(cè)定其光密度值。

4.比濁測(cè)定

用未接種的MRS+0.05％半胱氨酸培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行光電比濁測(cè)定，從早取出的培養(yǎng)液開始依次測(cè)定，對(duì)細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用MRS+0.05％半胱氨酸液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其光密度值再0.1～0.65之內(nèi)(測(cè)定OD值前，將待測(cè)定的培養(yǎng)液振蕩，使細(xì)胞均勻分布)。

5.pH值的測(cè)定

剩余培養(yǎng)液測(cè)定pH值。

B.顯微鏡直接計(jì)數(shù)

1.菌懸液制備

以無(wú)菌生理鹽水將培養(yǎng)液制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?/p>

2.鏡檢技術(shù)室

在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的技術(shù)室進(jìn)行鏡檢，若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3.加樣品

將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的毛細(xì)滴管將搖勻的培養(yǎng)液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入技術(shù)室，一般技術(shù)室均能充滿菌液。

取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)技術(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。

4.顯微鏡計(jì)數(shù)

加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到技術(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。

調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對(duì)于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚技術(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。

在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)，一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5～10個(gè)菌體為宜。每個(gè)技術(shù)室選5個(gè)中格(可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)技術(shù)室中計(jì)得的平均值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。

5.清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板

使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭上用水沖洗干凈，切勿用硬物刷洗，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。

兩批次菌種功能性評(píng)價(jià)結(jié)果平行性較好(見表1、表2、圖3和圖4)，生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明TR02菌在0～4h內(nèi)處于適應(yīng)期，4～8h內(nèi)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8～12h處于平臺(tái)期，12h后即進(jìn)入衰退期；pH曲線與生長(zhǎng)曲線呈既截然相反的態(tài)勢(shì)，培養(yǎng)終點(diǎn)pH為4.44。

終點(diǎn)培養(yǎng)液經(jīng)顯微計(jì)數(shù)結(jié)果為3.54×10⁸cfu/ml。

表1批次一菌種功能性評(píng)價(jià)

表2批次二菌種功能性評(píng)價(jià)

(二)菌株耐酸實(shí)驗(yàn)

將供試菌株接種于MRS+0.05％半胱氨酸鹽酸鹽液體培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)24h，以5％的接種量加入到兩份用鹽酸調(diào)pH為2.5和6.2的MRS培養(yǎng)基中(pH為6.2的培養(yǎng)基為空白對(duì)照)。第一份用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取稀釋液100μL接種到MRS平板涂板，置于37℃，培養(yǎng)48h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。第二份37℃處理3h后，再用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取稀釋液100μL接種到MRS平板涂板，置于37℃培養(yǎng)48h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，即3h的活菌數(shù)，并計(jì)算出乳酸菌的存活率：存活率(％)＝(3h的活菌數(shù)/0h的活菌數(shù))×100。

由表3和圖5可見，TR02在pH6.5及pH4.5環(huán)境下培養(yǎng)3h未見顯著影響，而在pH3.0條件下生長(zhǎng)受到影響，表明pH4.5環(huán)境下TR02可以耐受。

表3菌株耐酸試驗(yàn)結(jié)果

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.結(jié)腸炎的誘導(dǎo)與治療

用含2.5％DSS(分子量36-50KDa)的溶液飼喂C57BL/6型小鼠(1-7天)，以誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型小鼠；對(duì)照組則飼喂水。在隨后的10天內(nèi)，分別口服水、乳酸菌(包埋0.9*10⁹、1.2*10⁹、2.4*10⁹，未包埋2.4*10⁹)和柳氮黃胺吡啶(0.5g/kg)。

每天稱量體重，觀察小鼠糞便粘稠度及糞便中和肛門處是否有血。計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)以下參數(shù)進(jìn)行計(jì)算：

a)腹瀉(0分＝正常，2分＝輕便糞便，4分＝水性腹瀉)；

b)血膽量(0分＝?jīng)]有出血，2，輕微出血，4分，大出血)。

在誘導(dǎo)結(jié)腸炎后第10天，處死動(dòng)物，取出結(jié)腸，并制備結(jié)腸組織片用于離體分析。為了進(jìn)行組織學(xué)分析，將結(jié)腸的一部分在10％的福爾馬林中固定，并包埋在石蠟中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案用H&E對(duì)切片染色。

H&E染色的結(jié)腸切片的組織學(xué)評(píng)價(jià)如下分級(jí)：0，無(wú)炎癥跡象；1.低白細(xì)胞浸潤(rùn)；2.中度白細(xì)胞浸潤(rùn)；3.高白細(xì)胞浸潤(rùn)，中度纖維化，高血管密度，結(jié)腸壁增厚，中度杯 狀細(xì)胞損失和隱窩的病灶損失和4.透壁浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞的大量損失，廣泛的纖維化和隱窩的彌漫性損失。組織學(xué)評(píng)分由病理學(xué)家進(jìn)行。

由圖6、7、8可見，隨著乳酸菌數(shù)量的增加對(duì)腸炎小鼠的體重有明顯的改善作用，對(duì)腸炎小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度有明顯的改善作用，腸炎小鼠與正常小鼠的切片比較，杯狀細(xì)胞逐漸減少，炎性細(xì)胞逐漸增加。

實(shí)施例2

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的分離

1、菌種和培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

(1)菌源

來(lái)自中國(guó)某軍區(qū)健康士兵糞便

(2)培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基：1000mL蒸餾水，蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉9g，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三銨2g，半胱氨酸0.5g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，吐溫1ml，瓊脂粉15-20g，pH5.5-6.5。

2、菌株的分離和鑒定

(1)菌株的分離

預(yù)先經(jīng)滅菌處理后的手套箱中取適量新鮮糞便置于盛裝有無(wú)菌培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，充分震蕩渦旋混勻；

以上述充分震蕩渦旋混勻的糞便溶液為原液，做十倍梯度稀釋至合適梯度，取100μl均勻涂布于MRS+0.05％半胱氨酸固體平板培養(yǎng)基上，隨后取出置于厭氧罐中，37℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜。

次日可見平板上長(zhǎng)有形態(tài)大小各異的菌落，結(jié)合乳桿菌典型菌落形態(tài)特征，挑取若干有代表性的菌落作二代劃線純化處理，平板厭氧活化1天，得培養(yǎng)物，隨后做菌株鑒定。

(2)菌株的鑒定

革蘭氏染色形態(tài)學(xué)鑒定：

a、涂片：取滅過(guò)菌的載玻片于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在玻片上用記號(hào)筆做記號(hào)，便于觀察，隨后將玻片倒置，然后用移液器吸取10μl無(wú)菌生理鹽水均勻涂布在記號(hào)處，繼而用移液槍挑取純培養(yǎng)物均勻溶于生理鹽水中，涂布面不宜過(guò)大。

b、干燥：將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以防標(biāo)本烤枯而變形。

c、固定：固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰處盡快的來(lái)回通過(guò)2-3次，共約2-3秒種，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺(jué)過(guò)燙為宜(不超過(guò)60℃)，放置待冷后，進(jìn)行染色。

d、初染：在涂片薄膜上滴加草酸銨結(jié)晶紫1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。

e、水洗：斜置載玻片，在自來(lái)水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無(wú)色為止。

f、媒染：用100-1000ul移液槍吸取約300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。

g、水洗：斜置載玻片，在自來(lái)水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無(wú)色為止。

h、脫色：斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時(shí)20-30S，隨即水洗。

i、復(fù)染：在涂片薄膜上滴加沙黃染液1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。

j、水洗：斜置載玻片，在自來(lái)水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無(wú)色為止。

k、干燥、觀察：用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)及顏色，紫色的是革蘭氏陽(yáng)性菌，紅色的是革蘭氏陰性菌。

結(jié)果顯示：該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌。

16S rRNA序列的測(cè)定：

16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增使用的引物是一般細(xì)菌的引物——8F(5′-CACGGATCCAGAGTTTGAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG-3′)和1510R(5′-GTGAAGCTTAGGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′)產(chǎn)物委托有資質(zhì)的第三方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行sanger測(cè)序。應(yīng)用BLAST算法在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中把序列和16S rRNA基因進(jìn)行比較，應(yīng)用MEGA 4.0程序建立鄰接樹。

BLAST分析表明TR02菌十分接近鼠李糖乳桿菌(99％親緣性)。

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的評(píng)價(jià)

(一)菌種功能性評(píng)價(jià)

A.生長(zhǎng)曲線及各監(jiān)測(cè)點(diǎn)pH值的測(cè)定

6.標(biāo)記

取11支無(wú)菌大試管，用記號(hào)筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，即0、2、4、6、8、24h。

7.接種

分別用5mL無(wú)菌吸管吸取2.5mL TR02過(guò)夜培養(yǎng)液(培養(yǎng)8-16h)轉(zhuǎn)入盛有50mL MRS+0.05％半胱氨酸培養(yǎng)液的三角瓶?jī)?nèi)，混合均勻后分別取5mL混合液放入上述標(biāo)記的11支無(wú)菌大試管中。

8.培養(yǎng)

將已接種的試管置37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、2、4、6、8、24，將標(biāo)有相應(yīng)時(shí)間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測(cè)定其光密度值。

9.比濁測(cè)定

用未接種的MRS+0.05％半胱氨酸培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行光電比濁測(cè)定，從早取出的培養(yǎng)液開始依次測(cè)定，對(duì)細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用MRS+0.05％半胱氨酸液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其光密度值再0.1～0.65之內(nèi)(測(cè)定OD值前，將待測(cè)定的培養(yǎng)液振蕩，使細(xì)胞均勻分布)。

10.pH值的測(cè)定

剩余培養(yǎng)液測(cè)定pH值。

B.顯微鏡直接計(jì)數(shù)

6.菌懸液制備

以無(wú)菌生理鹽水將培養(yǎng)液制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?/p>

7.鏡檢技術(shù)室

在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的技術(shù)室進(jìn)行鏡檢，若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。

8.加樣品

將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的毛細(xì)滴管將搖勻的培養(yǎng)液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入技術(shù)室，一般技術(shù)室均能充滿菌液。

取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)技術(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。

9.顯微鏡計(jì)數(shù)

加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到技術(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。

調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對(duì)于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚技術(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。

在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)，一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5～10個(gè)菌體為宜。每個(gè)技術(shù)室選5個(gè)中格(可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)技術(shù)室中計(jì)得的平均值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。

10.清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板

使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭上用水沖洗干凈，切勿用硬物刷洗，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。

兩批次菌種功能性評(píng)價(jià)結(jié)果平行性較好(見表4、表5、圖11和圖12)，生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明TR02菌在0～4h內(nèi)處于適應(yīng)期，4～8h內(nèi)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8～12h處于平臺(tái)期，12h后即進(jìn)入衰退期；pH曲線與生長(zhǎng)曲線呈既截然相反的態(tài)勢(shì)，培養(yǎng)終點(diǎn)pH為4.44。

終點(diǎn)培養(yǎng)液經(jīng)顯微計(jì)數(shù)結(jié)果為3.54×10⁸cfu/ml。

表4批次一菌種功能性評(píng)價(jià)

表5批次二菌種功能性評(píng)價(jià)

(二)菌株耐酸實(shí)驗(yàn)

將供試菌株接種于MRS+0.05％半胱氨酸鹽酸鹽液體培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)24h，以5％的接種量加入到兩份用鹽酸調(diào)pH為2.5和6.2的MRS培養(yǎng)基中(pH為6.2的培養(yǎng)基為空白對(duì)照)，第一份用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取稀釋液100μL接種到MRS平板涂板，置于37℃，培養(yǎng)48h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。第二份37℃處理3h后，再用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取稀釋液100μL接種到MRS平板涂板，置于37℃培養(yǎng)48h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，即3h的活菌數(shù)，并計(jì)算出乳酸菌的存活率。存活率(％)＝(3h的活菌數(shù)/0h的活菌數(shù))×100。

由表6和圖13可見，TR02在pH6.5及pH4.5環(huán)境下培養(yǎng)3h未見顯著影響，而在pH3.0條件下生長(zhǎng)受到影響，表明pH4.5環(huán)境下TR02可以耐受。

表6菌株耐酸試驗(yàn)結(jié)果

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.結(jié)腸炎的誘導(dǎo)與治療

用含2.5％DSS(分子量36-50KDa)的溶液飼喂C57BL/6型小鼠(1-7天)，以誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型小鼠；對(duì)照組則飼喂水。在隨后的10天內(nèi)，分別口服水、乳酸菌(包埋0.9*10⁹、1.2*10⁹、2.4*10⁹，未包埋2.4*10⁹)和柳氮黃胺吡啶(0.5g/kg)。

每天稱量體重，觀察小鼠糞便粘稠度及糞便中和肛門處是否有血。計(jì)算疾病活動(dòng)指 數(shù)(DAI)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)以下參數(shù)進(jìn)行計(jì)算：

a)腹瀉(0分＝正常，2分＝輕便糞便，4分＝水性腹瀉)；

b)血膽量(0分＝?jīng)]有出血，2，輕微出血，4分，大出血)。

在誘導(dǎo)結(jié)腸炎后第10天，處死動(dòng)物，取出結(jié)腸，并制備結(jié)腸組織片用于離體分析。為了進(jìn)行組織學(xué)分析，將結(jié)腸的一部分在10％的福爾馬林中固定，并包埋在石蠟中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案用H&E對(duì)切片染色。

H&E染色的結(jié)腸切片的組織學(xué)評(píng)價(jià)如下分級(jí)：0，無(wú)炎癥跡象；1.低白細(xì)胞浸潤(rùn)；2.中度白細(xì)胞浸潤(rùn)；3.高白細(xì)胞浸潤(rùn)，中度纖維化，高血管密度，結(jié)腸壁增厚，中度杯狀細(xì)胞損失和隱窩的病灶損失和4.透壁浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞的大量損失，廣泛的纖維化和隱窩的彌漫性損失。組織學(xué)評(píng)分由病理學(xué)家進(jìn)行。

由圖14、15、16可見，隨著乳酸菌數(shù)量的增加對(duì)腸炎小鼠的體重有明顯的改善作用，對(duì)腸炎小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度有明顯的改善作用，腸炎小鼠與正常小鼠的切片比較，杯狀細(xì)胞逐漸減少，炎性細(xì)胞逐漸增加。

實(shí)施例3抑菌功效

將鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02與白念珠菌培養(yǎng)液混合培養(yǎng)，所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的質(zhì)量比為1.2:1，分別測(cè)定0、6、9、12、24h的OD值與pH值，如圖17所示，鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02對(duì)白念珠菌有明顯的抑菌效果，且能明顯降低環(huán)境的pH值。

實(shí)施例4抑菌功效

將鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02與白念珠菌培養(yǎng)液混合培養(yǎng)，所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的質(zhì)量比為1.5:1，分別測(cè)定0、6、9、12、24h的OD值與pH值，結(jié)果顯示：鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02對(duì)白念珠菌有明顯的抑菌效果，且能明顯降低環(huán)境的pH值。

實(shí)施例5抑菌功效

將鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02與白念珠菌培養(yǎng)液混合培養(yǎng)，所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus) TR08的質(zhì)量比為1.0:1，分別測(cè)定0、6、9、12、24h的OD值與pH值，結(jié)果顯示：鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02對(duì)白念珠菌有明顯的抑菌效果，且能明顯降低環(huán)境的pH值。

SEQUENCE LISTING

<110> 天益健康科學(xué)研究院（鎮(zhèn)江）有限公司

<120> 一種低pH條件下抑菌復(fù)合微生物制劑

<130> SC20161025001

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1490

<212> DNA

<213> Lactobacillus reuteri

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1490)

<400> 1

gggtacgcgg cggtgtgcta tacatgcaag tcgtacgcac tggcccaact gattgatggt 60

gcttgcacct gattgacgat ggattaccag tgagtggcgg acgggtgagt aacacgtagg 120

taacctgccc cggagcgggg gataacattt ggaaacagat gctaataccg cataacaaca 180

aaagccacat ggcttttgtt tgaaagatgg ctttggctat cactctggga tggacctgcg 240

gtgcattagc tagttggtaa ggtaacggct taccaaggcg atgatgcata gccgagttga 300

gagactgatc ggccacaatg gaactgagac acggtccata ctcctacggg aggcagcagt 360

agggaatctt ccacaatggg cgcaagcctg atggagcaac accgcgtgag tgaagaaggg 420

tttcggctcg taaagctctg ttgttggaga agaacgtgcg tgagagtaac tgttcacgca 480

gtgacggtat ccaaccagaa agtcacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 540

aggtggcaag cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttgcttaggt 600

ctgatgtgaa agccttcggc ttaaccgaag aagtgcatcg gaaaccgggc gacttgagtg 660

cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata tggaagaaca 720

ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgca actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag 780

cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgagtgcta ggtgttggag 840

ggtttccgcc cttcagtgcc ggagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc 900

gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960

aattcgaagc tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cttgcgctaa ccttagagat 1020

aaggcgttcc cttcggggac gcaatgacag gtggtgcatg gtcgtcgtca gctcgtgtcg 1080

tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg ttactagttg ccagcattaa 1140

gttgggcact ctagtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga cgacgtcaga 1200

tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacggta caacgagtcg 1260

caagctcgcg agagtaagct aatctcttaa agccgttctc agttcggact gtaggctgca 1320

actcgcctac acgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1380

gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtttgtaacg cccaaagtcg 1440

gtggcctaac ctttatggag ggagccgcct aaggcggaca gagactgggt 1490

<210> 2

<211> 1474

<212> DNA

<213> Lactobacillus rhamnosus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1474)

<400> 2

cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gaacgagttc tgattattga aaggtgcttg 60

catcttgatt taattttgaa cgaatggcgg aagggtgaat aacccgtggg taacctggcc 120

ttaaatgggg gataaccttt ggaaaccgaa gctaataccg cataaatccc aaaaccgcat 180

ggttcttggc tgaaagatgg ggtaaactat cccttttgga tggacccccg gcgtattaac 240

ttgttggtga ggtaacggct ccaccaggga atgataccta acccaactga aaggttgatc 300

ggccaccttg ggactgagac ccggcccaaa ctcctaccgg agggagcaat agggaatctt 360

ccccaatgga cgccagtctg aaggaacaac cccccgtggg tgaaaaaggg tttccggtcc 420

taaaactctg ttgttggaaa aaaatggtcc gcaaaataac tggtggccgc gtggccgtat 480

ccaacccgaa agccacggct aactacctgc ccagcaccgc ggtaataccg aggtggcaag 540

cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaagcgg gttttttagt ctgatgggaa 600

agccctcggc ttaaccgaag aagtgcatcg gaaactggga aacttgaatg cagaagaaga 660

cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cctagatata tggaagaaca ccagtggcga 720

aagccgctgt ctggtctgta actgacgctg aagctccaaa gcctgggtag cgaacaggat 780

tagataccct gggagtccat gccgtaacga tgaatgctag tggtggaagg tttccgccct 840

tcaatgccga gcttacgcaa taagcaatcc gcctggggga atacgaccgg caggttgaaa 900

cttcaaagaa tttgaccggg gccgcacaag ccggtggagc attgtggttt aattcgaagc 960

acgcgaagaa cttaccaggt cttgacatct tttgatcact tgaagatcaa gtttcccttc 1020

gggcaaatga cagtggtgca tggttgtcgt cagctccgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080

tcccgcaacg agcgcaaccc ttatgactag ttgccagcat ttagttgggc actctagtaa 1140

gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1200

acctgggcta cacacgtgct acaatggatg gtacaacgag ttgcgagacc gcgaggtcaa 1260

gctaatctct taaagccatt ctcagttcgg actgtaggct gcaactcgcc tacacgaagt 1320

cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1380

acaccgcccg tcacaccatg agagtttgta acacccgaag ccggtggcgt aaccctttta 1440

gggagcgagc cgtctaaggt ggacaaatga tact 1474