本申請(qǐng)是2009年8月18日提交的題為“單克隆抗體stro-4”的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200980141163.9的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及熱休克蛋白-90β(hsp-90β)作為鑒定和/或分離多潛能細(xì)胞的標(biāo)記物的用途。更具體地，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合人和綿羊hsp-90β的單克隆抗體(稱(chēng)為stro-4)的鑒定。本發(fā)明還涉及通過(guò)本發(fā)明的方法富集的細(xì)胞群和這些細(xì)胞的治療用途。發(fā)明背景包含造血支持性骨髓基質(zhì)和相關(guān)骨組織的細(xì)胞組分源自一群多潛能細(xì)胞，該多潛能細(xì)胞包括多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)和它們的前體(間充質(zhì)前體細(xì)胞(mpc))。mpc存在于主要位于環(huán)繞血管的血管周?chē)鷳B(tài)位的骨髓空間中(gronthossetal.,2003和shisetal.,2003)。在過(guò)去二十年中，研究集中于不同人基質(zhì)/間充質(zhì)細(xì)胞群重建脂肪、骨、軟骨和肌肉的再生潛能(gronthossetal.,2003和simmonspjetal.,1991)。但是，這些技術(shù)的成功應(yīng)用取決于以下能力：分離純化的mpc群，以及隨后離體控制它們的生長(zhǎng)和分化。此外，需要克服通常與基于干細(xì)胞的療法有關(guān)的各種技術(shù)和安全性顧慮，這通過(guò)在合適的大量人疾病臨床前動(dòng)物模型代表中評(píng)價(jià)mpc制品(preparation)的安全性和功效實(shí)現(xiàn)。人矯形和心臟疾病/創(chuàng)傷的綿羊模型已得到廣泛使用，因?yàn)榫d羊與人解剖、生理、免疫學(xué)和胚胎發(fā)育具有相似性(aireyjaetal.,2004；liechtykwetal.,2000和mackenzietcetal.,2001)。同時(shí)，數(shù)種人多潛能細(xì)胞特異性標(biāo)記物如stro-1、cd106、cd146已經(jīng)在文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述(gronthossetal.,2003和shisetal.,2003)，在人疾病綿羊模型中檢查多潛能細(xì)胞的治療潛力的顯著進(jìn)展受到限制，這是因?yàn)槿狈υ试S分離和表征綿羊組織中等同的多潛能細(xì)胞群的特異性試劑。諸如單克隆抗體的與綿羊和人多潛能細(xì)胞均反應(yīng)的生物學(xué)試劑的開(kāi)發(fā)分別會(huì)極大促進(jìn)在臨床前和臨床試驗(yàn)中監(jiān)測(cè)和等同綿羊和人多潛能細(xì)胞群的功能性的能力。已包括在本說(shuō)明書(shū)中的關(guān)于文獻(xiàn)、法規(guī)、材料、裝置、論文等的任何討論只是為了提供本發(fā)明的背景。其不應(yīng)被視作承認(rèn)任何或全部這些內(nèi)容由于存在于本申請(qǐng)每項(xiàng)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前而構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的公知常識(shí)。發(fā)明概述本發(fā)明描述了一種稱(chēng)為stro-4的新單克隆抗體(mab)的產(chǎn)生和表征，該單克隆抗體從未分級(jí)的綿羊和人骨髓鑒定和分離多潛能細(xì)胞。具體地，stro-4抗體能夠在兩個(gè)物種中基本上分離全部產(chǎn)克隆多潛能細(xì)胞(cfu-f：成纖維細(xì)胞集落形成單位)。分離的多潛能細(xì)胞表現(xiàn)出高增殖潛能和多譜系分化。出人意料的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-90β(hsp-90β)蛋白在體內(nèi)多潛能細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)，并且據(jù)發(fā)現(xiàn)單克隆抗體stro-4鑒定hsp-90β上表達(dá)的獨(dú)特表位。因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了hsp-90β作為鑒定和/或富集多潛能細(xì)胞的標(biāo)記物的用途。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種富集多潛能細(xì)胞的方法，所述方法包括從組織來(lái)源制備細(xì)胞樣品并且富集表達(dá)所述hsp-90β標(biāo)記物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，多潛能細(xì)胞是成體多潛能細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的富集的細(xì)胞群沒(méi)有被體外培養(yǎng)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的富集的細(xì)胞群能夠產(chǎn)生產(chǎn)克隆cfu-f。在另一實(shí)施方案中，富集的細(xì)胞群對(duì)于hsp-90β+/stro-4+細(xì)胞是同質(zhì)(homogenous)的。在一個(gè)實(shí)例中，富集多潛能細(xì)胞的方法包括：使細(xì)胞樣品與hsp-90β結(jié)合劑接觸；和將結(jié)合所述hsp-90β結(jié)合劑的細(xì)胞與不結(jié)合所述hsp-90β結(jié)合劑的細(xì)胞分離。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種鑒定細(xì)胞樣品中多潛能細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括鑒定樣品中表達(dá)所述hsp-90β標(biāo)記物的細(xì)胞。在一實(shí)例中，鑒定細(xì)胞樣品中多潛能細(xì)胞存在的方法包括：從組織來(lái)源獲得細(xì)胞樣品；在適合于hsp-90β與所述hsp-90β結(jié)合劑結(jié)合的條件下，使所述細(xì)胞樣品與hsp-90β結(jié)合劑接觸；和檢測(cè)結(jié)合所述樣品中細(xì)胞的hsp-90β結(jié)合劑的存在，其中結(jié)合所述hsp-90β結(jié)合劑的細(xì)胞指示多潛能細(xì)胞的存在。細(xì)胞樣品可以源自疑似含有多潛能細(xì)胞的任何組織來(lái)源。例如，組織來(lái)源可以是胎盤(pán)、脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結(jié)、胸腺、卵巢、胰、骨、韌帶、骨髓、腱或骨骼肌。在優(yōu)選實(shí)施方案中，組織來(lái)源是骨髓。富集多潛能細(xì)胞的細(xì)胞來(lái)源可以是人或綿羊來(lái)源。但是，本發(fā)明還適用于源自其他動(dòng)物物種的細(xì)胞，包括牛、馬、鼠、豬、犬或貓。本發(fā)明還涉及從本發(fā)明多潛能細(xì)胞的體外培養(yǎng)產(chǎn)生的子代細(xì)胞。本發(fā)明的擴(kuò)增的細(xì)胞可以具有多種表型，這取決于培養(yǎng)條件(包括培養(yǎng)基中刺激因子的數(shù)量和/或類(lèi)型)、傳代次數(shù)等。在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)本發(fā)明的富集群產(chǎn)生還表達(dá)選自以下標(biāo)記物的一種或多種標(biāo)記物的多潛能細(xì)胞：stro-1、stro-3(tnsap)、lfa-3、thy-1、vcam-1、icam-1、pecam-1、p-選擇蛋白、l-選擇蛋白、cd49a/cd49b/cd29、cd49c/cd29、cd49d/cd29、cd29、cd18、cd61、整合蛋白β、6-19、血栓調(diào)節(jié)蛋白、cd10、cd13、scf、pdgf-r、egf-r、igf1-r、ngf-r、fgf-r、瘦蛋白-r、(stro-2＝瘦蛋白-r)、rankl、stro-1bright和cd146或這些標(biāo)記物的任意組合。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多潛能細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)不能產(chǎn)生造血細(xì)胞。本發(fā)明的方法還可以包括在第一富集步驟之前收獲多潛能細(xì)胞來(lái)源的步驟。這可以包括，例如從受試者手術(shù)取出組織，并且從該組織分離細(xì)胞以形成單細(xì)胞懸液。這種分離可以通過(guò)物理或酶促方式實(shí)現(xiàn)。這類(lèi)方式是本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。在本發(fā)明的一實(shí)例中，這個(gè)步驟涉及使用已知技術(shù)收集骨髓細(xì)胞。用于本發(fā)明方法的hsp-90β結(jié)合劑可以是鑒定為具有對(duì)hsp-90β的結(jié)合親和力的任何多肽或化合物。優(yōu)選地，hsp-90β結(jié)合劑特異性結(jié)合hsp-90β。優(yōu)選地，hsp-90β結(jié)合劑特異性結(jié)合hsp-90β上的表位，其中hsp-90β包含與seqidno:1(圖5)的序列至少約75％相同的序列，優(yōu)選與seqidno:1至少約78％相同，更優(yōu)選至少約80％相同，仍然更優(yōu)選至少約85％相同，仍然更優(yōu)選至少約90％相同，甚至更優(yōu)選與seqidno:1至少約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。在一實(shí)施方案中，hsp-90β結(jié)合劑選自肽、擬肽類(lèi)(peptidomimetic)、核酸適配體、肽適配體、樹(shù)狀聚體和小有機(jī)分子。在一實(shí)例中，hsp-90β結(jié)合劑是寡核苷酸。優(yōu)選地，寡核苷酸是標(biāo)記的寡核苷酸。在另一實(shí)施方案中，hsp-90β結(jié)合劑是純化的抗hsp-90β抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物?？筯sp-90β抗體可以是單克隆抗體、重組抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，抗hsp-90β單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的stro-4抗體，所述雜交瘤細(xì)胞系依據(jù)布達(dá)佩斯條約(budapesttreaty)的條款于2008年7月10日保藏于atcc，保藏登錄號(hào)為pta-9362。用于本發(fā)明方法的其他合適的抗hsp-90β單克隆抗體包括可商購(gòu)的抗體，如小鼠抗人hsp90βmab克隆h9010(invitrogen)、小鼠抗hsp90bmab克隆emd-5e12(calbiochem)、小鼠抗人hsp90βmab克隆k3725b(cosmobioco.,ltd)和小鼠抗人hsp90βmab克隆k3705(assaydesigns/stressgenbioreagents)。上文未提及的其他可商購(gòu)的抗體考慮為在本發(fā)明范圍內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種hsp-90β結(jié)合劑或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其選自：(i)stro-4單克隆抗體；(ii)嵌合抗體，其包含來(lái)自stro-4的重鏈和輕鏈的可變區(qū)以及人重鏈和輕鏈的恒定區(qū)；和(iii)人源化抗體，其包含至少一個(gè)來(lái)自stro-4的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)以及人框架(framework)區(qū)和恒定區(qū)序列。在另一實(shí)施方案中，人源化抗體包含所有6個(gè)來(lái)自stro-4的cdr。在另一實(shí)施方案中，hsp-90β結(jié)合劑是重組抗體，其包含與雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的stro-4抗體的序列基本上相同的序列，所述雜交瘤細(xì)胞系依據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2008年7月10日保藏于atcc，保藏登錄號(hào)為pta-9362。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，hsp-90β結(jié)合劑是標(biāo)記的。在一實(shí)例中，標(biāo)記是熒光標(biāo)記。在另一實(shí)例中，標(biāo)記是酶標(biāo)記。在另一實(shí)施方案中，結(jié)合hsp-90β結(jié)合劑的細(xì)胞的分離通過(guò)機(jī)械式細(xì)胞分選儀進(jìn)行。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，hsp-90β結(jié)合劑與熒光標(biāo)記化合物偶聯(lián)。在這種情況下，結(jié)合hsp-90β結(jié)合劑的細(xì)胞的分離優(yōu)選使用熒光激活細(xì)胞分選儀(facs)進(jìn)行。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，hsp-90β結(jié)合劑與固體顆粒連接。優(yōu)選地，固體顆粒是磁性顆粒。在本發(fā)明的這一實(shí)施方案中，結(jié)合hsp-90β結(jié)合劑的細(xì)胞的分離優(yōu)選通過(guò)從液相分離顆粒相進(jìn)行。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在分離步驟前，使細(xì)胞樣品與針對(duì)連接到固體顆粒的hsp-90β結(jié)合劑的抗體接觸，其中結(jié)合hsp-90β結(jié)合劑的細(xì)胞的分離通過(guò)從液相分離顆粒相進(jìn)行。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，細(xì)胞樣品的細(xì)胞是在固體支持物上培養(yǎng)的粘附細(xì)胞，未結(jié)合的hsp-90β結(jié)合劑的去除通過(guò)漂洗進(jìn)行。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，細(xì)胞樣品的細(xì)胞是懸浮培養(yǎng)的，未結(jié)合的hsp-90β結(jié)合劑的去除通過(guò)離心細(xì)胞樣品并分離所得上清進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，將細(xì)胞樣品進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞分選步驟以富集或減少細(xì)胞中表達(dá)至少一種其他多潛能細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞群。多潛能細(xì)胞標(biāo)記物可以是選自以下標(biāo)記物的一種或多種標(biāo)記物：stro-1、stro-3(tnsap)、cd106、cd146、lfa-3、thy-1、vcam-1、icam-1、pecam-1、p-選擇蛋白、l-選擇蛋白、cd49a/cd49b/cd29、cd49c/cd29、cd49d/cd29、cd29、cd18、cd61、整合蛋白β、6-19、血栓調(diào)節(jié)蛋白、cd10、cd13、scf、pdgf-r、egf-r、igf1-r、ngf-r、fgf-r、瘦蛋白-r、(stro-2＝瘦蛋白-r)、rankl或這些標(biāo)記物的任意組合。本發(fā)明還提供了通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的富集的多潛能細(xì)胞群。本發(fā)明還提供了富集的hsp-90β+多潛能細(xì)胞群。優(yōu)選地，總富集的細(xì)胞群的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％是具有表型hsp-90β+的多潛能細(xì)胞。優(yōu)選地，富集的多潛能細(xì)胞群通過(guò)本發(fā)明的方法獲得。本發(fā)明還提供了通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明的富集的多潛能細(xì)胞群而獲得的擴(kuò)增的細(xì)胞群。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的富集的細(xì)胞群或本發(fā)明的擴(kuò)增的細(xì)胞群包含至少一些經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生組織特異性定向的細(xì)胞群的方法，所述方法包括在一種或多種刺激因子的存在下培養(yǎng)本發(fā)明的多潛能細(xì)胞群，和將所述培養(yǎng)的細(xì)胞群置于使所述多潛能細(xì)胞偏向分化為特定組織類(lèi)型的條件下。在本發(fā)明這種方法的一實(shí)施方案中，組織類(lèi)型選自胎盤(pán)組織、心肌、血管組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神經(jīng)組織、平滑肌和內(nèi)皮組織。本發(fā)明還提供了一種組合物，其包含本發(fā)明的富集的多潛能細(xì)胞和/或本發(fā)明的擴(kuò)增的細(xì)胞群。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物還包含刺激因子。這樣的組合物可以是治療上有益的，因此會(huì)制備成藥學(xué)可接受的形式。在另一實(shí)施方案中，所述組合物還包含使本發(fā)明的多潛能細(xì)胞偏向分化為一種特定組織類(lèi)型的因子。優(yōu)選地，所述組織類(lèi)型選自但不限于心肌、血管組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神經(jīng)組織、胎盤(pán)、平滑肌和內(nèi)皮組織。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還包含纖維蛋白膠。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生或修復(fù)受試者的組織的方法，所述方法包括給予所述受試者本發(fā)明的富集和/或擴(kuò)增的多潛能細(xì)胞群。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生或修復(fù)受試者的組織的方法，所述方法包括給予所述受試者本發(fā)明的組合物。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的富集和/或擴(kuò)增的多潛能細(xì)胞群在制備用于產(chǎn)生或修復(fù)受試者的組織的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合物在制備用于產(chǎn)生或修復(fù)受試者的組織的藥物中的用途。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生或修復(fù)的組織選自但不限于心肌、血管組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神經(jīng)組織、胎盤(pán)、平滑肌和內(nèi)皮組織。優(yōu)選地，本發(fā)明的多潛能細(xì)胞是人來(lái)源的。本發(fā)明還提供了通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的分離的細(xì)胞或其子代細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是遺傳修飾的。本發(fā)明還提供了一種stro-4雜交瘤細(xì)胞系，其依據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2008年7月10日保藏于atcc，保藏登錄號(hào)為pta-9362。本發(fā)明還提供了由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的stro-4抗體，所述雜交瘤細(xì)胞系依據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2008年7月10日保藏于atcc，保藏登錄號(hào)為pta-9362。本發(fā)明還提供了一種分離的抗體，其與雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的stro-4抗體結(jié)合多潛能細(xì)胞上相同的表位，所述雜交瘤細(xì)胞系依據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2008年7月10日保藏于atcc，保藏登錄號(hào)為pta-9362。本發(fā)明還提供了一種組合物，其包含hsp-90β結(jié)合劑或其抗原結(jié)合片段或衍生物。優(yōu)選地，所述組合物還包含一種或多種藥學(xué)可接受的載體(carrier)和/或合適的佐劑或賦形劑。在本說(shuō)明書(shū)中，單詞“包含(comprise)”或者諸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的變形應(yīng)理解為表示包括一個(gè)指定的元素、整數(shù)或步驟或者元素、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他元素、整數(shù)或步驟或者元素、整數(shù)或步驟的組。附圖說(shuō)明圖1.stro-4抗原由包括基本上所有產(chǎn)克隆mpc在內(nèi)的綿羊和人bmmnc的小細(xì)胞群表達(dá)對(duì)ficoll分離的綿羊和人bmmnc的樣本進(jìn)行單色免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)以檢查stro-4抗原的表達(dá)。對(duì)每個(gè)群，綿羊(a)和人(b)bmmnc樣品中stro-4+細(xì)胞的平均發(fā)生率分別是4.0％±1.2和3.0％±1.0(n＝3)。數(shù)據(jù)顯示為1×104個(gè)光散射門(mén)控事件的單參數(shù)熒光(藻紅蛋白(pe))直方圖，收集為列表式數(shù)據(jù)。igg對(duì)照(虛線(xiàn))；mabstro-3(實(shí)線(xiàn))。將未分級(jí)bm和macs選擇的stro-4+和stro-4-綿羊(c)和人(d)bmmnc的單細(xì)胞懸液接種入普通生長(zhǎng)培養(yǎng)基以評(píng)價(jià)每種細(xì)胞組分中粘附性集落形成細(xì)胞的發(fā)生率。按照方法部分的描述，培養(yǎng)12天后，將集落(50個(gè)細(xì)胞或更多的聚集體)染色并評(píng)分。柱圖表示對(duì)于每種細(xì)胞組分，接種的每105個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)克隆集落的數(shù)目，該結(jié)果來(lái)自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。這些數(shù)據(jù)證明大多數(shù)產(chǎn)克隆mpc僅限于bm的stro-4+組分。圖2.離體擴(kuò)增的mpc表達(dá)高水平的stro-4抗原。傳代兩次的綿羊mpc(a)和人mpc(b)以及mg63細(xì)胞(c)的單細(xì)胞懸液通過(guò)胰蛋白酶/edta消化獲得，然后進(jìn)行處理以用于單色流式細(xì)胞術(shù)。隨后將細(xì)胞用stro-4上清孵育，然后用偶聯(lián)pe的山羊抗鼠igg間接標(biāo)記。直方圖代表2×104個(gè)事件，收集為列表式數(shù)據(jù)。stro-4的陽(yáng)性(通過(guò)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)記物高亮顯示)定義為大于99％的同種型匹配的未結(jié)合對(duì)照抗體(1b5；黑線(xiàn))所觀察到的熒光水平的熒光水平。結(jié)果證明大多數(shù)離體擴(kuò)增的綿羊和人mpc表達(dá)stro-4(粗線(xiàn))。圖3.stro-4抗原選擇的綿羊和人mpc的發(fā)展?jié)摿?。在成?adipocytic)、成骨或成軟骨條件下誘導(dǎo)源自stro-4抗原選擇的綿羊和人mpc的細(xì)胞的傳代培養(yǎng)物。于脂肪形成誘導(dǎo)兩周內(nèi)，通過(guò)油紅-o染色(箭頭)檢測(cè)人mpc(a)和綿羊mpc(b)培養(yǎng)物(200×)中含脂脂肪細(xì)胞簇的存在。于骨誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)4周內(nèi)，在人mpc(c)和綿羊mpc(d)培養(yǎng)物(200×)中形成用茜素紅試劑(箭頭)陽(yáng)性染色的礦化沉積物。于成軟骨誘導(dǎo)3周后，在人mpc(e)和綿羊mpc(f)培養(yǎng)物(箭頭)(200×)中，聚集培養(yǎng)中蛋白聚糖的甲苯胺藍(lán)陽(yáng)性染色存在于圍繞軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞(箭頭)的整個(gè)細(xì)胞團(tuán)。圖4.stro-4抗體鑒定90kda分子量的蛋白。按照方法部分的描述，從培養(yǎng)擴(kuò)增的stro-4+人mpc的單細(xì)胞懸液制備質(zhì)膜裂解物。將細(xì)胞裂解物用stro-4上清或同種型匹配的對(duì)照抗體1b5孵育，然后通過(guò)磁珠分離進(jìn)行免疫沉淀。通過(guò)10％(w/v)sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析免疫沉淀物，然后利用考馬斯藍(lán)染色顯示。圖5.stro-4抗體鑒定熱休克蛋白-90β。按照方法部分的描述，從培養(yǎng)擴(kuò)增的stro-4+人mg63的單細(xì)胞懸液制備質(zhì)膜裂解物。將細(xì)胞裂解物用stro-4上清孵育，然后通過(guò)磁珠分離進(jìn)行免疫沉淀。通過(guò)10％(w/v)sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析免疫沉淀物，然后利用考馬斯藍(lán)染色顯示。從凝膠切下90kda條帶，將其進(jìn)行胰蛋白酶消化，然后利用具有ms模式的tof/tof光學(xué)裝置的appliedbiosystems4700蛋白質(zhì)組分析儀(proteomicsanalyser)進(jìn)行質(zhì)譜分析。微量測(cè)序肽分析證明了與人熱休克蛋白-90β(ncbi，登錄號(hào)p08238)匹配的stro-4測(cè)序的肽(粗體)。圖6.stro-4抗體對(duì)熱休克蛋白-90β的特異性反應(yīng)性的確認(rèn)。按照方法部分的描述，制備培養(yǎng)擴(kuò)增的stro-4+人mpc作為單獨(dú)的全細(xì)胞裂解物或用于產(chǎn)生stro-4或1b5免疫沉淀物。在10％(w/v)sds-聚丙烯酰胺凝膠上通過(guò)電泳分析全細(xì)胞裂解物和stro-4或1b5免疫沉淀物。將蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜，然后用5％脫脂奶粉-0.05％吐溫-20封閉，然后將濾膜(filter)用可商購(gòu)的針對(duì)hsp-90β的多克隆抗體孵育。通過(guò)imagequant軟件(moleculardynamics)，利用fluorimager(moleculardynamics,sunnyvale,ca)顯示免疫反應(yīng)性蛋白?？筯sp-90β抗體在對(duì)照全細(xì)胞裂解物制品和stro-4免疫沉淀樣品中均檢測(cè)到特征性90kda條帶。發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)“和/或”，例如“x和/或y”應(yīng)當(dāng)理解為表示“x和y”或“x或y”，并且應(yīng)當(dāng)對(duì)這兩種含義或任一種含義提供明確的支持。微生物保藏詳細(xì)資料產(chǎn)生命名為stro-4的單克隆抗體的雜交瘤于2008年7月10日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)，登錄號(hào)為pta-9362。該保藏依據(jù)國(guó)際公認(rèn)的用于專(zhuān)利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的條款和其下細(xì)則進(jìn)行。這保證了從保藏日起30年可以維持成活力的培養(yǎng)物。該有機(jī)體可以根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款從atcc得到，布達(dá)佩斯條約保證在相關(guān)專(zhuān)利公布后，公眾可永久并且不受限制的獲得培養(yǎng)物的子代。本申請(qǐng)的受讓人同意，如果在合適條件下培養(yǎng)時(shí)保藏的培養(yǎng)物死亡或丟失或破壞，將根據(jù)通知迅速用相同培養(yǎng)物的活樣本進(jìn)行替換。保藏株的可獲得性不應(yīng)理解為對(duì)違反任何政府根據(jù)其專(zhuān)利法所授權(quán)的權(quán)利來(lái)實(shí)施發(fā)明的許可。常規(guī)技術(shù)除非另外專(zhuān)門(mén)定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都應(yīng)與本領(lǐng)域(例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué))普通技術(shù)人員通常的理解具有相同的含義。除非另外指出，本發(fā)明使用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法。這類(lèi)技術(shù)在貫穿以下的文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述和解釋?zhuān)鏹.perbal,apracticalguidetomolecularcloning,johnwileyandsons(1984),j.sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharbourlaboratorypress(1989),t.a.brown(editor),essentialmolecularbiology:apracticalapproach,volumes1and2,irlpress(1991),d.m.gloverandb.d.hames(editors),dnacloning:apracticalapproach,volumes1-4,irlpress(1995and1996)和f.m.ausubeletal.(editors),currentprotocolsinmolecularbiology,greenepub.associatesandwiley-interscience(1988，包括到現(xiàn)在為止的所有更新),edharlowanddavidlane(editors)antibodies:alaboratorymanual,coldspringharbourlaboratory,(1988)和j.e.coliganetal.(editors)currentprotocolsinimmunology,johnwiley&sons(包括到現(xiàn)在為止的所有更新)。多潛能細(xì)胞多潛能細(xì)胞是能夠產(chǎn)生幾種成熟細(xì)胞類(lèi)型中的任意種的細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，多潛能細(xì)胞源自成體組織。該術(shù)語(yǔ)包括例如間充質(zhì)前體細(xì)胞(mpc)、間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)和多潛能擴(kuò)增的mpc子代(memp)。間充質(zhì)前體細(xì)胞(mpc)是在骨髓、血液、真皮和骨膜中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞；其能夠分化為間充質(zhì)或結(jié)締組織的特定類(lèi)型，包括脂肪、骨、軟骨、彈性、肌肉和纖維結(jié)締組織。這些細(xì)胞進(jìn)入的特定譜系定向和分化途徑取決于各種機(jī)械影響和/或諸如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子的內(nèi)源生物活性因子的影響和/或宿主組織所建立的局部微環(huán)境條件的影響。間充質(zhì)前體細(xì)胞定義為不會(huì)終端分化的細(xì)胞；其可以無(wú)限地分裂；其分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞是干細(xì)胞或在一定時(shí)期會(huì)不可逆分化以產(chǎn)生表型和/或功能不同的細(xì)胞類(lèi)型的祖細(xì)胞。mpc是能夠形成大量多潛能細(xì)胞的非造血祖細(xì)胞。多潛能細(xì)胞的富集本文使用的術(shù)語(yǔ)“富集的”、“富集”或其變形用于描述與未處理的細(xì)胞群相比，一種特定細(xì)胞類(lèi)型的比例或許多種特定細(xì)胞類(lèi)型的比例增加的細(xì)胞群。本發(fā)明的富集多潛能細(xì)胞的方法可以基于檢測(cè)單獨(dú)的hsp-90β標(biāo)記物的存在或hsp-90β標(biāo)記物結(jié)合一種或多種其他標(biāo)記物的存在。例如，富集多潛能細(xì)胞的方法還可以基于富集對(duì)選自以下標(biāo)記物的一種或多種標(biāo)記物陽(yáng)性的細(xì)胞：stro-1、stro-3(tnsap)、cd106、cd146、lfa-3、thy-1、vcam-1、icam-1、pecam-1、p-選擇蛋白、l-選擇蛋白、cd49a/cd49b/cd29、cd49c/cd29、cd49d/cd29、cd29、cd18、cd61、整合蛋白β、6-19、血栓調(diào)節(jié)蛋白、cd10、cd13、scf、pdgf-r、egf-r、igf1-r、ngf-r、fgf-r、瘦蛋白-r、(stro-2＝瘦蛋白-r)、rankl或這些標(biāo)記物的任意組合。因此，本發(fā)明的富集的多潛能細(xì)胞群也可以對(duì)這些標(biāo)記物的一種或多種或它們的組合是陽(yáng)性的。細(xì)胞對(duì)指定標(biāo)記物是“陽(yáng)性”表示它可以是該標(biāo)記物的低(lo或dim)或高(高(bright)，bri)表達(dá)者(expresser)，這取決于標(biāo)記物在細(xì)胞表面存在的程度，其中該術(shù)語(yǔ)涉及用于細(xì)胞的顏色分選方法的熒光或其他顏色的強(qiáng)度。lo(或dim或dull)和bri的區(qū)別在用于分選的特定細(xì)胞群的標(biāo)記物的背景下進(jìn)行理解。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“高”指當(dāng)可檢測(cè)地標(biāo)記時(shí)在細(xì)胞表面產(chǎn)生較高信號(hào)的標(biāo)記物。同時(shí)不希望受理論約束，認(rèn)為“高”細(xì)胞比樣品中的其他細(xì)胞表達(dá)更多的靶標(biāo)記物抗原(例如由stro-1識(shí)別的抗原)。例如，通過(guò)facs分析，當(dāng)用熒光偶聯(lián)的stro-1抗體標(biāo)記時(shí)，stro-1bri細(xì)胞比非-高細(xì)胞(stro-1dull/dim)產(chǎn)生更多的熒光信號(hào)。在另一實(shí)例中，stro-1bright細(xì)胞具有stro-1表面表達(dá)的2個(gè)log級(jí)的更高表達(dá)。這是相對(duì)于同種型匹配的陰性對(duì)照計(jì)算的。通過(guò)比較，stro-1dim和/或stro-1intermediate細(xì)胞相對(duì)于同種型匹配陰性對(duì)照具有stro-1表面表達(dá)的少于2個(gè)log級(jí)的更高表達(dá)，通常是約1個(gè)log或更低的表達(dá)。例如，所述方法可以包括制備第一部分富集的細(xì)胞池(pool)的步驟，這通過(guò)富集第一多潛能細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)進(jìn)行，然后進(jìn)行從部分富集的細(xì)胞池富集hsp-90β的表達(dá)的步驟。在另一實(shí)例中，所述方法可以包括基于選擇表達(dá)hsp-90β的細(xì)胞的初始富集步驟，然后進(jìn)行涉及富集不同多潛能細(xì)胞標(biāo)記物的步驟。仍在另一實(shí)例中，所述方法涉及同時(shí)選擇表達(dá)hsp-90β和一種或多種其他多潛能細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞。優(yōu)選地，大部分多潛能細(xì)胞能夠分化為至少兩種定向細(xì)胞類(lèi)型。多潛能細(xì)胞可以分化成的細(xì)胞系的非限制性實(shí)例包括骨前體細(xì)胞；肝細(xì)胞祖細(xì)胞(progenitor)，其對(duì)于膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞是多能性的；神經(jīng)限制性細(xì)胞，其可以產(chǎn)生發(fā)展為少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)細(xì)胞前體；神經(jīng)元前體，其發(fā)展為神經(jīng)元；心肌和心肌細(xì)胞的前體，葡萄糖應(yīng)答性胰島素分泌胰β細(xì)胞系。其他細(xì)胞系包括但不限于成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞和軟骨細(xì)胞以及下列前體細(xì)胞∶視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、諸如角質(zhì)形成細(xì)胞的皮膚細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、輸尿管(renalduct)上皮細(xì)胞、平滑肌和骨骼肌細(xì)胞、睪丸祖細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腱細(xì)胞、韌帶細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、周細(xì)胞、血管細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，多潛能細(xì)胞至少能在體內(nèi)或體外培養(yǎng)以產(chǎn)生脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和/或軟骨細(xì)胞。應(yīng)理解表達(dá)細(xì)胞表面hsp-90β的細(xì)胞的分離可以受到多種不同方法的影響，但是所有這些方法在一定程度上依賴(lài)于細(xì)胞與hsp-90β結(jié)合劑的結(jié)合，然后是表現(xiàn)出高水平結(jié)合或低水平結(jié)合或不結(jié)合的那些細(xì)胞的分離。hsp-90β/stro-4抗原h(huán)sp-90β通常存在于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，它作為分子伴侶蛋白以促進(jìn)后天細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的許多關(guān)鍵調(diào)節(jié)子的正常折疊、胞內(nèi)沉積和蛋白水解轉(zhuǎn)換。其是高度保守的應(yīng)激應(yīng)答蛋白家族的部分。在正常生理?xiàng)l件下hsp通常以低水平表達(dá)，但在響應(yīng)細(xì)胞應(yīng)激時(shí)則表現(xiàn)出顯著增加的表達(dá)。應(yīng)理解術(shù)語(yǔ)“hsp-90β”不限于人或綿羊來(lái)源的序列，還包括獲得自任何來(lái)源的同源序列，例如同系物，尤其是直系同源物(即獲得自除了人之外的物種的同系物)、等位基因變體及其片段和合成肽或衍生物。多肽的序列同一性(％同一性)通過(guò)fasta(pearsonandlipman,(1988))分析(gcg程序)確定，這使用缺省設(shè)置和長(zhǎng)度為至少50個(gè)氨基酸的查詢(xún)序列，因此fasta分析在至少50個(gè)氨基酸的區(qū)域比對(duì)兩條序列。更優(yōu)選地，fasta分析在至少100個(gè)氨基酸的區(qū)域比對(duì)兩條序列。更優(yōu)選地，fasta分析在至少250個(gè)氨基酸的區(qū)域比對(duì)兩條序列。甚至更優(yōu)選地，fasta分析在至少350個(gè)氨基酸的區(qū)域比對(duì)兩條序列。術(shù)語(yǔ)“hsp-90β”還包括上述全長(zhǎng)多肽的片段及其變體，包括hsp-90β序列的片段。優(yōu)選的片段包括包含表位的那些片段。合適片段的長(zhǎng)度為至少約6或7個(gè)氨基酸，例如長(zhǎng)度為至少10、12、15或20個(gè)氨基酸。它們的長(zhǎng)度還可以小于200、100或50個(gè)氨基酸。hsp-90β結(jié)合劑當(dāng)用于本文時(shí)，短語(yǔ)“hsp-90β結(jié)合劑”指識(shí)別和/或特異性結(jié)合hsp-90β的部分。“特異性結(jié)合”表示hsp-90β結(jié)合劑能夠以合適的親和力和/或親合性結(jié)合hsp-90β以提供用于選擇性富集表達(dá)hsp-90β的細(xì)胞的有效工具。即，與替代性靶標(biāo)(例如非hsp-90β)相比，hsp-90β結(jié)合劑與hsp-90β的結(jié)合更頻繁、更快速、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)和/或親和力更高。例如，與結(jié)合其他非hsp90β靶標(biāo)相比，特異性結(jié)合hsp90β或者其表位或免疫原性片段的hsp90β結(jié)合劑的結(jié)合具有更高的親和力、親合性、更容易和/或持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。優(yōu)選的hsp-90β結(jié)合劑是經(jīng)鑒定具有對(duì)hsp-90β的結(jié)合親和力的多肽或化合物?；诜强贵w的結(jié)合劑本發(fā)明的hsp-90β結(jié)合劑包括肽、擬肽類(lèi)、核酸適配體、肽適配體、樹(shù)狀聚體和小有機(jī)分子。核酸適配體(可適應(yīng)的低聚物)是能夠形成提供結(jié)合分子靶標(biāo)的能力的二級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸分子。例如，通過(guò)將隨機(jī)寡核苷酸克隆入載體(或者就rna適配體而言是表達(dá)載體)來(lái)產(chǎn)生適配體文庫(kù)，其中隨機(jī)序列的兩側(cè)是提供pcr引物的結(jié)合位點(diǎn)的已知序列。例如，使用selex(指數(shù)級(jí)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(sytematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment))選擇活性增加的適配體。用于產(chǎn)生和/或篩選適配體文庫(kù)的合適方法描述于例如elloingtonandszostak,nature346:818–22,1990。用于合成小有機(jī)化合物的技術(shù)依據(jù)化合物而顯著改變，但是這類(lèi)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在一實(shí)施方案中，使用信息學(xué)方法從已知化合物中選擇合適的化學(xué)結(jié)構(gòu)單元來(lái)產(chǎn)生組合文庫(kù)。例如，qsar(定量構(gòu)效關(guān)系(quantitativestructureactivityrelationship))建模方法使用線(xiàn)性回歸或化合物結(jié)構(gòu)的回歸樹(shù)來(lái)確定適應(yīng)性。chemicalcomputinggroup,inc.(montreal,canada)的軟件使用關(guān)于活性以及非活性化合物的高通量篩選實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)產(chǎn)生隨機(jī)qsar模型，該模型隨后用于選擇前導(dǎo)化合物。二元qsar方法基于化合物的3種特性，其構(gòu)成特定化合物能或不能完成所需功能的可能性的“描述符(descriptor)”：部分電荷、摩爾折射率(鍵合相互作用)和logp(分子的親脂性)。分子中的每個(gè)原子都有表面積，并且具有與此相關(guān)的這3種特性。具有某種范圍的部分電荷的化合物所有原子都被確定，并將表面積(vanderwallssurfacearea描述符)相加。然后將二元qsar模型用于建立活性模型或admet模型，其用于構(gòu)建組合文庫(kù)。因此，在初始篩選中鑒定的前導(dǎo)化合物可用于擴(kuò)大篩選的化合物列表從而鑒定高活性化合物。基于抗體的結(jié)合劑尤其優(yōu)選的hsp-90β結(jié)合劑是抗hsp-90β抗體或其抗原結(jié)合片段或其衍生物/變體(天然存在或重組的，來(lái)自任何來(lái)源)。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”指這樣的免疫球蛋白分子，其能夠通過(guò)至少一個(gè)位于免疫球蛋白分子可變區(qū)的表位識(shí)別位點(diǎn)來(lái)結(jié)合靶標(biāo)，例如hsp-90β和/或其表位和/或其免疫原性片段和/或其修飾形式(例如糖基化、糖基化等)。該術(shù)語(yǔ)不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，而且包括變體、包含具有所需特異性的表位識(shí)別位點(diǎn)的抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、人抗體、嵌合抗體以及包含所需特異性的表位識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構(gòu)型。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體結(jié)合片段”旨在表示抗體的任何片段，其保留結(jié)合hsp-90β的能力，優(yōu)選特異性結(jié)合hsp-90β的能力。這包括：(1)fab，含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的片段，可以通過(guò)以下方式制備：用木瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體以產(chǎn)生完整的輕鏈和一條重鏈的一部分；(2)fab'，抗體分子的片段，可以通過(guò)以下方式獲得：用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體，然后還原，以產(chǎn)生完整的輕鏈和重鏈的一部分；每個(gè)抗體分子獲得兩個(gè)fab'片段；(3)(fab')2，抗體的片段，可以通過(guò)以下方式獲得：用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體，沒(méi)有后續(xù)的還原；f(ab)2是通過(guò)兩條二硫鍵結(jié)合在一起的兩個(gè)fab'片段的二聚體；(4)fv，定義為基因工程片段，其含有表達(dá)為兩條鏈的輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)；和(5)單鏈抗體(“sca”)，定義為基因工程分子，其含有輕鏈的可變區(qū)、重鏈的可變區(qū)，通過(guò)合適的多肽連接物(linker)連結(jié)為遺傳融合的單鏈分子。(6)單結(jié)構(gòu)域抗體，優(yōu)選不含輕鏈的可變重鏈結(jié)構(gòu)域。制備這些片段的方法是本領(lǐng)域已知的。(參見(jiàn)，例如，harlowandlane,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharbourlaboratory,newyork(1988)，其通過(guò)引用并入本文)。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指能夠結(jié)合相同抗原并優(yōu)選地結(jié)合抗原內(nèi)相同表位決定簇的同質(zhì)性抗體群。該術(shù)語(yǔ)不意圖限制限制抗體的來(lái)源或其制備方式。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指這樣的抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種(例如鼠，如小鼠)或者屬于特定抗體種類(lèi)或亞類(lèi)的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分與源自另一物種(例如靈長(zhǎng)類(lèi)，如人)或者屬于另一抗體種類(lèi)或亞類(lèi)的抗體的相應(yīng)序列相同或者同源；以及這樣的抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專(zhuān)利4,816,567號(hào)；和morrisonetal.(1984)proc.natlacad.sciusa81:6851-6855)。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”應(yīng)當(dāng)理解為表示嵌合分子，其通常使用重組技術(shù)制備，具有源自非人物種的免疫球蛋白的表位結(jié)合位點(diǎn)，并且分子的剩余免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基于人免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列?？乖Y(jié)合位點(diǎn)優(yōu)選包含來(lái)自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，其移植到人抗體的可變結(jié)構(gòu)域中合適的框架區(qū)上；并且剩余區(qū)域來(lái)自人抗體。表位結(jié)合位點(diǎn)可以是野生型或由一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代修飾。已知重鏈和輕鏈的可變區(qū)均含有3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，其根據(jù)所關(guān)注表位而變化，并決定結(jié)合能力；側(cè)翼是4個(gè)框架區(qū)(fr)，其在指定物種中是相對(duì)保守的，據(jù)推測(cè)為cdr提供支架。當(dāng)根據(jù)特定表位制備非人抗體時(shí)，可以將可變區(qū)“重塑(reshape)”或“人源化”，這通過(guò)將源自非人抗體的cdr移植到存在于待修飾人抗體的fr上進(jìn)行。這種方法的應(yīng)用是本領(lǐng)域已知的，和/或在本文中更詳細(xì)地描述。本文使用的術(shù)語(yǔ)恒定區(qū)(cr)指提供效應(yīng)物功能的抗體分子的部分。受試者人源化抗體的恒定區(qū)源自人免疫球蛋白。重鏈恒定區(qū)可以選自5種同種型中的任意種：α、δ、ε、γ或μ。此外，各種亞類(lèi)(諸如重鏈的igg亞類(lèi))的重鏈負(fù)責(zé)不同的效應(yīng)物功能，因此通過(guò)選擇期望的重鏈恒定區(qū)可以產(chǎn)生具有期望的效應(yīng)物功能的抗體。優(yōu)選的重鏈恒定區(qū)是γ1(igg1)、γ2(igg2)、γ3(igg3)和γ4(igg4)。輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ型，優(yōu)選κ型?！翱蚣軈^(qū)”是除了cdr殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。天然存在抗體的每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域通常具有4個(gè)fr，經(jīng)鑒定為fr1、fr2、fr3和fr4。如果根據(jù)kabat確定cdr，則輕鏈fr殘基位于約殘基1-23(lcfr1)、35-49或40-54(lcfr2)、57-88或62-93(lcfr3)以及98-107或103-112(lcfr4)；重鏈fr殘基位于重鏈殘基中約殘基1-30或1-30(hcfr1)、36-49(hcfr2)、66-94或67-96(hcfr3)以及103-113或109-119(hcfr4)。如果cdr包含來(lái)自高變環(huán)的氨基酸殘基，則輕鏈fr殘基位于輕鏈中約殘基1-25(lcfr1)、33-49(lcfr2)、53-90(lcfr3)以及97-107(lcfr4)；重鏈fr殘基位于重鏈殘基中約殘基1-25(hcfr1)、33-52(hcfr2)、56-95(hcfr3)以及102-113(hcfr4)。在一些情況下，當(dāng)cdr包含來(lái)自kabat所確定的cdr的氨基酸和高變環(huán)的氨基酸時(shí)，fr殘基將相應(yīng)調(diào)整。技術(shù)人員會(huì)清楚在fr定位的一些變化，例如作為突變(例如缺失和/或插入)的結(jié)果，例如多達(dá)5個(gè)殘基變化、或4個(gè)殘基變化、或2個(gè)殘基變化、或1個(gè)殘基變化(例如，本文所示例的抗體)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)決定區(qū)”(同義詞cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)指抗體可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基，其存在是抗原結(jié)合必需的。每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域通常具有3個(gè)cdr區(qū)，稱(chēng)為cdr1、cdr2和cdr3。每個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)可以包含來(lái)自kabat確定的“互補(bǔ)決定區(qū)”的氨基酸殘基(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的約殘基24-34或24-39(l1)、50-56或55-61(l2)和89-97或93-102(l3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35或26-35(h1)、50-65或50-66(h2)和95-102或97-108(h3)；kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))和/或來(lái)自“高變環(huán)”的那些殘基，即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的約殘基26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)；chothiaandlesk(1987)j.molbiol.196:901-917)。在一些情況下，互補(bǔ)決定區(qū)可以包含kabat確定的cdr區(qū)和高變環(huán)的氨基酸。技術(shù)人員會(huì)清楚在fr定位的一些變化，例如作為突變(例如缺失和/或插入)的結(jié)果，例如，多達(dá)5個(gè)殘基變化、或4個(gè)殘基變化、或2個(gè)殘基變化、或1個(gè)殘基變異(例如，本文所示例的抗體)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“衍生物”旨在表示包含一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸取代的抗hsp-90β抗體或其抗原結(jié)合片段。術(shù)語(yǔ)“保守取代”應(yīng)當(dāng)表示表1所述的氨基酸取代。表1.示例性取代原始?xì)埢纠匀〈鷄la(a)val；leu；ile；glyarg(r)lysasn(n)gln；hisasp(d)glucys(c)sergln(q)asn；hisglu(e)aspgly(g)pro,alahis(h)asn；glnile(i)leu；val；alaleu(l)ile；val；met；ala；phelys(k)argmet(m)leu；phephe(f)leu；val；alapro(p)glyser(s)thrthr(t)sertrp(w)tyrtyr(y)trp；pheval(v)ile；leu；met；phe；ala術(shù)語(yǔ)“保守取代”還包括具有類(lèi)似親水指數(shù)或分?jǐn)?shù)的氨基酸取代。每種氨基酸基于它們的疏水性和電荷特性而分配了親水指數(shù)：異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴(lài)氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在進(jìn)行基于親水指數(shù)的變化時(shí)，親水指數(shù)在+/-0.2以?xún)?nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的。更優(yōu)選地，取代包括親水指數(shù)在+/-0.1以?xún)?nèi)的氨基酸，更優(yōu)選在約+/-0.05以?xún)?nèi)。術(shù)語(yǔ)“保守氨基酸取代”還包括基于親水性制備的類(lèi)似氨基酸的取代，尤其是由此產(chǎn)生的生物學(xué)功能等同的蛋白或肽預(yù)期用于免疫實(shí)施方案，就如目前的情況。例如，取決于鄰近氨基酸的親水性的蛋白最大的局部平均親水性與其免疫原性和抗原性有關(guān)。如美國(guó)專(zhuān)利4,554,101號(hào)所詳述，下列親水值已經(jīng)分配給氨基酸殘基：精氨酸(+3.0)；賴(lài)氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+/-0.1)；谷氨酸(+3.0+/-0.1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+/-0.1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于類(lèi)似的親水值進(jìn)行變化時(shí)，優(yōu)選地，取代的氨基酸具有彼此在約+/-0.2以?xún)?nèi)的親水值，更優(yōu)選在約+/-0.1以?xún)?nèi)，甚至更優(yōu)選在+/-0.05以?xún)?nèi)。當(dāng)涉及本發(fā)明的氨基酸序列和/或用于本發(fā)明時(shí)，術(shù)語(yǔ)“衍生物”包括對(duì)序列的一個(gè)(或多個(gè))氨基酸的任何取代、變化、修飾、替換、缺失或添加，只要所得的氨基酸序列優(yōu)選具有天然存在的hsp-90β至少50％的生物學(xué)活性，更優(yōu)選至少基本上相同的活性。本文使用的術(shù)語(yǔ)“衍生物”還包括與抗體或抗原結(jié)合片段直接或間接連接的其他組分。例如，衍生物包括增強(qiáng)或增加抗體在體內(nèi)的半衰期的化合物，例如聚乙二醇或白蛋白。在另一實(shí)例中，衍生物還包括可檢測(cè)的化合物，例如熒光化合物或放射性化合物或酶，例如以促進(jìn)檢測(cè)和/或成像。在另一實(shí)例中，衍生物還包括毒性化合物，例如放射性化合物或細(xì)胞毒素。重組產(chǎn)生抗體的方法是本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。這類(lèi)技術(shù)在貫穿以下的文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述和解釋?zhuān)鏹.perbal,apracticalguidetomolecularcloning,johnwileyandsons(1984),j.sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharbourlaboratorypress(1989),t.a.brown(editor),essentialmolecularbiology:apracticalapproach,volumes1and2,irlpress(1991)?？梢岳帽磉_(dá)全長(zhǎng)hsp-90β或其片段的細(xì)胞作為免疫抗原來(lái)制備本發(fā)明的抗體。用于免疫動(dòng)物的肽可以源自翻譯的cdna或化學(xué)合成，并且如果需要將其純化并偶聯(lián)至載體蛋白。這類(lèi)常用的與肽化學(xué)偶聯(lián)的載體包括鑰孔血藍(lán)蛋白(klh)、甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白(bsa)和破傷風(fēng)毒素。然后可以將偶聯(lián)的肽用于免疫動(dòng)物(例如小鼠或兔)。如果需要，可以將多克隆抗體進(jìn)一步純化，例如通過(guò)與基質(zhì)結(jié)合并洗脫，激發(fā)抗體的肽與該基質(zhì)結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚免疫學(xué)領(lǐng)域用于純化和/或濃縮多克隆抗體以及單克隆抗體的各種常用技術(shù)(參見(jiàn)例如coligan,etal.,unit9,currentprotocolsinimmunology,wileyinterscience,1991，其通過(guò)引用并入本文)。單克隆抗體可以利用任何技術(shù)制備，所述技術(shù)通過(guò)培養(yǎng)連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子，例如雜交瘤技術(shù)、人b細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和ebv-雜交瘤技術(shù)(kohleretal.,1975；kozboretal.,1985；coteetal.,1983；coleetal.,1984)。本領(lǐng)域已知的方法還允許從抗體表達(dá)文庫(kù)鑒定和分離表現(xiàn)出結(jié)合hsp-90β的抗體。具有與mabstro-4相同或類(lèi)似的表位特異性的抗體可以通過(guò)它們與該特定mab競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合hsp-90β(例如結(jié)合帶有hsp-90β的細(xì)胞，如mpc；或結(jié)合分離的hsp-90蛋白或其片段)的能力進(jìn)行鑒定。利用受體嵌合體(ruckeretal.,1996)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他技術(shù)可以對(duì)stro-4mab的結(jié)合位點(diǎn)定位。無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)還可以確定單克隆抗體是否與stro-4mab具有相同的特異性，這通過(guò)確定前者是否阻止后者結(jié)合hsp-90β進(jìn)行。如stro-4mab結(jié)合的降低所示，如果測(cè)試的單克隆抗體與stro-4mab競(jìng)爭(zhēng)，則兩種單克隆抗體結(jié)合相同或密切相關(guān)的表位。另一種確定單克隆抗體是否具有stro-4mab的特異性的方法是將待檢測(cè)的單克隆抗體用hsp-90β預(yù)孵育，然后添加stro-4mab以確定stro-4mab結(jié)合hsp-90β的能力是否被抑制。如果stro-4mab的結(jié)合被抑制，則很可能被檢測(cè)的單克隆抗體具有與stro-4mab相同或功能等同的表位特異性?？梢詫⒈景l(fā)明使用的單克隆抗體改造以改變抗體的同種型。例如，可以將igg2a同種型改造為igg1，igg2b或其他同種型。應(yīng)理解可以將諸如本發(fā)明的抗體的hsp-90β結(jié)合劑與可用于例如細(xì)胞分離、治療或診斷應(yīng)用的化合物偶聯(lián)。在一實(shí)例中，將本發(fā)明的抗體與標(biāo)記偶聯(lián)。標(biāo)記可以是其存在可以方便地檢測(cè)的任何實(shí)體。例如，標(biāo)記可以是直接標(biāo)記，例如詳細(xì)描述于mayetal.的美國(guó)專(zhuān)利5,656,503號(hào)中的那些標(biāo)記。直接標(biāo)記包括但不限于在天然狀態(tài)可以通過(guò)肉眼方便地看到或借助于濾光器和/或施加的刺激如uv光以激發(fā)熒光的實(shí)體。實(shí)例包括放射性化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、電活性化合物(如氧化還原標(biāo)記)和熒光化合物。直接顆粒標(biāo)記如染料溶膠、金屬溶膠(如金)和有色膠乳顆粒也是非常適合的，并且與熒光化合物一起都是優(yōu)選的。在這些選擇中，有色膠乳顆粒和熒光化合物是最優(yōu)選的。將標(biāo)記濃縮到小區(qū)域或體積中應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生容易檢測(cè)的信號(hào)，例如強(qiáng)著色區(qū)域。也可以使用間接標(biāo)記，例如酶，如堿性磷酸酶和辣根過(guò)氧化物酶，盡管這些間接標(biāo)記通常需要在可以檢測(cè)可見(jiàn)信號(hào)之前添加一種或多種顯影劑，如底物。標(biāo)記與諸如本發(fā)明抗體的結(jié)合劑的偶聯(lián)可以通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)(包括疏水)鍵合，或通過(guò)吸附。用于這類(lèi)偶聯(lián)的技術(shù)是本領(lǐng)域常見(jiàn)的，并且可以輕易地適應(yīng)于使用的具體試劑。諸如本發(fā)明抗體的用于本發(fā)明方法的結(jié)合劑也可以包被在固體支持物上。例如，抗體可以包被在合成塑料材料、磁性顆粒、微量滴定測(cè)定板、微陣列芯片、膠乳珠、包含纖維素或合成聚合材料的濾器、玻璃或塑料載片、浸量尺、毛細(xì)管裝填裝置等?？梢詫sp-90β結(jié)合劑與固體支持物連接以允許粗分離。分離技術(shù)優(yōu)選的最大程度保留待收集組分的活性?？梢允褂貌煌实母鞣N技術(shù)來(lái)獲得較粗的分離。使用的具體技術(shù)取決于分離效率、相關(guān)細(xì)胞毒性、表現(xiàn)的易用性和速度以及先進(jìn)設(shè)備和/或?qū)ｉT(mén)技能的需求。用于分離的方法可以包括但不限于磁力分離、使用包被抗體的磁珠、親和力層析和利用連接到固體基質(zhì)的抗體的“淘選(panning)”。提供精確分離的技術(shù)包括但不限于macs、dynal磁珠選擇和facs。細(xì)胞分選技術(shù)用諸如抗hsp-90β抗體的hsp-90β結(jié)合劑識(shí)別間充質(zhì)前體細(xì)胞的能力不僅允許組織樣品中這些細(xì)胞的鑒定和定量，而且允許它們?cè)趹乙褐械姆蛛x和富集。這可以通過(guò)多種細(xì)胞分選技術(shù)實(shí)現(xiàn)，通過(guò)所述技術(shù)細(xì)胞根據(jù)與細(xì)胞抗體復(fù)合物或連接到抗體上的標(biāo)記有關(guān)的特性而被物理分離。該標(biāo)記可以是磁性顆?；驘晒夥肿??？贵w可以被這樣交聯(lián)：它們形成多細(xì)胞的聚集物，其可以通過(guò)它們的密度進(jìn)行分離?？蛇x地，抗體可以連接到固定的基質(zhì)，期望的細(xì)胞與該基質(zhì)粘附。從未結(jié)合的細(xì)胞分離抗體結(jié)合的細(xì)胞的各種方法是已知的。例如，可以標(biāo)記結(jié)合到細(xì)胞的抗體(或抗同種型抗體)，然后通過(guò)檢測(cè)所述標(biāo)記存在的機(jī)械細(xì)胞分選儀來(lái)分離細(xì)胞。熒光激活細(xì)胞分選儀是本領(lǐng)域公知的。在一實(shí)施方案中，抗hsp-90β抗體連接到固體支持物。各種固體支持物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纖維膜、聚合物和塑料培養(yǎng)皿?？梢酝ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單地從細(xì)胞懸液物理分離固體支持物來(lái)從細(xì)胞懸液中去除抗體所結(jié)合的細(xì)胞。超順磁微?？捎糜诩?xì)胞分離。例如，微?？梢杂每筯sp-90β抗體包被。然后將抗體標(biāo)記的超順磁微粒用含有所關(guān)注的細(xì)胞的溶液孵育。微粒結(jié)合期望的多潛能細(xì)胞的表面，然后可以在磁場(chǎng)中收集這些細(xì)胞。在另一實(shí)例中，使細(xì)胞樣品與例如固相連結(jié)的抗hsp-90β單克隆抗體物理接觸。固相連結(jié)可以包括，例如將抗體吸附到塑料、硝酸纖維素或其他表面。抗體還可以吸附到中空纖維膜的大孔(大到足以允許細(xì)胞流過(guò))壁?？蛇x地，抗體可以共價(jià)連接到表面或珠，例如pharmaciasepharose6mb大珠(macrobead)。用含有多潛能細(xì)胞的懸液孵育固相連結(jié)的抗體的精確條件和持續(xù)時(shí)間取決于對(duì)所用系統(tǒng)特定的幾種因素。但是，合適條件的選擇在本領(lǐng)域是公知的。在允許多潛能細(xì)胞結(jié)合足夠時(shí)間之后，用生理緩沖液洗脫或洗去未結(jié)合的細(xì)胞。在進(jìn)行合適的測(cè)試以確保實(shí)現(xiàn)期望的分離后，可以回收未結(jié)合的細(xì)胞并用于其他目的或丟棄。然后用任何合適的方法從固相分離結(jié)合的細(xì)胞，這主要取決于固相和抗體的特性。例如，可以通過(guò)劇烈攪拌從塑料培養(yǎng)皿洗脫結(jié)合的細(xì)胞?？蛇x地，可以通過(guò)酶促“切口(nicking)”或消化固相和抗體之間的酶敏感性“間隔子(spacer)”序列來(lái)洗脫結(jié)合的細(xì)胞。結(jié)合瓊脂糖珠的間隔子可以從例如pharmacia商購(gòu)。然后通過(guò)離心用緩沖液洗滌細(xì)胞的洗脫、富集組分，并根據(jù)常規(guī)技術(shù)將所述富集組分或未結(jié)合的組分低溫保存為成活狀態(tài)以備后用或?qū)胍浦彩荏w。多潛能細(xì)胞的分化本發(fā)明多潛能細(xì)胞向骨前體細(xì)胞或骨的偏向分化的條件可以包括例如在補(bǔ)充了10％fcs、100μml-抗壞血酸-2-磷酸酯、地塞米松10-7m和3mm無(wú)機(jī)磷酸鹽的αmem中培養(yǎng)。這些條件已經(jīng)證實(shí)在體外誘導(dǎo)人骨髓基質(zhì)細(xì)胞發(fā)展為礦化的骨基質(zhì)(gronthosetal.,1994)。用于將本發(fā)明的多潛能細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的合適條件可以包括在存在i型膠原蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、骨鈣蛋白或骨粘連蛋白的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在一具體實(shí)例中，在存在i型膠原蛋白、纖維蛋白原和纖維蛋白的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在替代性實(shí)例中，在存在i型膠原蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白、骨鈣蛋白和骨粘連蛋白的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在這種方法的背景下，i型膠原蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、骨鈣蛋白或骨粘連蛋白可以單獨(dú)使用或在生長(zhǎng)因子的存在下使用。應(yīng)理解本段中上文所列化合物的任何組合都是本發(fā)明所預(yù)期的。遺傳修飾的細(xì)胞的產(chǎn)生在一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及遺傳修飾的細(xì)胞，尤其是遺傳修飾的本發(fā)明的多潛能細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾以產(chǎn)生異源蛋白。通常，細(xì)胞經(jīng)這樣的遺傳修飾：從細(xì)胞分泌異源蛋白。異源蛋白可以是任何所關(guān)注的蛋白。例如，異源蛋白可以是血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子(pdgf)、腫瘤壞死因子α(tnf-α)、白介素-1β(il-1β)和基質(zhì)來(lái)源的因子1α(sdf-1α)。在另一實(shí)例中，異源蛋白是生物活性因子，其加速多潛能細(xì)胞向特定組織類(lèi)型的分化。生物活性因子可以是例如合成糖皮質(zhì)激素或骨形態(tài)發(fā)生蛋白，如bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-6或bmp-7。在一實(shí)施方案中，細(xì)胞可以經(jīng)修飾以表達(dá)功能性非蛋白編碼多核苷酸，如dsrna(通常用于rna沉默)、反義寡核苷酸或催化性核酸(如核酶或dna核酶)。遺傳修飾的細(xì)胞可以在存在足以支持該修飾的細(xì)胞生長(zhǎng)的量的至少一種細(xì)胞因子的條件下培養(yǎng)。因此，獲得的遺傳修飾的細(xì)胞可以立即使用(例如，用于移植)、培養(yǎng)和體外擴(kuò)增或者保存以備用。修飾的細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法保存，例如在液氮中凍存。本文使用的遺傳修飾包括任何遺傳修飾方法，其包括將外源或外來(lái)多核苷酸引入多潛能細(xì)胞或者多潛能細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源基因的修飾。遺傳修飾包括但不限于轉(zhuǎn)導(dǎo)(病毒介導(dǎo)的宿主dna從宿主或供體轉(zhuǎn)移到受體，體外或體內(nèi))、轉(zhuǎn)染(用分離的病毒dna基因組轉(zhuǎn)化細(xì)胞)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、電穿孔、磷酸鈣轉(zhuǎn)染或共沉淀等。轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法包括將細(xì)胞用生產(chǎn)者細(xì)胞直接共培養(yǎng)(bregnietal.,1992)或者在有或沒(méi)有合適生長(zhǎng)因子和聚陽(yáng)離子的條件下用單獨(dú)的病毒上清培養(yǎng)細(xì)胞(xuetal.,1994)。外源多核苷酸優(yōu)選通過(guò)載體引入宿主細(xì)胞。載體優(yōu)選包含插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元件。用于構(gòu)建這類(lèi)載體的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，用于構(gòu)建合適表達(dá)載體的技術(shù)詳細(xì)描述于sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborpress,n.y.(3rded.,2000)和ausubeletal.,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,inc.,newyork(1999)。載體可以包括但不限于病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒和單純皰疹病毒；粘粒；質(zhì)粒載體；合成載體；以及通常用于本領(lǐng)域的其他重組媒介物。這樣的載體是本領(lǐng)域公知的，其含有啟動(dòng)子和可以將多核苷酸可操作連接進(jìn)入的克隆位點(diǎn)。這類(lèi)載體能夠在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄rna，并且可以從諸如stratagene(lajolla,calif.)和promegabiotech(madison,wis.)的來(lái)源商購(gòu)。具體實(shí)例包括stratagene的psg、psv2cat、pxtl；及pharmacia的pmsg、psvl、pbpv和psvk3。優(yōu)選的載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見(jiàn)coffinetal.,"retroviruses",chapter9pp；437-473,coldspringsharborlaboratorypress,1997)。可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法重組產(chǎn)生用于本發(fā)明的載體。例如wo94/29438、wo97/21824和wo97/21825描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝質(zhì)粒和包裝細(xì)胞系的構(gòu)建。示例性載體包括pcmv哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，如pcmv6b和pcmv6c(chironcorp.)、psffv-neo和pbluescript-sk+。有用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的非限制性實(shí)例是源自鼠、禽或靈長(zhǎng)類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒的那些載體。常見(jiàn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括基于莫洛尼鼠白血病病毒的那些載體(momlv-載體)。其他momlv來(lái)源的載體包括lmily、lingfer、mingfr和mint。其他載體包括基于長(zhǎng)臂猿白血病病毒(galv)和莫洛尼鼠肉瘤病毒(momsv)和脾灶形成病毒(spleenfocusformingvirus，sffv)的那些載體。源自鼠干細(xì)胞病毒(mesv)的載體包括mesv-mily。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還包括基于慢病毒的載體，非限制性實(shí)例包括基于人免疫缺陷病毒(hiv-1和hiv-2)的載體。在產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體時(shí)，病毒的gag、pol和env序列可以從病毒去除，從而為插入外源dna序列提供空間。外源dna編碼的基因通常在位于長(zhǎng)末端重復(fù)序列(ltr)中的強(qiáng)病毒啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行表達(dá)。合適的控制調(diào)節(jié)序列的選擇取決于使用的宿主細(xì)胞，并且該選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。除了ltr的啟動(dòng)子外，許多啟動(dòng)子也是已知的。非限制性實(shí)例包括噬菌體λpl啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒(cmv)立即早期啟動(dòng)子；莫洛尼鼠肉瘤病毒(mmsv)、勞斯肉瘤病毒(rsv)或脾灶形成病毒(sffv)的u3區(qū)啟動(dòng)子；粒酶a啟動(dòng)子；以及粒酶b啟動(dòng)子。此外，可以使用誘導(dǎo)型或多重控制元件。合適啟動(dòng)子的選擇對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。如果包裝細(xì)胞系反式提供gag、pol和env功能，則這類(lèi)構(gòu)建體可以有效地包裝入病毒顆粒。因此，當(dāng)將載體構(gòu)建體引入包裝細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生的gag-pol和env蛋白與載體rna組裝以產(chǎn)生感染性的病毒體(viron)，其被分泌入培養(yǎng)基。由此產(chǎn)生的病毒可以感染并整合入靶細(xì)胞的dna，但不產(chǎn)生感染性病毒顆粒，因?yàn)樗狈Ρ匾陌b序列。目前使用的大部分包裝細(xì)胞系轉(zhuǎn)染了分離的質(zhì)粒，每種質(zhì)粒均含有必要的編碼序列之一，從而在產(chǎn)生可復(fù)制的病毒之前，多重重組事件是必需的?？蛇x地，包裝細(xì)胞系載有原病毒。原病毒是殘缺的，從而盡管它可以產(chǎn)生組裝感染性病毒所需的全部蛋白，但其自身的rna不能包裝入病毒。取而代之的是包裝由重組病毒產(chǎn)生的rna。因此，從包裝細(xì)胞釋放的病毒儲(chǔ)液(stock)僅含有重組病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系的非限制性實(shí)例包括pa12、pa317、pe501、pg13、psi.crip、rdi14、gp7c-tta-g10、propak-a(ppa-6)和pt67。參考milleretal.,1986、danosetal.,1988、pearetal.,1993和fineretal.,1994。其他合適的載體包括腺病毒載體(參見(jiàn)freyetal.,1998和wo95/27071)和腺相關(guān)病毒載體。這些載體是本領(lǐng)域公知的，例如描述于chatterjeeetal.,1996和stemcellbiologyandgenetherapy,eds.quesenberryetal.,johnwiley&sons,1998和美國(guó)專(zhuān)利5,693,531號(hào)及5,691,176號(hào)。腺病毒來(lái)源的載體的使用在某些情況下可能是有益的，因?yàn)樗鼈儾荒軌蚋腥静环至训募?xì)胞。與逆轉(zhuǎn)錄病毒dna不同，腺病毒dna不整合入靶細(xì)胞的基因組。此外，腺病毒載體比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有大得多的外源dna攜帶能力。腺相關(guān)病毒載體是另一種有用的遞送系統(tǒng)。這種病毒的dna可以整合入不分裂的細(xì)胞，并且用腺相關(guān)病毒載體已經(jīng)將多種多核苷酸成功地引入不同的細(xì)胞類(lèi)型。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體或載體包含兩種或更多種異源多核苷酸序列。優(yōu)選地，額外的核酸序列是編碼選擇性標(biāo)記物、結(jié)構(gòu)基因、治療基因或細(xì)胞因子/趨化因子基因的多核苷酸。構(gòu)建體或載體可以包含選擇性標(biāo)記物以監(jiān)測(cè)成功的遺傳修飾和選擇已經(jīng)整合dna的細(xì)胞。非限制性實(shí)例包括抗藥性標(biāo)記物，如g418(硫酸新霉素)或潮霉素。此外可以使用陰性選擇，例如其中標(biāo)記物是hsv-tk基因。該基因使得細(xì)胞對(duì)諸如無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷和更昔洛韋(gancyclovir)的試劑敏感。neor(新霉素/g418抗性)基因是常用的，但是可以使用基因序列不存在于靶細(xì)胞中的任何方便的標(biāo)記基因。其他非限制性實(shí)例包括低親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngfr)、增強(qiáng)的熒光綠色蛋白(efgp)、二氫葉酸還原酶基因(dhfr)、細(xì)菌hisd基因、鼠cd24(hsa)、鼠cd8a(lyt)、賦予對(duì)嘌呤霉素或腐草霉素抗性的細(xì)菌基因以及β-半乳糖苷酶(glactosidase)。額外的多核苷酸序列可以通過(guò)相同載體引入宿主細(xì)胞，或者可以通過(guò)第二載體引入宿主細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇性標(biāo)記物與多核苷酸包含在相同載體中。本發(fā)明還包括這樣遺傳修飾內(nèi)源基因的啟動(dòng)子區(qū)：與野生型多潛能細(xì)胞相比，使內(nèi)源基因的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致編碼蛋白的產(chǎn)生增加。富集的多潛能細(xì)胞組合物的用途對(duì)于各種治療目的，期望諸如mpc的多潛能細(xì)胞的富集。這些目的包括缺失或損傷骨骼組織的再生，增強(qiáng)各種塑料或金屬假器官裝置的移植，這些目的通過(guò)將分離或培養(yǎng)擴(kuò)增的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞附著到假器官裝置的多孔表面進(jìn)行，這在骨髓來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞激活和后續(xù)分化時(shí)產(chǎn)生天然骨橋。培養(yǎng)的間充質(zhì)細(xì)胞的復(fù)合移植物可以用于提高骨髓移植期間造血細(xì)胞儲(chǔ)備的速率?？梢酝ㄟ^(guò)培養(yǎng)的從本發(fā)明多潛能細(xì)胞擴(kuò)增的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞修復(fù)的一類(lèi)缺陷是骨中嚴(yán)重的骨骼缺陷類(lèi)型，這由損傷引起或感染腫瘤的骨的大面積切除產(chǎn)生。在正常情況下，這類(lèi)缺陷不會(huì)痊愈，并產(chǎn)生不結(jié)合的骨。可以通過(guò)在缺陷部位植入包含在磷酸鈣陶瓷媒介物中的培養(yǎng)的間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)治療這類(lèi)缺陷?？梢酝ㄟ^(guò)培養(yǎng)的從本發(fā)明多潛能細(xì)胞擴(kuò)增的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞修復(fù)的另一類(lèi)缺陷是損傷的關(guān)節(jié)軟骨，這由創(chuàng)傷或由諸如骨關(guān)節(jié)炎和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病產(chǎn)生?？梢栽诶绻切纬珊托迯?fù)中使用根據(jù)本發(fā)明獲得的多潛能細(xì)胞的富集或擴(kuò)增的細(xì)胞群，因此可以在需要骨形成的部位引入多潛能細(xì)胞以及合適支持物的組合。因此，例如可以通過(guò)在缺陷部位植入包含在磷酸鈣陶瓷媒介物中的培養(yǎng)或擴(kuò)增的多潛能細(xì)胞來(lái)修復(fù)由骨損傷或滲透了腫瘤的骨部分的切除引起的骨骼缺陷。合適的方法和技術(shù)參見(jiàn)caplanetal.，美國(guó)專(zhuān)利5,226,914和美國(guó)專(zhuān)利5,837,539，與本發(fā)明相比，這兩者都使用干細(xì)胞的粗制品。此外，富集的細(xì)胞群或組合物可用于輔助錨定假器官裝置。因此，在移植前，可以在諸如用于臀、膝和肩置換的那些假器官裝置的表面包被富集的多潛能細(xì)胞。多潛能細(xì)胞然后可以分化為生骨細(xì)胞，從而加速骨向內(nèi)生長(zhǎng)的過(guò)程和假器官裝置的并入(參見(jiàn)caplanetal.的美國(guó)專(zhuān)利5,226,914和美國(guó)專(zhuān)利5,837,539)。富集的細(xì)胞群或組合物還可以用于基因療法，從而例如，富集的細(xì)胞群可以具有轉(zhuǎn)化入其中的外源核酸，然后將這類(lèi)細(xì)胞群引入患者體內(nèi)以治療疾病或疾病狀況?？蛇x地，它可以用于治療劑的釋放。關(guān)于合適的技術(shù)，我們參考gersonetal.的美國(guó)專(zhuān)利5,591,625，與本發(fā)明相比，其使用干細(xì)胞的粗制品。可選地，富集的細(xì)胞群或組合物可以用于增強(qiáng)骨髓移植，其中在引入全骨髓前，可以將含有富集的多潛能細(xì)胞的組合物注射入經(jīng)歷骨髓移植的患者。采用這種方式，可以提高血生成的速率，尤其是在放射或化療之后。組合物還可以包含多潛能細(xì)胞和造血細(xì)胞的混合物，其可用于放療或化療。細(xì)胞組合物本發(fā)明的細(xì)胞組合物如包含諸如mpc的多潛能細(xì)胞那些組合物，可以用于各種類(lèi)型組織的再生，包括骨、軟骨、腱、韌帶、肌肉、皮膚和其他結(jié)締組織以及神經(jīng)、心臟、肝、肺、腎、胰、腦和其他器官組織。本文使用的“藥學(xué)可接受的載體”或“賦形劑”包括但不限于生理上相容的任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。在一實(shí)施方式中，載體適合于腸胃外給藥?？蛇x地，載體適合于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、舌下或口服給藥。藥學(xué)可接受的載體包括無(wú)菌水溶液或分散劑以及用于無(wú)菌注射溶液或分散劑的臨用前制備的無(wú)菌粉劑。用于藥學(xué)活性物質(zhì)的這類(lèi)介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域公知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，其在本發(fā)明的藥物組合物中的使用都是預(yù)期的。所述組合物中還可以并入輔助活性化合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以聯(lián)合合適的基質(zhì)一起給藥，例如，用于支持細(xì)胞并為骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)、表皮和/或其他結(jié)締組織的生長(zhǎng)提供表面?；|(zhì)可以是傳統(tǒng)基質(zhì)生物材料的形式?；|(zhì)可以提供細(xì)胞的緩釋和/或?yàn)槠浯嬖谔峁┖线m的環(huán)境。在一些實(shí)施方案中，多種膠原和非膠原蛋白預(yù)期上調(diào)并從細(xì)胞分泌。這種現(xiàn)象通過(guò)增強(qiáng)基質(zhì)沉積來(lái)加速組織再生?；|(zhì)蛋白也可以在遺傳改造的細(xì)胞中表達(dá)，并且增強(qiáng)移植的細(xì)胞在移植區(qū)域的植入和附著。本發(fā)明的細(xì)胞組合物可以單獨(dú)給藥或作為與其他細(xì)胞的混合物給藥?？梢耘c本發(fā)明的組合物聯(lián)合給予的細(xì)胞包括但不限于其他多潛能或多能性細(xì)胞或軟骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨襯細(xì)胞、干細(xì)胞或骨髓細(xì)胞。不同類(lèi)型的細(xì)胞可以在給藥前立即或給藥前不久與本發(fā)明的組合物混合，或在給藥前將它們共培養(yǎng)一段時(shí)間。本發(fā)明的細(xì)胞組合物可以與其他有益的藥物或生物分子(生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子)一起給藥。當(dāng)多潛能細(xì)胞與其他試劑一起給藥時(shí)，它們可以在單一藥物組合物中一起給藥，或在分離的藥物組合物中與其他試劑同時(shí)或順序給藥(在給予其他試劑之前或之后)?？梢怨步o予的生物活性因子包括抗凋亡劑(如epo、epo模擬體(mimetibody)、tpo、igf-i和igf-ii、hgf、胱天蛋白酶抑制劑)；抗炎劑(如p38mapk抑制劑、tgf-β抑制劑、抑制素、il-6和il-1抑制劑、吡嘧司特、曲尼司特、remicade、西羅莫司和nsaid(非甾體類(lèi)抗炎藥；例如替泊沙林、托美丁、舒洛芬)；免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)劑(如鈣依賴(lài)磷酸酶抑制劑，如環(huán)孢素、他克莫司；mtor抑制劑(如西羅莫司、依維莫司)；抗增殖劑(如硫唑嘌呤、麥考酚酸酯)；糖皮質(zhì)激素(如潑尼松龍、氫化可的松)；抗體，如單克隆抗il-2rα受體抗體(如巴利昔單抗、達(dá)克珠單抗)、多克隆抗t細(xì)胞抗體(如抗胸腺細(xì)胞球蛋白(atg)；抗淋巴細(xì)胞球蛋白(alg)；單克隆抗t細(xì)胞抗體okt3))；抗血栓形成劑(如肝素、肝素衍生物、尿激酶、ppack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受體拮抗劑、抗凝血酶抗體、抗血小板受體抗體、阿司匹林、雙嘧達(dá)莫、魚(yú)精蛋白、蛭素、前列腺素抑制劑和血小板抑制劑)；和抗氧化劑(如普羅布考、維生素a、抗壞血酸、生育酚、輔酶q-10、谷胱甘肽、l-半胱氨酸、n-乙酰半胱氨酸)以及局部麻醉劑。作為另一實(shí)例，細(xì)胞可以與美國(guó)專(zhuān)利5,827,735號(hào)中描述的疤痕抑制因子共給藥，該專(zhuān)利通過(guò)引用并入本文。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞組合物的給藥可以采用未分化細(xì)胞的形式，即生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。可選地，也可以在刺激分化為諸如成骨表型的期望表型的條件下培養(yǎng)后給予細(xì)胞組合物。纖維蛋白膠纖維蛋白膠是一類(lèi)手術(shù)封閉劑(sealant)，已經(jīng)用于各種臨床處理中。如技術(shù)人員已知的，多種封閉劑可以用于本發(fā)明的組合物。但是，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及纖維蛋白膠與本發(fā)明細(xì)胞的使用。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“纖維蛋白膠”指在鈣離子的存在下，由纖維蛋白聚合物交聯(lián)形成的不溶性基質(zhì)。纖維蛋白膠可以形成自纖維蛋白原或其衍生物或代謝產(chǎn)物、纖維蛋白(可溶性單體或聚合物)和/或其源自形成纖維蛋白基質(zhì)的生物組織或流體的復(fù)合物?？蛇x地，纖維蛋白膠可以形成自通過(guò)重組dna技術(shù)產(chǎn)生的纖維蛋白原或其衍生物或代謝產(chǎn)物或者纖維蛋白。纖維蛋白膠也可以通過(guò)纖維蛋白原與纖維蛋白膠形成的催化劑(如凝血酶和/或因子xiii)的相互作用形成。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，纖維蛋白原在催化劑(諸如凝血酶)的存在下蛋白水解切割并轉(zhuǎn)化為纖維蛋白單體。纖維蛋白單體然后可以形成聚合物，其可以交聯(lián)形成纖維蛋白膠基質(zhì)。諸如因子xiii的催化劑的存在可以增強(qiáng)纖維蛋白聚合物的交聯(lián)。纖維蛋白膠形成的催化劑可以源自含有纖維蛋白原或凝血酶的血漿、冷沉淀物或其他血漿組分?？蛇x地，催化劑可以通過(guò)重組dna技術(shù)產(chǎn)生。血塊形成的速率取決于與纖維蛋白原混合的凝血酶的濃度。作為酶依賴(lài)性反應(yīng)，溫度越高(高達(dá)37℃)，血塊形成速率越快。血塊的拉伸強(qiáng)度取決于使用的纖維蛋白原的濃度。纖維蛋白膠的用途及其制備和使用方法由hirshetal.在美國(guó)專(zhuān)利5,643,192號(hào)中描述。hirsh公開(kāi)了從單一供體提取纖維蛋白原和凝血酶組分以及僅這些組分的組合用做纖維蛋白膠。marx在美國(guó)專(zhuān)利5,651,982號(hào)中描述了另一種纖維蛋白膠的制備和使用方法。marx提供了通過(guò)脂質(zhì)體在哺乳動(dòng)物中用做局部封閉劑的纖維蛋白膠。用于創(chuàng)傷愈合的局部纖維蛋白原復(fù)合物(tfc)的制備和使用是本領(lǐng)域已知的。美國(guó)紅十字會(huì)(americanredcross)的pct申請(qǐng)?zhí)杙ct/us95/15876，pct公開(kāi)號(hào)wo96/17633討論了含有纖維蛋白原、凝血酶和氯化鈣的tfc制品，例如在pct公開(kāi)號(hào)wo96/17633的第16-18頁(yè)。幾種出版物描述了用于遞送治療劑的纖維蛋白膠的用途。例如，美國(guó)專(zhuān)利4,983,393公開(kāi)了用作陰道內(nèi)插入物(insert)的組合物，其包含瓊脂糖、瓊脂、粘多糖鹽水溶液、膠原蛋白、纖維蛋白和酶。此外，美國(guó)專(zhuān)利3,089,815公開(kāi)了由纖維蛋白原和凝血酶組成的注射用藥物制劑，并且美國(guó)專(zhuān)利6,468,527公開(kāi)了促進(jìn)各種生物和非生物試劑遞送到體內(nèi)特定部位的纖維蛋白膠。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可以對(duì)具體實(shí)施方案所示的本發(fā)明做出許多變化和改變而不脫離廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案在各個(gè)方面都應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的而非限制性的。實(shí)施例現(xiàn)在將參考下列非限制性實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地描述本發(fā)明。實(shí)施例1材料和方法小鼠的免疫和抗體分泌雜交瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生收獲vcam-1/cd106陽(yáng)性免疫選擇的綿羊mpc，并將其重懸于補(bǔ)充了20μg胞壁酰二肽(sigmachemicalcompany,st.louis,mo)作為佐劑的300μlpbs。用5×106bmssc對(duì)balb/c小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫，隨后以三周的間隔進(jìn)一步加強(qiáng)免疫3次以確保免疫應(yīng)答的充分親和力成熟。融合前3天，通過(guò)尾靜脈給予重懸于100μlpbs的5×106個(gè)細(xì)胞。在融合前，立刻處死小鼠，無(wú)菌取出它們的脾。通過(guò)將ns1-ag4-1鼠骨髓瘤細(xì)胞系與源自用胰蛋白酶處理的培養(yǎng)的綿羊mpc免疫的balb/c小鼠的脾細(xì)胞融合來(lái)制備分泌與培養(yǎng)的bmssc反應(yīng)的抗體的雜交瘤?；旧习凑障惹暗拿枋鲞M(jìn)行脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合(filshierjetal.,1998和zannettinoacetal.,1996)。針對(duì)與骨髓單核細(xì)胞的低反應(yīng)性以及與原代免疫原(培養(yǎng)的綿羊mpc)和人培養(yǎng)的mpc的反應(yīng)性來(lái)篩選雜交瘤。還針對(duì)反應(yīng)性以及綿羊和人集落形成mpc(cfu-f)的富集來(lái)選擇stro-4雜交瘤。骨髓樣品根據(jù)皇家阿德雷德醫(yī)院(royaladelaidehospital)的人類(lèi)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的指南，獲得正常人成體骨髓的吸出物。根據(jù)醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)科學(xué)研究所(instituteofmedicalandveterinaryscience)的動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的指南，獲得綿羊骨髓的吸出物?；旧习凑障惹暗拿枋?，通過(guò)密度梯度分離制備綿羊和人骨髓單核細(xì)胞(bmmnc)(gronthossetal.,2003)。如下所述，將bmmnc制品用于免疫磁性或熒光活化細(xì)胞分選。mpc細(xì)胞培養(yǎng)按照先前的描述，于12天期間內(nèi)，以一式三份的孔，在一式三份的6孔板中，按照0.1至1×104個(gè)未分級(jí)或免疫選擇的bmmnc每cm2的接種密度進(jìn)行集落效率測(cè)定。按照先前的描述(gronthossetal.,2003)，使細(xì)胞在補(bǔ)充了20％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺和100μml-抗壞血酸-2-磷酸酯、50u/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素的α-mem中，于5％co2和37℃濕潤(rùn)氣氛下生長(zhǎng)。用4％低聚甲醛固定后計(jì)數(shù)集落(>50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞簇)，然后用0.1％甲苯胺藍(lán)染色。通過(guò)接種1至5×104個(gè)未分級(jí)或stro-4+免疫選擇的bmmnc每cm2建立原代bmssc培養(yǎng)物，然后如上所述在α-mem中生長(zhǎng)。分化測(cè)定為了誘導(dǎo)骨形成，將mpc在補(bǔ)充了10％fcs、100μml-抗壞血酸-2-磷酸酯、地塞米松10-7m和3mm無(wú)機(jī)磷酸鹽的α-mem中培養(yǎng)，其中通過(guò)茜素紅染色鑒定礦化沉積(gronthossetal.,2003)。按照先前的描述，在0.5mm異甲基丁基甲基黃嘌呤(ibmx)、0.5μm氫化可的松和60μm吲哚美辛的存在下誘導(dǎo)脂肪形成，其中使用油紅o染色來(lái)鑒定載脂脂肪細(xì)胞(gronthossetal.,2003)。在用10ng/mltgf-β3處理的聚集培養(yǎng)物中評(píng)價(jià)軟骨形成分化，并且通過(guò)0.1％甲苯胺藍(lán)過(guò)夜染色以檢測(cè)蛋白聚糖合成進(jìn)行評(píng)價(jià)(gronthossetal.,2003)。磁性-活化細(xì)胞分選(macs)這按照先前的描述(gronthossetal.,2003)進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將約1-3×108個(gè)正常綿羊或人bmmnc用抗vcam-1/cd106或stro-4澄清(neat)上清在冰上孵育1小時(shí)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，將細(xì)胞制品用山羊抗小鼠igg鏈霉親和素微珠并且最后用鏈霉親和素fitc(1/50；caltaglaboratories,burlingame,ca)在冰上孵育30分鐘，然后在minimacs磁柱(miltenyibiotecinc.,auburn,ca)上分離。間接免疫熒光和流式細(xì)胞分析在免疫標(biāo)記前，將培養(yǎng)的細(xì)胞(綿羊mpc、人mpc、mg63、hos、saos在封閉緩沖液(hbss+20mmhepes、1％正常人ab血清、1％牛血清白蛋白(bsa:cohnfractionv,sigmaaldrichptyltd,nsw,australia)和5％fcs中于冰上孵育20分鐘。在冰上將1×105個(gè)細(xì)胞的等份重懸于100μl任意stro-4的上清中，保持45分鐘。在相同條件下，使用同種型匹配的非結(jié)合對(duì)照抗體，抗體igg1(1b5)(由澳大利亞紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)(universityofnewcastle,aus)的l.k.ashman教授惠贈(zèng))用作培養(yǎng)上清。然后在含5％fcs的hbss中洗滌細(xì)胞，并用山羊抗小鼠igg(γ-鏈特異性)藻紅蛋白(pe)(1/50；southernbiotechnologyassociates,birminghamal)在冰上孵育45分鐘。在分析之前，將細(xì)胞在含5％fcs的hbss中洗滌兩次，并重懸于pbs/1％低聚甲醛中。使用coulterexcel流式細(xì)胞儀(coultercorp.,hialeah,fl)進(jìn)行流式細(xì)胞分析。當(dāng)熒光水平大于99％的使用同種型匹配的非結(jié)合對(duì)照抗體所觀察到的熒光水平時(shí)，確定各種抗體的陽(yáng)性。每個(gè)樣品收集20,000個(gè)事件作為列表式數(shù)據(jù)，并使用coulterelite軟件進(jìn)行分析。免疫沉淀和蛋白印跡按照先前的描述制備細(xì)胞裂解物。在添加澄清的stro-4上清和同種型匹配的非結(jié)合對(duì)照(1b5)之前，將山羊抗小鼠ig偶聯(lián)的dynabeads(dynal,oslo,sweden)在1％(v/v)np40-50mmtris-hcl、150mmnacl、1mmedta[tse]中洗滌兩次。然后將該混合物在4℃下孵育至少6小時(shí)，同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)。在1％np40tse中將所得的預(yù)加載(pre-armed)的dynabeads洗滌兩次，并使用磁性顆粒收集器(mpc-1,dynal)收集珠。向其中添加1.0ml合適的np40細(xì)胞裂解物的等份。將樣品在4℃下孵育2小時(shí)，同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)。然后將免疫沉淀物在1％(v/v)np40-tse中洗滌兩次，在0.1％(v/v)np40-tse洗滌一次，并在tse,ph8.0洗滌一次。然后去除上清，將樣品在-20℃下保存或立即用于電泳。各種免疫沉淀物代表來(lái)自5x106個(gè)細(xì)胞等價(jià)物(equivalent)的材料。按照先前的描述(zannettinoacetal.,1996)，將樣品在25μl還原性樣品緩沖液(62.5mmtris、3％(w/v)sds、10％(v/v)甘油和5％(v/v)2-巰基乙醇)中煮沸3分鐘，并使用考馬斯藍(lán)，通過(guò)10％(w/v)sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。對(duì)于質(zhì)譜和蛋白測(cè)序，將切下的條帶在37℃下進(jìn)行16小時(shí)的胰蛋白酶消化。然后使用milliporec18ziptip將樣品脫鹽并濃縮，并且將1μl等份點(diǎn)樣至含有1μl基質(zhì)(α-氰基-4-羥基肉桂酸，8mg/ml，在70％v/vacn，1％v/vtfa中)的樣品板，并空氣干燥。利用具有ms模式的tof/tof光學(xué)裝置的appliedbiosystems4700蛋白質(zhì)組分析儀進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離(maldi)質(zhì)譜。使用nd:yag激光(355nm)照射樣品。以反射(reflectron)模式獲得的光譜的質(zhì)量范圍是750至3500th。輸出數(shù)據(jù)的格式適合于提交到數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序mascot(matrixscienceltd,london,uk)。對(duì)于免疫印跡，將未染色凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到聚乙烯-二氟乙酸酯(pvdf；msimembranes,geneworks,adelaide,australia)，于濕印跡裝置(hoeferscientificinstruments,sanfrancisco,ca,usa)中在30ma下過(guò)夜。用pbs中的5％脫脂奶粉-0.05％吐溫-20封閉2小時(shí)后，將濾膜用針對(duì)hsp-90的多克隆抗體(santacruzbiotechnologies)在室溫下孵育1小時(shí)。隨后按照制造商的推薦，用山羊抗小鼠堿性磷酸酶偶聯(lián)物(amershambiosciences,poole,uk)檢測(cè)一抗，并利用imagequant軟件(moleculardynamics)在fluorimager(moleculardynamics,sunnyvale,ca)上顯示免疫反應(yīng)性蛋白(zannettinoacetal.,1996和shisetal.,2001)。實(shí)施例2鑒定綿羊和人mpc的單克隆抗體stro-4的產(chǎn)生按照方法部分的描述，在源自用培養(yǎng)的vcam-1/cd106陽(yáng)性來(lái)源的綿羊mpc免疫的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系ns1-ag4-1融合后，產(chǎn)生與綿羊mpc反應(yīng)的一組小鼠單克隆抗體(mab)。初步篩選設(shè)計(jì)為鑒定與綿羊和人產(chǎn)克隆mpc(cfu-f)反應(yīng)的mab。選擇這樣的一種雜交瘤stro-4用于進(jìn)一步分析，因?yàn)樗b定了綿羊和人骨髓單核細(xì)胞的一個(gè)小亞組(圖1a和b)，并有效地分離了綿羊和人cfu-f(圖1c和d)。離體擴(kuò)增的綿羊和人mpc維持了由stro-4鑒定的抗原的高細(xì)胞表面表達(dá)(圖2a和b)，并表現(xiàn)出多譜系分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的能力(圖3)。按照方法部分的描述，使用同種型檢測(cè)試劑盒確定來(lái)自三級(jí)(tertiary)雜交瘤上清的stro-4的免疫球蛋白同種型為igg1。實(shí)施例3stro-4識(shí)別的抗原的表征使用免疫沉淀從未成熟的人骨肉瘤細(xì)胞系mg63純化stro-4抗原，該mg63表達(dá)高細(xì)胞表面水平的stro-4抗原(圖2c)。按照方法部分的描述，用1％np40提取人mg63質(zhì)膜蛋白，并用stro-4抗體孵育。按照方法部分的描述，利用偶聯(lián)至dynal磁珠的綿羊抗小鼠igg抗體回收stro-4免疫沉淀的蛋白，并通過(guò)sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)進(jìn)行分析。分析的免疫沉淀物的考馬斯藍(lán)染色揭示了表觀分子量為90kda的特異性肽條帶(圖4)。從凝膠上切下90kda蛋白片段，將其制備用于質(zhì)譜和氨基酸序列分析。使用所得的stro-4肽序列檢索國(guó)立生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)其與人熱休克蛋白-90β(登錄號(hào)p08238)表現(xiàn)出同源性(圖5)。為了證實(shí)stro-4反應(yīng)性90kda肽是hsp-90β，通過(guò)sds-page分析全細(xì)胞裂解物和stro-4免疫沉淀的提取物。按照方法部分的描述，使用可商購(gòu)的與人hsp-90β反應(yīng)的兔多克隆抗體進(jìn)行蛋白印跡分析。stro-4-免疫沉淀物在90kda的合適分子量處表現(xiàn)出與hsp-90特異性抗體的特異性反應(yīng)性(圖6)。在本研究中，基于stro-4細(xì)胞表面表達(dá)而選擇的綿羊和人mpc細(xì)胞群在體外證實(shí)了廣泛的增殖，并且保留它們分化為骨、軟骨和脂肪組織的能力。迄今為止，幾乎沒(méi)有抗體試劑表現(xiàn)出不同物種之間的交叉反應(yīng)性。因此，可以使用針對(duì)stro-4的抗體作為分離和富集mpc的有效工具。參考文獻(xiàn)aireyja,almeida-poradag,collettiej,poradacd,chamberlainj,movsesianm,sutkojl,zanjanied(2004)humanmesenchymalstemcellsformpurkinjefibersinfetalsheepheart.circulation109(11):1401-7.ansethksetal(2002)insituformingdegradablenetwor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25330335argalapropheaspleuphegluasnlyslyslyslysasnasnile340345350lysleutyrvalargargvalpheilemetaspsercysaspgluleu355360365ileproglutyrleuasnpheileargglyvalvalaspsergluasp370375380leuproleuasnileserargglumetleuglnglnserlysileleu385390395400lysvalilearglysasnilevallyslyscysleugluleupheser405410415gluleualagluasplysgluasntyrlyslysphetyrglualaphe420425430serlysasnleulysleuglyilehisgluaspserthrasnargarg435440445argleusergluleuleuargtyrhisthrserglnserglyaspglu450455460metthrserleuserglutyrvalserargmetlysgluthrglnlys465470475480seriletyrtyrilethrglygluserlysgluglnvalalaasnser485490495alaphevalgluargvalarglysargglyphegluvalvaltyrmet500505510thrgluproileaspglutyrcysvalglnglnleulysglupheasp515520525glylysserleuvalservalthrlysgluglyleugluleuproglu530535540aspglugluglulyslyslysmetglugluserlysalalyspheglu545550555560asnleucyslysleumetlysgluileleuasplyslysvalglulys565570575valthrileserasnargleuvalserserprocyscysilevalthr580585590serthrtyrglytrpthralaasnmetgluargilemetlysalagln595600605alaleuargaspasnserthrmetglytyrmetmetalalyslyshis610615620leugluileasnproasphisproilevalgluthrleuargglnlys625630635640alaglualaasplysasnasplysalavallysaspleuvalvalleu645650655leuphegluthralaleuleuserserglypheserleugluasppro660665670glnthrhisserasnargiletyrargmetilelysleuglyleugly675680685ileaspgluaspgluvalalaalaglugluproasnalaalavalpro690695700aspgluileproproleugluglyaspgluaspalaserargmetglu705710715720gluvalasp當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12