本發(fā)明涉及一種美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯在離子液體中的合成方法，屬于聚己內(nèi)酯改性技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
聚己內(nèi)酯是一種重要的醫(yī)用生物可降解材料，它被廣泛用作手術(shù)縫線、藥物緩釋材料以及醫(yī)用支架材料。但是作為醫(yī)用材料，聚己內(nèi)酯存在疏水性過強的缺陷，這會導(dǎo)致聚己內(nèi)酯與細(xì)胞培養(yǎng)基不易浸潤，細(xì)胞在其表面的粘附生長比較困難，久而久之會出現(xiàn)異物反應(yīng)等生物不相容性反應(yīng)，引發(fā)無菌性炎癥。因此，為了提高聚己內(nèi)酯的細(xì)胞相容性，有必要對其進(jìn)行改性。
已有一些報道，利用幾丁質(zhì)、殼聚糖、羥乙基纖維素以及淀粉等基團(tuán)在脂肪酶或者其他無機金屬催化劑的催化下引入到聚己內(nèi)酯末端，實現(xiàn)了聚己內(nèi)酯的功能改性。與普通的多糖類物質(zhì)相比，蛋白是動物體中普遍存在的一種大分子蛋白質(zhì)，其細(xì)胞相容性更好，因此，若能將蛋白引入聚己內(nèi)酯組織材料中，對提高其細(xì)胞親和性和生物相容性更有利。但是沒有人能夠采用脂肪酶催化方法合成蛋白類改性的聚己內(nèi)酯，這是因為蛋白本身缺乏足夠的脂肪酶催化位點，因此采用酶法催化無法直接實現(xiàn)其官能化改性，如果采用金屬離子催化，則由于其高溫條件限制，蛋白在催化過程中會發(fā)生變性，失去改性意義。
美拉德產(chǎn)物是還原糖末端羰基和蛋白質(zhì)上的氨基在簡單加熱條件下形成的一種蛋白質(zhì)-糖共價復(fù)合物。由于在蛋白質(zhì)分子中引入了糖鏈，所以經(jīng)過美拉德反應(yīng)后，蛋白質(zhì)的性質(zhì)，如：溶解性、乳化性、起泡性、熱穩(wěn)定性等，都較改性之前有了很大改善。目前針對美拉德反應(yīng)的研究主要應(yīng)用于食品領(lǐng)域，這是因為美拉德反應(yīng)主要發(fā)生在食品的加工過程中，美拉德反應(yīng)對食品香味、色澤、蛋白的溶解/乳化及食品的保鮮均有重要影響。此外，最新研究顯示美拉德產(chǎn)物還具有特殊的抗氧化性能以及抗菌性能，因此將美拉德產(chǎn)物用作抗氧化劑以及其他添加劑的研究也逐漸得到重視，最近有研究顯示身體內(nèi)的美拉德反應(yīng)對人體健康也有重要影響，但是將其應(yīng)用于聚己內(nèi)酯改性目前尚未有人研究。
在美拉德產(chǎn)物合成方面，現(xiàn)有方法主要分為濕法和干法，其中濕法只適合于糖和蛋白均溶于水的情況，其反應(yīng)速度較慢，往往需要幾十個小時以上；干法主要采用粉末狀物質(zhì)混合后進(jìn)行加熱，該法反應(yīng)非常迅速，反應(yīng)過程劇烈，基本無法有效控制，產(chǎn)物性能較差。最近，有研究者公開了一種殼聚糖-木聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物及其制備方法和應(yīng)用(CN103304682A)在該發(fā)明中，研究者利用了離子液體作為溶劑來進(jìn)行美拉德反應(yīng)，但是這種方法仍然是屬于濕法的范疇，只能對于溶解于氯代1-丁基-3-甲基咪唑離子液體中的物質(zhì)有用，而且該離子液體對蛋白類物質(zhì)的溶解程度有限，所以這種應(yīng)用是受限的。
在現(xiàn)有的聚己內(nèi)酯改性方法中，利用生物合成技術(shù)將天然高分子與聚己內(nèi)酯進(jìn)行酶催化接枝共聚是比較有吸引力的一種綠色改性方法。在此過程中，酶必須在無水環(huán)境中進(jìn)行催化，但是傳統(tǒng)的非水相體系多以有毒溶劑為主，對酶活以及穩(wěn)定性都有負(fù)面影響，很大程度上限制了該方法的應(yīng)用。近年來，隨著離子液體這一新型綠色溶劑的發(fā)展，該問題有望得到解決。很多研究顯示，離子液體是脂肪酶催化合成的理想介質(zhì)。大部分脂肪酶在離子液體中的穩(wěn)定性和選擇性都有增加，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率也相當(dāng)有吸引力。
現(xiàn)有的離子液體中聚己內(nèi)酯的改性研究主要集中于利用離子液體的強溶解能力對淀粉、纖維素或者殼聚糖等天然產(chǎn)物進(jìn)行溶解后，得到均相接枝物，然后再利用傳統(tǒng)的無機金屬離子催化劑做引發(fā)劑來實現(xiàn)己內(nèi)酯的開環(huán)聚合，最終實現(xiàn)聚己內(nèi)酯末端官能化改性。例如：劉繼延以1-丁基-3-甲基咪唑溴離子液體作為淀粉和己內(nèi)酯的共溶劑，在異辛酸亞錫的催化下合成了生物可降解的淀粉/聚己內(nèi)酯接枝共聚物，但是該產(chǎn)物分子量較低，因此可以溶于水。黃清采用室溫離子液體氯代1-丁基-3-甲基咪唑作為魔芋葡甘聚糖的溶劑，以辛酸亞錫作為催化劑成功在魔芋葡甘聚糖表面接枝了聚己內(nèi)酯長鏈；Zhaodong Wang在1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽離子液體中采用異辛酸亞錫催化合成了殼聚糖/聚己內(nèi)酯接枝共聚物。這些研究在本質(zhì)上仍然是傳統(tǒng)的無機金屬催化開環(huán)聚合，離子液體在其中僅扮演了溶劑的角色。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明提出了在離子液體中直接酶法合成一種膠原蛋白改性聚己內(nèi)酯的方法，通過在聚己內(nèi)酯材料中引入細(xì)胞識別性較好的膠原蛋白大分子，提高聚己內(nèi)酯材料的細(xì)胞親和性與功能性。由于膠原蛋白分子中缺乏適于脂肪酶催化的伯羥基位點，無法直接以其作為引發(fā)劑對己內(nèi)酯進(jìn)行酶法開環(huán)聚合。為此，本發(fā)明通過美拉德反應(yīng)將含有伯羥基的小分子還原糖接枝到膠原蛋白上，提升蛋白上的伯羥基數(shù)目，得到適于脂肪酶催化的美拉德產(chǎn)物，再以此為引發(fā)劑，借助于脂肪酶催化己內(nèi)酯單體進(jìn)行開環(huán)聚合反應(yīng)，最終得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯。該法避免了傳統(tǒng)金屬催化劑開環(huán)聚合時高溫對蛋白質(zhì)的破壞及其金屬離子殘留問題，而且引入的美拉德產(chǎn)物是一種糖蛋白，其生物相容性更好，該產(chǎn)物有助于提高聚己內(nèi)酯的生物相容性。本發(fā)明方法還具有高效、選擇性好、作用條件溫和以及環(huán)境友好等特點。
本發(fā)明的在離子液體中合成美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯的方法，所述方法是將含有伯羥基的小分子還原糖的溶液和膠原蛋白緩沖溶液混合，冷凍干燥得到混合物，然后將混合物分散于離子液體中，于60～150℃下反應(yīng)；反應(yīng)完畢后，降溫至100℃以下，加入己內(nèi)酯單體和脂肪酶，在脂肪酶的催化下進(jìn)行開環(huán)聚合反應(yīng)，得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述含有伯羥基的小分子還原糖為葡萄糖、半乳糖、乳糖等中的任意一種或者多種。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述糖和膠原蛋白的質(zhì)量比為1:1～1:3。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述分散是將混合物按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％～5％的比例分散于離子液體中。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述離子液體為1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽或者1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述的離子液體與己內(nèi)酯單體之間的質(zhì)量比為0.1～10。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述60～150℃下反應(yīng)的時間為5～240分鐘。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述降溫是降溫至60～100℃以下。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述脂肪酶為南極假絲酵母脂肪酶B或者豬胰脂肪酶。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述脂肪酶添加量為己內(nèi)酯單體質(zhì)量的0.1％～10％。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述脂肪酶的酶活為3000U/g。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述開環(huán)聚合反應(yīng)是在溫度為60～100℃下振蕩反應(yīng)1～144小時。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述制備方法還包括，在開環(huán)聚合反應(yīng)完畢后向反應(yīng)混合物中加入二氯甲烷，使目標(biāo)產(chǎn)物完全溶解，過濾，再向濾液中加入適當(dāng)體積的-20℃～-4℃冷甲醇，于-20℃～-4℃環(huán)境中靜置一段時間，再過濾，得到粗產(chǎn)物；以丙酮為溶劑抽提上述粗產(chǎn)物，得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯。
在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明的方法具體是：
(1)分別配制1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳糖溶液和膠原蛋白磷酸鹽緩沖液(pH＝7.8)，按照體積比1:3比例混合均勻，-20℃冷凍干燥48小時后，將該混合物按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％～5％的比例分散于離子液體中，之后將離子液體溫度升至60～150℃，反應(yīng)5～240分鐘；
(2)反應(yīng)完畢后，將上述離子液體溫度降至60℃，分別加入ε-己內(nèi)酯單體和脂肪酶，通氮氣密封后將其置于溫度為60～100℃恒溫振蕩反應(yīng)器中反應(yīng)1～144小時；
(3)向上述產(chǎn)物中加入2倍產(chǎn)物體積的二氯甲烷，之后用濾紙過濾掉脂肪酶，再向濾液中加入10倍濾液體積的-20℃冷甲醇，于-20℃環(huán)境中靜置24小時后過濾，得到粗產(chǎn)物；
(4)以丙酮為溶劑對上述粗產(chǎn)物抽提24小時，得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯。
本發(fā)明的第二個目的是提供按照上述方法得到的美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯。
本發(fā)明的第三個目的是提供所述美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用是用作醫(yī)用材料。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用具體是用作手術(shù)縫線、藥物緩釋材料或者醫(yī)用支架材料。
本發(fā)明的有益效果：
(1)本發(fā)明的美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯合成方法，改性過程環(huán)保無污染，通過離子液體中的美拉德反應(yīng)在膠原蛋白上引入含有伯羥基的還原糖小分子，成功實現(xiàn)了利用脂肪酶來催化合成美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯，其反應(yīng)條件溫和，無金屬離子殘留。
(2)本發(fā)明中，所選擇的兩種離子液體既可以作為美拉德反應(yīng)的分散介質(zhì)又可以作為脂肪酶的催化反應(yīng)介質(zhì)。一方面將離子液體作為加熱介質(zhì)來進(jìn)行干法反應(yīng)，采用這樣的方法，不僅有利于反應(yīng)底物的分散及其混合，而且條件相對溫和且可控，得到的美拉德產(chǎn)物性能佳；另一方面：該類離子液體對脂肪酶基本無害，一些研究還顯示離子液體對脂肪酶催化聚合反應(yīng)還有促進(jìn)作用，因此美拉德反應(yīng)后無需移除離子液體即可進(jìn)行下一步的開環(huán)聚合反應(yīng)。
(3)產(chǎn)物細(xì)胞親和性更好。采用本發(fā)明述及的美拉德產(chǎn)物對聚己內(nèi)酯改性，可以獲得更好的細(xì)胞親和性，膠原蛋白與乳糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，具有兩親性，采用該物質(zhì)對聚己內(nèi)酯改性可以提升其細(xì)胞親和性，并賦予其更多功能。
具體實施方案
潤濕性測試方法：
采用JC2000D4接觸角測量儀進(jìn)行滴液法測試。將改性聚己內(nèi)酯采用壓片機進(jìn)行壓片，制成厚約2mm的薄片。測試時，將樣品平整的固定在儀器平臺上。在距離樣品10mm處滴下去離子水液滴，60秒后測定水滴與樣品間形成的接觸角，每個試樣測5次，取平均值。
MTT檢測即細(xì)胞毒性測定(非直接接觸)：
樣品經(jīng)過24h紫外消毒殺菌后用DMEM浸泡36h，通過過濾器(孔徑大小0.22μm)除去樣品得到浸漬培養(yǎng)基，待用。在96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100μL的NIH/3T3細(xì)胞懸浮液(5*104個/mL)，置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞完全貼壁后去除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，加入浸漬培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，最后加入10μL的MTT(四甲基偶氮唑鹽)溶液至每孔中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，通過ELISA酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度，每個樣品測試重復(fù)5次。
細(xì)胞毒性測定結(jié)果表示為：
細(xì)胞存活百分比(％)＝A1/A0*100
其中，A1、A0分別為樣品和空白的吸光度
接枝效率:
采用稱重法進(jìn)行計算，接枝效率＝[接枝物單體質(zhì)量/(接枝物單體質(zhì)量+均聚物質(zhì)量)]*100％
以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例1：
(1)分別配制1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳糖溶液和膠原蛋白磷酸鹽緩沖液(pH＝7.8)，按照體積比1:3比例混合均勻，-20℃冷凍干燥48小時后，將該混合物按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的比例分散于1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體中，之后將離子液體溫度升至150℃，反應(yīng)5分鐘；
(2)反應(yīng)完畢后，將上述離子液體溫度降至60℃，分別加入ε-己內(nèi)酯單體和南極假絲酵母脂肪酶B，通氮氣密封后將其置于溫度為100℃恒溫振蕩反應(yīng)器中反應(yīng)1小時；
(3)向上述產(chǎn)物中加入2倍產(chǎn)物體積的二氯甲烷，之后用濾紙過濾掉脂肪酶，再向濾液中加入10倍濾液體積的-20℃冷甲醇，于-20℃環(huán)境中靜置24小時后過濾，得到粗產(chǎn)物；
(4)以丙酮為溶劑對上述粗產(chǎn)物抽提24小時，得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯。
經(jīng)上述方法得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯，經(jīng)計算其接枝效率約為70％，對其壓片后進(jìn)行接觸角測試，顯示其水滴潤濕接觸角為45°，MTT法檢測表明細(xì)胞存活率95％以上。
實施例2：
(1)分別配制1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳糖溶液和膠原蛋白磷酸鹽緩沖液(pH＝7.8)，按照體積比1:3比例混合均勻，-20℃冷凍干燥48小時后，將該混合物按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的比例分散于1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體中，之后將離子液體溫度升至60℃，反應(yīng)240分鐘；
(2)反應(yīng)完畢后，將上述離子液體溫度降至60℃，分別加入ε-己內(nèi)酯單體和豬胰脂肪酶，通氮氣密封后將其置于溫度為60℃恒溫振蕩反應(yīng)器中反應(yīng)144小時；
(3)向上述產(chǎn)物中加入2倍產(chǎn)物體積的二氯甲烷，之后用濾紙過濾掉脂肪酶，再向濾液中加入10倍濾液體積的-20℃冷甲醇，于-20℃環(huán)境中靜置24小時后過濾，得到粗產(chǎn)物；
(4)以丙酮為溶劑對上述粗產(chǎn)物抽提24小時，得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯。
經(jīng)上述方法得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯，經(jīng)計算其接枝效率約為60％，對其壓片后進(jìn)行接觸角測試，顯示其水滴潤濕接觸角為50°，MTT法檢測表明細(xì)胞存活率90％以上。
實施例3：
(1)分別配制1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳糖溶液和膠原蛋白磷酸鹽緩沖液(pH＝7.8)，按照體積比1:3比例混合均勻，-20℃冷凍干燥48小時后，將該混合物按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的比例分散于1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體中，之后將離子液體溫度升至150℃，反應(yīng)5分鐘；
(2)反應(yīng)完畢后，將上述離子液體溫度降至60℃，分別加入ε-己內(nèi)酯單體和豬胰脂肪酶，通氮氣密封后將其置于溫度為100℃恒溫振蕩反應(yīng)器中反應(yīng)1小時；
(3)向上述產(chǎn)物中加入2倍產(chǎn)物體積的二氯甲烷，之后用濾紙過濾掉豬胰脂肪酶，再向濾液中加入10倍濾液體積的-20℃冷甲醇，于-20℃環(huán)境中靜置24小時后過濾，得到粗產(chǎn)物；
(4)以丙酮為溶劑對上述粗產(chǎn)物抽提24小時，得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯。
經(jīng)上述方法得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯，經(jīng)計算其接枝效率約為63％，對其壓片后進(jìn)行接觸角測試，顯示其水滴潤濕接觸角為50°，MTT法檢測表明細(xì)胞存活率90％以上。
實施例4：
(1)分別配制1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳糖溶液和膠原蛋白磷酸鹽緩沖液(pH＝7.8)，按照體積比1:3比例混合均勻，-20℃冷凍干燥48小時后，將該混合物按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的比例分散于1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體中，之后將離子液體溫度升至60℃，反應(yīng)240分鐘；
(2)反應(yīng)完畢后，將上述離子液體溫度降至60℃，分別加入ε-己內(nèi)酯單體和南極假絲酵母脂肪酶B，通氮氣密封后將其置于溫度為60℃恒溫振蕩反應(yīng)器中反應(yīng)144小時；
(3)向上述產(chǎn)物中加入2倍產(chǎn)物體積的二氯甲烷，之后用濾紙過濾掉南極假絲酵母脂肪酶B，再向濾液中加入10倍濾液體積的-20℃冷甲醇，于-20℃環(huán)境中靜置24小時后過濾，得到粗產(chǎn)物；
(4)以丙酮為溶劑對上述粗產(chǎn)物抽提24小時，得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯。
經(jīng)上述方法得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯，經(jīng)計算其接枝效率約為72％，對其壓片后進(jìn)行接觸角測試，顯示其水滴潤濕接觸角為58°，MTT法檢測表明細(xì)胞存活率85％以上。
對照實施例1：
將實施例1的步驟(1)的離子液體用水溶液替代，反應(yīng)得到美拉德產(chǎn)物，然后再將產(chǎn)物分散于離子液體中，其他步驟和參數(shù)與實施例1一致。結(jié)果顯示：該法得到美拉德產(chǎn)物顏色較淺，這說明還原糖對膠原蛋白接枝程度較低，采用該產(chǎn)物進(jìn)一步反應(yīng)得到的改性聚己內(nèi)酯，經(jīng)計算其接枝效率約為58％，對其壓片后進(jìn)行接觸角測量，結(jié)果顯示其潤濕接觸角為70°，MTT法測定的細(xì)胞存活率為75％左右，均不及離子液體中得到美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯好。以上這一結(jié)果說明在離子液體中美拉德反應(yīng)比水溶液中要更高效，得到的產(chǎn)物的潤濕性和細(xì)胞親和性能也更好。
對照實施例2：
將實施例1的步驟(1)省略，直接將乳糖分散于1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體中，其他步驟和參數(shù)與實施例1一致。結(jié)果顯示：該法得到的乳糖改性聚己內(nèi)酯，其接枝效率約為47％，壓片法測定的潤濕接觸角為60°，MTT法測定的細(xì)胞存活率為70％左右，均不及美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯好。以上這一結(jié)果說明美拉德產(chǎn)物的潤濕性和細(xì)胞親和性能也更好。
對照實施例3：
將實施例1的步驟(1)省略，直接將膠原蛋白分散于1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體中，其他步驟和參數(shù)與實施例1一致。結(jié)果顯示：該法得到膠原蛋白改性聚己內(nèi)酯產(chǎn)物量較少，經(jīng)計算其接枝效率約為4％，壓片法測定的潤濕接觸角為74°，MTT法測定的細(xì)胞存活率為70％左右，均不及美拉德產(chǎn)物改性聚己內(nèi)酯好。這說明在膠原蛋白分子上若不引入含有伯羥基的小分子還原糖，脂肪酶無法以膠原蛋白為底物完成對聚己內(nèi)酯的催化開環(huán)聚合反應(yīng)，大部分己內(nèi)酯單體被催化成為聚己內(nèi)酯均聚物。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。