本發(fā)明涉及一種具有生物活性的阿魏酸蔗渣木聚糖酯-g-LME/AA/AM的制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著癌癥病例的增加，加之尚無真正特效的藥物或疫苗問世，探索和開發(fā)新型、廉價、安全和高效的抗癌新制劑成為當(dāng)前亟待拓展的一個新領(lǐng)域。研究表明，從天然產(chǎn)物中提取抗癌活性物質(zhì)將是開發(fā)抗癌新制劑的一個有效的發(fā)展方向，蔗渣木聚糖作為具備高效生物活性的天然產(chǎn)物之一，不僅含量豐富，且具有可降解性、抗癌、抗氧化、抗炎、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等生物功能。由于木聚糖自身存在缺陷，通過對木聚糖酯化、接枝共聚改性，可有效改變其分子空間結(jié)構(gòu)來進(jìn)一步提高其抗生物活性。

蔗渣木聚糖衍生物尤其是蔗渣木聚糖酯化、接枝共聚物具有直接抑制癌細(xì)胞的作用，通過進(jìn)一步修飾或引入具有抗癌作用的基團(tuán)可增強前者的抗癌效果。鑒于阿魏酸具有抑制癌細(xì)胞的作用，而順丁烯二酸-6-L-抗壞血酸單酯(LME)是人類等高等靈長類動物與其他少數(shù)生物的必需營養(yǎng)素物質(zhì)，抑菌、抗炎等方面的生物活性顯著，將阿魏酸、LME作為活性基團(tuán)引入蔗渣木聚糖或衍生物分子鏈中可顯著改善其抗癌活性。同時，相關(guān)研究表明，引入不同結(jié)構(gòu)的聚合單體使得支鏈分子的延長可成倍提高物質(zhì)本身的活性。

本發(fā)明第一步以蔗渣木聚糖為原料，阿魏酸為酯化劑合成了蔗渣木聚糖阿魏酸酯；然后在交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺溶液和引發(fā)劑過硫酸銨溶液引發(fā)作用下，進(jìn)一步與LME、丙烯酸(AA)、丙烯酰胺(AM)混合單體接枝合成具有抗癌活性的蔗渣木聚糖阿魏酸酯-g-LME/AA/AM。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了進(jìn)一步提高蔗渣木聚糖衍生物的抗癌活性，提供一種蔗渣木聚糖阿魏酸酯-g-LME/AA/AM的制備方法。

本發(fā)明的具體步驟為：

(1)將蔗渣木聚糖于60℃真空干燥箱中干燥至恒重，得干基蔗渣木聚糖。

(2)稱取4～30g阿魏酸加入250mL的四口燒瓶中，并向其中加入10～30mL分析純醋酸酐和10～20mL分析純吡啶，在4～30℃的條件下反應(yīng)5～12小時。

(3)將步驟(2)所得物料倒入燒杯中，并在玻璃棒攪拌下向其中加入15～40mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％～38％的鹽酸溶液，直至燒杯中析出白色沉淀。靜置20～30分鐘，將上層清夜倒入回收瓶中。

(4)將步驟(3)所得白色沉淀物分別用5～30mL蒸餾水洗滌3次后送至50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，得乙酰阿魏酸。

(5)稱取3～10g步驟(4)所得乙酰阿魏酸加入到250mL的四口燒瓶中，并向其中加入20～50mL分析純環(huán)己烷和0.1～0.7g分析純N,N–二甲基甲酰胺，升溫至50～80℃，攪拌回流20分鐘。

(6)向步驟(5)所得混合液中逐滴加入10～50mL分析純二氯亞砜，控制在10～30分鐘內(nèi)滴加完畢，繼續(xù)反應(yīng)1～5小時。

(7)將步驟(6)所得物料置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在溫度為50～80℃的條件下蒸發(fā)濃縮10～60分鐘，再置于50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，得到乙酰阿魏酸酰氯。

(8)稱取1～8g步驟(1)所得干基蔗糖木聚糖加入到250mL四口燒瓶中，并加入0.1～0.4g對甲苯磺酸，20～50mL分析純丙酮，攪拌回流40分鐘配置成蔗渣木聚糖懸浮液。

(9)稱取1～10g步驟(7)所得乙酰阿魏酸酰氯加入到步驟(8)所得蔗渣木聚糖懸浮液中，攪拌均勻，在25～55℃的條件下反應(yīng)3～7小時。

(10)將步驟(9)所得物料抽濾，分別用5～20mL蒸餾水、5～20mL無水乙醇各洗滌3次后送入50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，即得蔗渣木聚糖乙酰阿魏酸酯。

(11)將步驟(10)所得蔗渣木聚糖乙酰阿魏酸酯置入30～50mL碳酸氫鈉的無水乙醇飽和溶液中，常溫下攪拌直至溶液的pH不發(fā)生變化，靜置沉淀，將上層清夜倒入回收瓶中。用10～15mL蒸餾水洗滌沉淀3次后送入50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，即得蔗渣木聚糖阿魏酸酯。

(12)分別稱取1.3～4.1g接枝單體LME、0.3～1.1g分析純AA、0.3～1.1g AM于50mL燒杯中，用20～50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的NaOH溶液中和至pH＝8，配制成混合單體溶液，將該混合單體溶液加入到恒壓滴液漏斗中。

(13)將1.5～2.5g步驟(11)所得蔗渣木聚糖阿魏酸酯加入到250mL的四口燒瓶中。

(14)將2～5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％～10％的引發(fā)劑過硫酸銨溶液加入另一恒壓滴液漏斗中。

(15)量取20～30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)劑溶液，加入第三個恒壓滴液漏斗中。

(16)滴加步驟(14)所得引發(fā)劑溶液到步驟(13)所得反應(yīng)體系中，同步滴加步驟(12)所得混合單體溶液?？刂圃?～6小時加完，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)1～2小時。

(17)再將步驟(15)所得溶液滴加到步驟(16)所得體系中，控制在30～40分鐘加完，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)3.5～6.5小時。

(18)抽濾步驟(17)所得產(chǎn)物，并用10～20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70％～80％的乙醇溶液、蒸餾水分別洗滌濾餅3次后，于60℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，即得最終產(chǎn)物蔗渣木聚糖阿魏酸酯-g-LME/AA/AM。

(19)測定步驟(18)所得產(chǎn)物中混合單體接枝率和接枝效率，具體方法和步驟如下：將定量產(chǎn)物蔗渣木聚糖阿魏酸酯-g-LME/AA/AM用分析純丙酮沉淀后，分別用分析純無水乙醇洗滌2～3次，在55℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到接枝共聚粗產(chǎn)物。然后，在索氏提取器中用分析純丙酮作為溶劑將粗產(chǎn)物抽提24小時，除去均聚物后得到純化的接枝共聚物。接枝率和接枝效率的計算公式如下：

式中：G——接枝率，％；

GE——接枝效率，％；

W₀——原產(chǎn)物蔗渣木聚糖阿魏酸酯-g-BA/MAA的質(zhì)量，單位g；

W₁——單體的質(zhì)量，單位g；

W₂——接枝支鏈的質(zhì)量，單位g。

本發(fā)明以蔗糖木聚糖為原料，阿魏酸為酯化劑首先合成了蔗渣木聚糖阿魏酸酯。然后以蔗渣木聚糖阿魏酸酯為主體，在交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺存在下，LME、AA、AM為混合接枝單體經(jīng)過硫酸銨引發(fā)接枝最終合成多元復(fù)合交聯(lián)聚合物蔗渣木聚糖阿魏酸酯-g-LME/AA/AM。產(chǎn)物的接枝率、接枝效率較高。

附圖說明

圖1為原蔗渣木聚糖的SEM照片。

圖2為蔗渣木聚糖阿魏酸酯-g-LME/AA/AM的SEM照片。

圖3為原蔗渣木聚糖和蔗渣木聚糖阿魏酸酯-g-LME/AA/AM的IR圖。

圖4為原蔗渣木聚糖的TG及DTG曲線。

圖5為蔗渣木聚糖阿魏酸酯-g-LME/AA/AM的TG及DTG曲線

圖6為原蔗渣木聚糖的XRD圖。

圖7為蔗渣木聚糖阿魏酸酯-g-LME/AA/AM的XRD圖。

具體實施方式：

實施例：

(1)將蔗渣木聚糖于60℃真空干燥箱中干燥至恒重，得干基蔗渣木聚糖。

(2)稱取16g阿魏酸加入250mL的四口燒瓶中，并向其中加入22mL分析純醋酸酐和13mL分析純吡啶，在4～30℃的條件下反應(yīng)8小時。

(3)將步驟(2)所得物料倒入燒杯中，并在玻璃棒攪拌下向其中加入20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的鹽酸溶液，直至燒杯中析出白色沉淀。靜置25分鐘，將上層清夜倒入回收瓶中。

(4)將步驟(3)所得白色沉淀物分別用20mL蒸餾水洗滌3次后送至50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，得乙酰阿魏酸。

(5)稱取8g步驟(4)所得乙酰阿魏酸加入到250mL的四口燒瓶中，并向其中加入40mL分析純環(huán)己烷和0.5g分析純N,N–二甲基甲酰胺，升溫至60℃，攪拌回流20分鐘。

(6)向步驟(5)所得混合液中逐滴加入30mL分析純二氯亞砜，控制在20分鐘內(nèi)滴加完畢，繼續(xù)反應(yīng)4小時。

(7)將步驟(6)所得物料置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在溫度為60℃的條件下蒸發(fā)濃縮30分鐘，再置于50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，得到乙酰阿魏酸酰氯。

(8)稱取5g步驟(1)所得干基蔗糖木聚糖加入到250mL四口燒瓶中，并加入0.3g對甲苯磺酸，30mL分析純丙酮，攪拌回流40分鐘配置成蔗渣木聚糖懸浮液。

(9)稱取6g步驟(7)所得乙酰阿魏酸酰氯加入到步驟(8)所得蔗渣木聚糖懸浮液中，攪拌均勻，在40℃的條件下反應(yīng)5小時。

(10)將步驟(9)所得物料抽濾，分別用10mL蒸餾水、10mL無水乙醇各洗滌3次后送入50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，即得蔗渣木聚糖乙酰阿魏酸酯。

(11)將步驟(10)所得蔗渣木聚糖乙酰阿魏酸酯置入40mL碳酸氫鈉的無水乙醇飽和溶液中，常溫下攪拌直至溶液的pH不發(fā)生變化，靜置沉淀，將上層清夜倒入回收瓶中。用10mL蒸餾水洗滌沉淀3次后送入50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，即得蔗渣木聚糖阿魏酸酯。

(12)分別稱取接枝單體1.5g LME、0.4g分析純AA、0.6g AM于50mL燒杯中，用30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的NaOH溶液中和至pH＝8，配制成混合單體溶液，將該混合單體溶液加入到恒壓滴液漏斗中。

(13)將1.8g步驟(11)所得蔗渣木聚糖阿魏酸酯加入到250mL的四口燒瓶中。

(14)將3.2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的引發(fā)劑過硫酸銨溶液加入另一恒壓滴液漏斗中。

(15)量取24mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)劑溶液，加入第三個恒壓滴液漏斗中。

(16)滴加步驟(14)所得引發(fā)劑溶液到步驟(13)所得反應(yīng)體系中，同步滴加步驟(12)所得混合單體溶液?？刂圃?小時加完，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)1小時。

(17)再將步驟(15)所得溶液滴加到步驟(16)所得體系中，控制在30分鐘加完，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)3.5小時。

(18)抽濾步驟(17)所得產(chǎn)物，并用15mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液、蒸餾水分別洗滌濾餅3次后，于60℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，即得最終產(chǎn)物蔗渣木聚糖阿魏酸酯-g-LME/AA/AM。

(19)測定步驟(18)所得產(chǎn)物中單體接枝率為31.2％，接枝效率為76.5％。

樣品經(jīng)過IR分析，在1714cm^-1出現(xiàn)了強而尖的羧基，在2919cm^-1的振動峰明顯增強，662cm^-1出現(xiàn)的特征峰是酰胺的伸縮振動特征峰。經(jīng)SEM分析，對比改性前后蔗渣木聚糖或其衍生物的顆粒表面形貌，衍生物的表面結(jié)構(gòu)與木聚糖相比表面層條狀、顏色變得更深，可以看出改性后的產(chǎn)品的表面結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化。經(jīng)XRD分析得改性后的木聚糖衍生物在20°附近出現(xiàn)了強的衍射峰，峰形高、寬，較分散。通過熱重分析的TG-DTG曲線看出，改性后的阿魏酸蔗渣木聚糖酯在300℃有較強的吸熱峰，因此交聯(lián)蔗渣木聚糖阿魏酸酯-g-LME/AA/AM的熱穩(wěn)定性有所提高。