本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種利用限量dNTP競爭性PCR結(jié)合HRM技術(shù)檢測22q11.2拷貝數(shù)缺失的方法。

背景技術(shù)：

22q11.2微缺失綜合征是臨床最常見的遺傳綜合征，該綜合征的發(fā)生是由于22號染色體長臂近著絲粒端微片段22q11.21-q11.23缺失引起的。其核心區(qū)域位于22q11.2區(qū)域上低拷貝重復(fù)序列LCR22-A至LCR22-D間，大小為3Mb，約90％的綜合征患者表現(xiàn)為該片段一個拷貝數(shù)的整體缺失，亦有部分患者為不同低拷貝重復(fù)序列間的缺失組合。根據(jù)臨床表現(xiàn)與特征，可對該綜合征病人作初步診斷，而對22q11.2缺失片段的檢測是該病確診的重要依據(jù)。

目前拷貝數(shù)變異(Copynumbervariation,CNV)的檢測方法主要有基于芯片的全基因組掃描技術(shù)和基于PCR技術(shù)的候選CNV檢測技術(shù)兩大類，不同方法的可靠性、操作難易度及經(jīng)濟性等指標(biāo)均不盡相同?；谛酒腃NV檢測技術(shù)主要包括比較基因組雜交、單核苷酸多態(tài)性芯片及新一代測序技術(shù)，這些技術(shù)適用于CNV的高通量檢測，有利于發(fā)現(xiàn)與疾病有關(guān)的新的拷貝數(shù)變異，但較高的成本限制了它們的廣泛使用。在對如22q11.2微缺失綜合征等缺失片段較明確的疾病檢測中，候選CNV檢測技術(shù)更為適合。

限量dNTP競爭性PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上的一種改進(jìn)，在同一反應(yīng)管內(nèi)，靶基因和參考基因進(jìn)行同步擴增，其中dNTP的量是限定的，由于競爭作用，當(dāng)一種模板量逐漸增加時，另一種模板的擴增產(chǎn)物相對逐漸減少，而擴增產(chǎn)物的比值和它們初始狀態(tài)時模板的相對定量是一致的。

高分辨率熔解曲線技術(shù)(High Resolution Melting，HRM)是美國猶他大學(xué)Wittwer等人在2003年首次提出的基因突變檢測的新技術(shù)。該技術(shù)在PCR結(jié)束后直接運行高分辨率熔解，通過飽和染料監(jiān)控核酸的熔解過程，得到特征的熔解曲線，再根據(jù)熔解曲線的不同來判斷核酸性質(zhì)的差異。

中國專利文獻(xiàn)CN101555528A公開了一種染色體22q11.2區(qū)微缺失、微重復(fù)的測定方法：抽提基因組DNA；進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR復(fù)合擴增，復(fù)合擴增體系中包括了5個STR標(biāo)記：D22S873，22D_5_1，22D_4_5，2D_4_4，22D_4_3和一個內(nèi)參G6PDH；取PCR擴增產(chǎn)物變性使雙鏈產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為可為毛細(xì)管電泳分析的單鏈，采用毛細(xì)管電泳對上述變性產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)物長度和產(chǎn)物量分析；采用量比值分析的方法和/或采用峰的位置及數(shù)量分析的方法判斷是否為正常、微缺失或微重復(fù)。中國專利文獻(xiàn)CN102533974A公開了一種檢測22q11微缺失綜合征的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡核苷酸探針。但是關(guān)于本發(fā)明的靈敏性、特異性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性高的利用限量dNTP競爭性PCR結(jié)合HRM技術(shù)檢測22q11.2拷貝數(shù)缺失的方法目前還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種檢測22q11.2拷貝數(shù)缺失的試劑盒。

本發(fā)明的再一的目的是，提供一種檢測22q11.2拷貝數(shù)缺失的方法。

本發(fā)明的另一的目的是，提供一種檢測22q11.2拷貝數(shù)缺失的引物組合。

本發(fā)明的第四個目的是，提供所述的引物組合的用途。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種檢測22q11.2拷貝數(shù)缺失的試劑盒，所述的試劑盒含有以CFTR基因為對照基因，檢測CLTCL1、SNAP29、KLHL22和PI4KA基因拷貝數(shù)的試劑。

進(jìn)一步地，所述的試劑盒包含操作說明書，所述的操作說明書記載有以下內(nèi)容：檢測反應(yīng)包括兩個雙重PCR反應(yīng)和一個三重PCR反應(yīng)，檢測CLTCL1、CFTR基因組合為雙重PCR反應(yīng)體系，檢測SNAP29、CFTR基因組合為雙重PCR反應(yīng)體系，檢測KLHL22、PI4KA和CFTR基因組合為三重PCR反應(yīng)體系。

進(jìn)一步地，所述的試劑盒中的引物分別為：CLTCL1上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，CLTCL1下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；SNAP29上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，SNAP29下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；KLHL22上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，KLHL22下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示；PI4KA上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，PI4KA下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示；CFTR上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示，CFTR下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示。

進(jìn)一步地，所述的試劑盒包含Mg²⁺、Taq酶、dNTP、熒光染料和引物。

進(jìn)一步地，所述的試劑盒中dNTP是限定含量的。

進(jìn)一步地，所述的操作說明書記載有以下內(nèi)容：PCR反應(yīng)體系為：2mM MgCl₂、0.4U KlenTaq酶、6.25μM dNTP、1XPlus染料、基因組DNA 50ng，引物濃度分別為：CFTR 0.125μM；CLTCL10.5μM；SNAP291μM；KLHL221μM；PI4KA 0.5μM。

為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種檢測22q11.2拷貝數(shù)缺失的方法，所述的方法包括以下步驟：先進(jìn)行限量dNTP競爭性PCR反應(yīng)，再進(jìn)行HRM分析。

進(jìn)一步地，PCR反應(yīng)及HRM分析均在實時熒光定量PCR分析儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件為95℃1分鐘預(yù)變性，35個循環(huán)的95℃變性10s、64℃退火30s；PCR擴增結(jié)束后，繼續(xù)在熒光定量PCR分析儀內(nèi)對反應(yīng)體系進(jìn)行65℃至95℃程序升溫，溫度每上升0.2℃記錄一次熒光信號，熒光信號隨溫度的變化即形成高分辨率熔解曲線。

為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種檢測22q11.2拷貝數(shù)缺失的引物組合，所述的引物組合包含用于檢測CLTCL1、SNAP29、KLHL22、PI4KA和CFTR基因的引物，引物序列分別為：CLTCL1上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，CLTCL1下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；SNAP29上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，SNAP29下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；KLHL22上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，KLHL22下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示；PI4KA上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，PI4KA下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示；CFTR上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示，CFTR下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示。

為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

如上所述的引物組合在制備檢測22q11.2拷貝數(shù)缺失的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

1、本發(fā)明的檢測方法操作簡便快捷，整個檢測過程僅包括PCR反應(yīng)及后續(xù)HRM分析過程，減短了檢測周期。

2、本發(fā)明的檢測方法實現(xiàn)了閉管操作，由于在PCR反應(yīng)中已加入熒光染料，檢測片段擴增完成后不再需要其他處理，即可進(jìn)行HRM曲線分析，有效避免污染。

3、本發(fā)明的檢測方法成本低廉，在反應(yīng)中僅需要常規(guī)PCR反應(yīng)試劑及少量熒光染料，不需要特殊的檢測及分析儀器，大大縮減了成本投入。

4、本發(fā)明選擇了合適的基因，設(shè)計了恰當(dāng)?shù)囊镄蛄?，PCR反應(yīng)體系和程序設(shè)置合理，采用本發(fā)明的檢測方法對已知22q11.2拷貝數(shù)缺失患者及正常對照樣本進(jìn)行分析，并將結(jié)果與MLPA檢測結(jié)果進(jìn)行比對，進(jìn)一步證實了該技術(shù)的高準(zhǔn)確度與可行性，在22q11.2微缺失檢測及大規(guī)模人群篩查中具有極大優(yōu)勢。

附圖說明

附圖1：22q11.2區(qū)域低拷貝重復(fù)序列分布及目標(biāo)基因定位。

附圖2：CLTCL1拷貝數(shù)檢測結(jié)果，圖中曲線分別為CFTR參考序列熔解峰及CLTCL1檢測序列熔解峰。其中，曲線1為拷貝數(shù)缺失樣本(拷貝數(shù)＝1)，曲線2為正常對照樣本(拷貝數(shù)＝2)。-dF/dT：熒光相對于溫度的一階負(fù)導(dǎo)數(shù)。

附圖3：SNAP29拷貝數(shù)檢測結(jié)果，圖中曲線分別為CFTR參考序列熔解峰及SNAP29檢測序列熔解峰。其中，曲線1為拷貝數(shù)缺失樣本(拷貝數(shù)＝1)，曲線2為正常對照樣本(拷貝數(shù)＝2)。-dF/dT：熒光相對于溫度的一階負(fù)導(dǎo)數(shù)。

附圖4：PI4KA及KLHL22拷貝數(shù)檢測結(jié)果，圖中曲線分別為CFTR參考序列熔解峰及PI4KA、KLHL22檢測序列熔解峰。其中，曲線1為拷貝數(shù)缺失樣本(拷貝數(shù)＝1)，曲線2為正常對照樣本(拷貝數(shù)＝2)，曲線3為PI4KA基因拷貝數(shù)正常、KLHL22基因拷貝數(shù)缺失樣本。-dF/dT：熒光相對于溫度的一階負(fù)導(dǎo)數(shù)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細(xì)說明。

本發(fā)明利用限量dNTP競爭性PCR結(jié)合HRM技術(shù)，建立了22q11.2拷貝數(shù)缺失快速檢測方法，針對其核心區(qū)域上的特定基因進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測。為了在檢測缺失的同時判斷缺失片段長度范圍，我們在引物設(shè)計時選擇了位于不同低拷貝重復(fù)序列間的四個基因，不同拷貝數(shù)組合對應(yīng)不同缺失范圍。

實施例1檢測方法

1、引物設(shè)計：

針對22q11.2拷貝數(shù)缺失疾病特點，選擇位于染色體22q11.2區(qū)域不同低拷貝重復(fù)序列(Low copy repeats,LCR)間的基因(LCR22A-B:CLTCL1；LCR22B-C:KLHL22；LCR22C-D:PI4KA/SNAP29)作為檢測對象(圖1)，設(shè)計四對PCR擴增引物，分別用以擴增以上基因中的片段，同時選擇位于不同染色體上的CFTR基因，設(shè)計引物以作為參考序列。引物設(shè)計時，將PCR產(chǎn)物長度控制在50-120bps，同時預(yù)測產(chǎn)物的熔解曲線和Tms值，將目標(biāo)序列和參考序列之間的Tm差異設(shè)定在2℃和10℃之間。通過搜索人類基因組數(shù)據(jù)庫確認(rèn)目標(biāo)和參考引物的特異性，同時使擴增片段盡量避開SNP位點。根據(jù)以上引物設(shè)計原則，選擇符合條件的PCR引物，PCR引物序列及產(chǎn)物長度信息如表1所示：

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物長度信息

2、PCR擴增體系：

PCR總體積為10μl，含上游與下游引物0.125μM-1μM，同時包括2mM MgCl₂，0.4U KlenTaq酶，6.25μM dNTP，1XPlus染料及基因組DNA 50ng?？倷z測體系共包括兩個雙重PCR反應(yīng)及一個三重PCR反應(yīng)，引物濃度分別為：CFTR 0.125μM；CLTCL10.5μM；SNAP291μM；KLHL221μM；PI4KA 0.5μM。

3、PCR擴增及HRM條件：

PCR及HRM反應(yīng)均在Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR分析儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件為95℃1分鐘預(yù)變性，35個循環(huán)的95℃變性10s、64℃退火30s。擴增結(jié)束后，繼續(xù)在熒光定量PCR分析儀內(nèi)對反應(yīng)體系進(jìn)行65℃至95℃程序升溫，溫度每上升0.2℃記錄一次熒光信號，熒光信號隨溫度的變化即形成高分辨率熔解曲線。

實施例2檢測方法的驗證

材料

Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR分析儀(Qiagen)，KlenTaq酶(Ab Peptides)，Plus染料(BioFire Defense)，引物(華大基因生物科技有限公司)，人基因組DNA樣本(提取自22q11.2微缺失患者及正常對照人群)。

方法

為了驗證實施例1的檢測方法，我們利用所建立體系對99例22q11.2區(qū)域拷貝數(shù)缺失患者及正常人對照樣本進(jìn)行檢測，每個標(biāo)本均進(jìn)行三次實驗重復(fù)，并以多重連接探針擴增技術(shù)(Multiplex Ligation-dependent ProbeAmplification,MLPA)對結(jié)果進(jìn)行驗證。

結(jié)果

本研究利用限量dNTP競爭性PCR結(jié)合HRM技術(shù)建立了一種22q11.2拷貝數(shù)缺失的快速檢測方法，該體系利用三個競爭PCR反應(yīng)檢測位于22q11.2不同低拷貝重復(fù)序列間的四個基因的拷貝數(shù)情況，用以判斷該染色體區(qū)域的缺失情況并確定缺失范圍。CLTCL1基因及SNAP29基因位于LCR22A-LCR22B及LCR22C-LCR22D區(qū)域，分別與CFTR參考序列組合為雙重PCR反應(yīng)，KLHL22及PI4KA位于LCR22B-LCR22C及LCR22C-LCR22D區(qū)域，與CFTR參考序列組合為三重PCR反應(yīng)體系用于拷貝數(shù)檢測。多重PCR反應(yīng)體系中，不同的擴增子由于Tm值的不同，熒光快速下降區(qū)域分布在不同的溫度區(qū)間，相互間得以區(qū)分。同時，本研究通過降低dNTP濃度，有效和可靠的控制PCR擴增，不同擴增產(chǎn)物的相對定量信息可通過熒光信號的強弱得以體現(xiàn)，因而可在雙重或三重PCR后，通過對位于不同染色體上的參考PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)化來進(jìn)行拷貝數(shù)相對定量。如圖2、3、4分別為以上三個檢測反應(yīng)的結(jié)果圖，每個檢測過程均包括目標(biāo)基因2拷貝的正常對照樣本及1拷貝的缺失患者，通過對CFTR基因的標(biāo)化，我們能明確識別CLTCL1、KLHL22、PI4KA及SNAP29的拷貝數(shù)情況。分析本方法對99例22q11.2區(qū)域拷貝數(shù)缺失患者與正常人對照樣本(38例LCR22A-LCR22D缺失，3例LCR22A-LCR22B缺失，2例LCR22A-LCR22C缺失及56例正常對照樣本)的檢測結(jié)果可知，本體系對每例標(biāo)本三次重復(fù)實驗的結(jié)果均一致，且與MLPA結(jié)果相同，靈敏性與特異性均達(dá)到100％，證明了本體系的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補充，這些改進(jìn)和補充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心

<120> 一種檢測22q11.2拷貝數(shù)缺失的方法

<130> /

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcagctcctc cagctcatct 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcatggatg gacaagagtt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtggacaag atggaccaag 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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tggggtctct actggtttgg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctctcgttcc ggtggtacat 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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ttgtgattac ctcagaaatg attga 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cattgcttct tcccagcagt 20