本發(fā)明涉及一種可注射玻尿酸/聚乙二醇水凝膠的制備方法及應(yīng)用，屬于整形、美容材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

注射美容是利用注射的方法將生物材料或人工合成的生物兼容性材料注射入真皮層或皮下，通過不同的作用機(jī)理達(dá)到減少皮膚皺褶或塑型的一大類整形手術(shù)的方法。該方法無需開刀手術(shù)，無痛苦，見效快，無副作用，安全可靠，深受大家的歡迎。其中最常見的整容填充劑有自體脂肪、玻尿酸(又名透明質(zhì)酸，HA)和膠原蛋白。自體脂肪的安全性較好，但是由于脂肪存活有限，所以難以達(dá)到理想效果。膠原蛋白會(huì)被人體吸收所以維持時(shí)間短，并且會(huì)有過敏感染等副作用。玻尿酸材料由于其快速降解而難以長久維持，需要多次填充以達(dá)到修復(fù)效果，對患者造成了一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和痛苦。在如今這種人人都追求高顏值的時(shí)代，注射美容仍不能大眾化，其中最重要的原因就是填充劑的安全性和持久性仍有待提高。因此，尋找一種安全性、塑形性和持久性都好的可注射填充材料具有重要的意義。

交聯(lián)的玻尿酸由于其生物性能優(yōu)異，降解周期較長，近年來受到廣泛地關(guān)注。玻尿酸經(jīng)過修飾改性或者引入交聯(lián)劑交聯(lián)獲得了一些毒性稍小的水凝膠，但是殘留的交聯(lián)劑或多或少會(huì)引起體內(nèi)的炎癥。聚乙二醇(PEG)無抗原性，它的生物相容性已經(jīng)得到了FDA認(rèn)證，且PEG分子量范圍大，可以通過調(diào)節(jié)其分子量來改善水凝膠的性能來滿足各種需要。并且將天然高分子HA和合成高分子PEG共混，能夠取長補(bǔ)短，這也是研究的熱門課題。在各類交聯(lián)反應(yīng)方式中，環(huán)張力促進(jìn)的疊氮-炔基環(huán)加成(SPAAC)反應(yīng)脫穎而出。首先該反應(yīng)不需要催化劑，不需要加熱光照輻射等外在條件，反應(yīng)速度快；并且疊氮基或炔基不會(huì)與生物體內(nèi)的氨基、羧基、羥基等發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，SPAAC反應(yīng)是真正的生物正交反應(yīng)。本發(fā)明在玻尿酸分子鏈上進(jìn)行環(huán)辛炔基修飾，采用疊氮化的PEG為交聯(lián)劑，通過SPAAC反應(yīng)交聯(lián)得到水凝膠。除了玻尿酸固有的優(yōu)異的生物相容性和保水性等優(yōu)點(diǎn)之外，該HA/PEG水凝膠還具有以下特點(diǎn)：交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生在將材料注射到體內(nèi)之后，能夠在體內(nèi)原位固化成形；由于PEG的引入和較高的交聯(lián)密度，能有效地延緩在體內(nèi)的降解速度，提高材料的耐久性；可以通過改變凝膠前體的組成、分子量、濃度、功能基密度等調(diào)節(jié)材料的機(jī)械強(qiáng)度和降解速度，以適應(yīng)不同應(yīng)用場合的需要。因此，本發(fā)明提出的HA/PEG水凝膠是一種兼具安全性、塑形性和持久性的美容整形材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可注射玻尿酸/聚乙二醇水凝膠的制備方法及應(yīng)用，克服現(xiàn)有玻尿酸注射劑塑形性和持久性差的缺陷。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明利用環(huán)辛炔基和疊氮基之間的環(huán)張力促進(jìn)的疊氮-炔基環(huán)加成(SPAAC)反應(yīng)對注射人體內(nèi)的玻尿酸/聚乙二醇水溶液進(jìn)行交聯(lián)，使其原位凝膠化而固化成形。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括以下步驟：(1)分別制備環(huán)辛炔修飾的玻尿酸(式I)和疊氮修飾的PEG衍生物(式II)作為水凝膠前體；(2)將環(huán)辛炔修飾的玻尿酸溶于生理鹽水或pH＝7.4的PBS緩沖溶液得到濃度為1％～10wt％的溶液A，將疊氮修飾的聚乙二醇(PEG)衍生物溶于生理鹽水或pH＝7.4的PBS緩沖溶液得到濃度為1～30wt％的溶液B；(3)在使用前將溶液A和溶液B混合制得凝膠前體混合溶液，然后將其注入體內(nèi)，原位形成所述水凝膠。

一種環(huán)辛炔修飾的玻尿酸，具有式I所示的結(jié)構(gòu)：

其中，X＝OH或環(huán)辛炔的摩爾取代度為1～30％，環(huán)辛炔修飾的玻尿酸的分子量為1萬～20萬道爾頓。

一種環(huán)辛炔修飾的玻尿酸的制備方法，包括以下步驟：將玻尿酸溶于緩沖溶液中，加入縮合劑活化后再加入氨乙氧基環(huán)辛炔進(jìn)行反應(yīng)，得到環(huán)辛炔修飾的玻尿酸；所述的縮合劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽。

所述緩沖溶液的pH＝5.5；所述氨乙氧基環(huán)辛炔溶于二甲基亞砜或二甲基甲酰胺中后加入反應(yīng)體系；玻尿酸上的羧基、氨乙氧基環(huán)辛炔與縮合劑的摩爾比為10～2：1：2。

一種疊氮修飾的聚乙二醇，具有式II所示的結(jié)構(gòu)：

其分子量為400～10000道爾頓。

一種制備疊氮修飾的聚乙二醇的方法，包括以下步驟：將化合物溶于有機(jī)溶劑中，加入三乙胺，再逐滴加入甲基磺酰氯，同時(shí)避免滴入太快引起溫度驟然升高；室溫?cái)嚢?，純化，得到化合物將和NaN₃溶于有機(jī)溶劑中，80℃反應(yīng)，冷卻至室溫后過濾除去過量的疊氮鈉，用截留分子量1000的透析袋透析，凍干后得到上述疊氮修飾的聚乙二醇。

一種可注射型玻尿酸/聚乙二醇水凝膠前體溶液的制備方法，包括以下步驟：

(1)將環(huán)辛炔修飾的玻尿酸溶于生理鹽水或pH＝7.4的PBS緩沖溶液中，得到濃度為1wt％～10wt％的溶液D；

(2)將疊氮修飾的聚乙二醇溶于生理鹽水或pH＝7.4的PBS緩沖溶液中，得到濃度為1wt％～30wt％的溶液E；

(3)將溶液D和溶液E混合均勻，制得可注射型玻尿酸/聚乙二醇水凝膠前體溶液，其中，可注射型玻尿酸/聚乙二醇水凝膠前體溶液中疊氮基和環(huán)辛炔基的摩爾比為1:3～3:1。

一種可注射型玻尿酸/聚乙二醇水凝膠前體溶液，通過上述制備方法制備得到。

一種玻尿酸/聚乙二醇水凝膠，通過以下方式制備得到：將上述可注射型玻尿酸/聚乙二醇水凝膠前體溶液置體外溫和環(huán)境中或注入體內(nèi)，，環(huán)辛炔基和疊氮基由于環(huán)張力進(jìn)行疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)，原位交聯(lián)形成玻尿酸/聚乙二醇水凝膠。

上述可注射型玻尿酸/聚乙二醇水凝膠前體溶液用于抗皺、豐乳、隆鼻。

上述玻尿酸/聚乙二醇水凝膠作為整形美容材料的應(yīng)用。

本發(fā)明制備的可注射玻尿酸/聚乙二醇水凝膠水凝膠作為皮下整容填充物的應(yīng)用時(shí)，其水凝膠前體溶液流動(dòng)性好，能夠很方便地通過注射器注入指定部位，并在體內(nèi)快速固化成水凝膠，是一種兼具安全性、塑形性和持久性的美容整形材料。

由于上述技術(shù)方案的應(yīng)用，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)本發(fā)明公開的可注射型玻尿酸/聚乙二醇水凝膠前體溶液制備方法簡單，產(chǎn)率高，無毒無刺激，在生物體內(nèi)不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。

(2)本發(fā)明制備玻尿酸/聚乙二醇水凝膠的方法為SPAAC反應(yīng)，不需要催化劑，不需要加熱、光照、輻射等外在條件，快速高效、選擇性好、能在體內(nèi)固化。

(3)本發(fā)明制備玻尿酸水凝膠過程中未使用有毒交聯(lián)劑，水凝膠的細(xì)胞毒性低。

(4)本方法制備的水凝膠通過改變兩種水凝膠前體的濃度、聚合物中官能團(tuán)的取代度、分子量和反應(yīng)配比，可以獲得不同耐酶性的水凝膠，改變水凝膠在體內(nèi)的存留時(shí)間。

(5)本發(fā)明使用的原料玻尿酸和聚乙二醇均具有良好的生物相容性，制備出的水凝膠具有良好的力學(xué)性能，優(yōu)異的生物相容性，炎癥反應(yīng)微弱，能有效的抗酶解，在體內(nèi)的存留時(shí)間長，十分適用于整容填充。

附圖說明

圖1是實(shí)施例3凝膠化前后的對比圖；其中，圖1a代表凝膠化前，圖1b代表凝膠化后。

圖2是實(shí)施例4中水凝膠的流變曲線；其中，圖2a代表水凝膠濃度為5wt％，圖2b代表水凝膠濃度為3wt％。

圖3是實(shí)施例5中水凝膠的溶脹降解圖。

圖4是實(shí)施例6中水凝膠內(nèi)部的COS-7細(xì)胞增殖率圖。

圖5是實(shí)施例6中水凝膠內(nèi)的活死細(xì)胞染色圖；其中，圖5A代表0天，圖5B代表3天。

圖6是實(shí)施例7中注入水凝膠之后小鼠的照片(圖6A)、注入三月之后小鼠的照片(圖6B)、小鼠內(nèi)取出的水凝膠照片(圖6C)以及小鼠內(nèi)水凝膠及其周圍組織的H&E染色切片圖(圖6D)。

圖7是環(huán)辛炔修飾的玻尿酸溶液和疊氮修飾的聚乙二醇溶液的反應(yīng)示意圖。

圖8是環(huán)辛炔修飾的玻尿酸的合成示意圖。

具體實(shí)施方式

下面通過結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，其目的在于幫助更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，但這些具體實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下具體實(shí)施例中所用的原料均為已知化合物，可在市場上購得，或可用本領(lǐng)域已知的方法合成。

實(shí)施例1：疊氮修飾的聚乙二醇的合成

(1)端基雙環(huán)氧PEG的合成

端基雙環(huán)氧PEG

將20.2g PEG(M_n＝6000)置于500mL燒瓶中，在120℃油浴加熱條件下用油泵抽真空干燥3h，然后加入200mL無水四氫呋喃，溶解至澄清透明后加入1.35g氫化鈉。室溫?cái)嚢柽^夜后加入5.3mL環(huán)氧氯丙烷，室溫反應(yīng)20h后過濾，濾液濃縮并在乙醚中沉淀，將所得固體真空干燥，得到19.0g白色固體端基雙環(huán)氧PEG，產(chǎn)率為94％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,TMS):δ3.57-3.74(m,CH₂of PEG chain),3.39(m,2H),3.1(m,2H),2.72(m,2H),2.54(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,TMS),δ70.5,72.8,50.4,44.2。

(2)端基四羥基PEG的合成

端基四羥基PEG

將12.2g端基雙環(huán)氧PEG溶于120mL 0.1M的氫氧化鈉溶液中，并在60℃的油浴中攪拌10h；然后用1M的鹽酸溶液中和，旋干水后，將固體溶于50mL二氯甲烷，用無水硫酸鎂干燥，過濾，濾液旋干后得到11.8g白色固體端基四羥基PEG，產(chǎn)率為97％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,TMS):δ3.57-3.74(m,CH₂of PEG chain),3.39(m,2H),2.65(OH).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,TMS):δ70.5,72.8,63.7。

(3)端基四甲磺酰基PEG的合成

端基四甲磺?；鵓EG

將2.77g端基四羥基PEG溶于20mL二氯甲烷中，加入1.4mL三乙胺，再逐滴加入2.8mL甲基磺酰氯，同時(shí)避免滴入太快引起溫度驟然升高；室溫?cái)嚢?h后，旋干二氯甲烷，加入100mL乙酸乙酯，為了促進(jìn)產(chǎn)物在乙酸乙酯中的溶解，可以加熱到40℃超聲；然后過硅藻土除去甲磺酸鹽，濾液濃縮并在乙醚中沉淀，將所得固體真空干燥，得到2.72g淡黃色粉末端基四甲磺?；鵓EG，產(chǎn)率為98％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,TMS):δ4.91(m,2H),4.35(m,4H),3.57-3.74(m,CH₂of PEG chain),3.39(m,2H),3.08(s,6H),3.03(s,6H),2.65(OH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,TMS):δ70.5,72.8,69.2,67.8,38.6,37.6。

(4)疊氮修飾的聚乙二醇的合成

疊氮修飾的聚乙二醇

向25mL圓底燒瓶中加入0.370g端基四甲磺?；鵓EG、0.08g NaN₃、5mL DMF，80℃油浴攪拌過夜，冷卻至室溫后過濾除去過量的疊氮鈉，溶于水中并用截留分子量1000的透析袋透析2天，凍干后得到0.320g白色蓬松的固體疊氮修飾的聚乙二醇，產(chǎn)率為86.5％。¹H NMR(400MHz,DMSO,TMS):δ3.88-3.94(m,2H),3.50-3.69(m,CH₂of PEG chain)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,TMS):δ70.5,72.7,72.5,53.2,50.1。

實(shí)施例2：環(huán)辛炔修飾玻尿酸的合成

(1)N-(2-((Z)-2-溴環(huán)辛-2-烯氧基)乙基)三氟乙酰胺的合成

N-(2-((Z)-2-溴環(huán)辛-2-烯氧基)乙基)三氟乙酰胺

首先將4.31g三氟甲磺酸銀置于50mL三口燒瓶中，抽空充氬氣三次；在氬氣保護(hù)下向燒瓶中注入8mL甲苯，然后將10.81g N-(2-羥基乙基)三氟乙酰胺和1.50g 8,8-二溴雙環(huán)[5.1.0]辛烷的混合溶液攪拌下逐滴加入燒瓶中。避光反應(yīng)一天后加入50mL飽和食鹽水淬滅反應(yīng)，抽濾，濾液用二氯甲烷萃取(50mL×3)，合并有機(jī)相并用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干溶劑得到粗產(chǎn)品5.14g。粗產(chǎn)品以乙酸乙酯：石油醚＝1:7(v/v)的乙酸乙酯/石油醚混合液為淋洗液進(jìn)行柱層析，旋干得到1.40g棕黃色固體N-(2-((Z)-2-溴環(huán)辛-2-烯氧基)乙基)三氟乙酰胺，產(chǎn)率為72.8％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,TMS):δ7.05(s,1H),6.22(dd,1H),3.89(dd,1H),3.67-3.48(m,4H),2.73(m,1H),2.35-2.28(m,1H),2.07-1.84(m,2H),1.77-1.68(m,2H),1.55-1.43(m,1H),1.33-1.20(m,2H),0.9-0.75(m,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,TMS):157.3,132.5,132.0,114.2,84.7,66.0,39.7,39.4,36.4,33.3,28.0,26.2。

(2)2-(環(huán)辛-2-炔氧基)乙胺的合成

2-(環(huán)辛-2-炔氧基)乙胺

取0.684g N-(2-((Z)-2-溴環(huán)辛-2-烯氧基)乙基)三氟乙酰胺置于50mL的燒瓶中，抽空充氬氣三次后于氬氣保護(hù)下注入5mL DMSO，攪拌溶解均勻后注入0.9mL DBU，油浴60℃攪拌反應(yīng)2h后補(bǔ)加2.7mL DBU，反應(yīng)一天。冷卻至室溫，然后加入含有18mL 5wt％的碳酸鉀水溶液和36mL甲醇的混合溶液，室溫下攪拌過夜，然后旋除甲醇，用二氯甲烷萃取(30mL×3)。合并有機(jī)相，無水硫酸鎂干燥之后過濾，旋干溶劑，真空干燥后得到299mg棕色液體2-(環(huán)辛-2-炔氧基)乙胺，產(chǎn)率為90％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,TMS):δ4.20(m,1H),3.60(m,1H),3.36(m,1H)；2.87(m,2H),2.26-2.15(m,3H),2.07-1.96(m,2H),1.87(m,2H),1.71-1.33(m,5H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,TMS):99.2,91.6,72.6,69.0,41.2,40.3,33.2,28.7,25.2,19.7。

(3)環(huán)辛炔修飾的玻尿酸的合成

環(huán)辛炔修飾的玻尿酸

稱取0.726g玻尿酸(M_n＝35000)溶解于50mL的MES緩沖溶液(100mM,pH＝5.5)，然后加入0.276g DMTMM，攪拌約一小時(shí)后，加入溶于6mL DMF的103mg 2-(環(huán)辛-2-炔氧基)乙胺，室溫?cái)嚢枰惶?。然后用截留分子?500的透析袋透析。先用0.1mol/L的氯化鈉溶液透析一天，然后用超純水透析三天。凍干得到709mg白色蓬松狀固體環(huán)辛炔修飾的玻尿酸。核磁氫譜見圖2。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,TMS):δ4.47-4.44(m,2H),4.28(m,1H),3.82-3.27(m,HA)，2.20-1.0(m,炔環(huán)上的氫)。

實(shí)施例3：SPAAC反應(yīng)制備水凝膠

將實(shí)施例1制備的疊氮修飾的聚乙二醇、實(shí)施例2制備的環(huán)辛炔修飾的玻尿酸分別溶于pH＝7.4的PBS緩沖溶液中，配制濃度范圍為1wt％～10wt％的環(huán)辛炔修飾的玻尿酸溶液以及濃度按照炔基官能團(tuán)的摩爾量改變的疊氮修飾的聚乙二醇溶液。將環(huán)辛炔修飾的玻尿酸溶液和疊氮修飾的聚乙二醇溶液混合后渦旋半分鐘，置入37℃的恒溫水浴中，靜置3～50min，可得到不同濃度、摩爾比炔基/疊氮＝1:0.5、1:1、1:2、1:3的水凝膠。圖1是水凝膠前后的對比圖。

實(shí)施例4：流變性能測試

對實(shí)施例3的水凝膠進(jìn)行震蕩流變測試，考察交聯(lián)的過程以及所形成水凝膠的強(qiáng)度。流變測試使用HAAKE RS6000應(yīng)變控制流變儀進(jìn)行水凝膠的震蕩流變測試。夾具為4°椎角的40mm椎板，頻率為1rad/s，振幅為1％，溫度設(shè)定為37℃。將將環(huán)辛炔修飾的玻尿酸溶液和疊氮修飾的聚乙二醇溶液按炔基/疊氮為固定的摩爾比混合后渦旋30s，加入流變儀中。2min后樣品溫度上升至37℃，記錄彈性模量G′和粘性模量G″。結(jié)果如圖2所示。彈性模量G′描述水凝膠對彈性形變的物理抵抗性方面的凝膠強(qiáng)度，粘性模量G″描述水凝膠對粘性形變的物理抵抗性方面的凝膠強(qiáng)度。G′和G″的相交位置即為凝膠點(diǎn)，凝膠點(diǎn)的橫坐標(biāo)就是凝膠時(shí)間?？梢钥闯瞿z前體濃度越大凝膠時(shí)間越短。

實(shí)施例5：水凝膠的溶脹與降解性的測試

溶脹降解實(shí)驗(yàn)觀察水凝膠在不同pH條件下水凝膠的溶脹、降解行為以及在透明質(zhì)酸酶存在條件下的降解行為，判斷交聯(lián)玻尿酸的對pH的敏感性以及抗酶解能力。具體如下：120μL水凝膠樣品中加入不含透明質(zhì)酸酶或者含50U透明質(zhì)酸酶的中性PBS緩沖溶液，置于37℃的水浴搖床中，震蕩速率為60rpm。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，小心倒出水凝膠上層的溶液，濾干，稱重，然后再加入新鮮的培養(yǎng)液；重復(fù)這一過程直至水凝膠消失。每次試驗(yàn)重復(fù)三次。用如下公式計(jì)算：

其中，Δw代表水凝膠重量變化，w₀和w_i分別代表水凝膠溶脹前的重量、溶脹后的重量。50U的透明質(zhì)酸酶濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體內(nèi)的透明質(zhì)酸酶濃度，由圖3可以看出該水凝膠的酶降解速率低，抗酶解能力優(yōu)異。調(diào)節(jié)水凝膠前體的濃度可以獲得不同耐酶性的水凝膠。該水凝膠的長久性凸顯了其用于皮下注射整容的優(yōu)勢。

實(shí)施例6：水凝膠的細(xì)胞相容性測試

首先配制無菌的含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基溶液，然后用該培養(yǎng)基配制兩水凝膠前體溶液，過0.22um的微孔濾膜過濾除菌。然后將環(huán)辛炔修飾的玻尿酸溶液和疊氮修飾的聚乙二醇溶液混勻，然后混入COS-7細(xì)胞，制得細(xì)胞密度為2.5×10⁵細(xì)胞/mL的混合溶液。將此包載細(xì)胞的混合溶液加入96孔板中，每孔加樣64uL，然后將培養(yǎng)板放入37℃、5％CO₂(v/v)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，形成厚度約2mm的細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物(3wt％，1:1)。然后向每孔中加入100uL培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在第0、1、2、3天用CCK-8試劑測定水凝膠內(nèi)部細(xì)胞增殖率。方法為：每孔中加入10uL的CCK-8溶液，再培養(yǎng)4h后取出，用Multiskan GO microplate spectrophoto meter酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，USA)測定450nm處的吸光度。將不加細(xì)胞的水凝膠作為空白背景，初始細(xì)胞數(shù)作為對照，細(xì)胞增殖率＝[(OD樣品-OD空白背景)/(OD初始細(xì)胞-OD空白背景)]×100％。所有實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行四個(gè)獨(dú)立的平行樣，測試結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。水凝膠內(nèi)部的活死細(xì)胞狀況通過采用Live-Dead試劑染色之后用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，操作方法參考試劑操作手冊。圖4為水凝膠內(nèi)部的COS-7細(xì)胞增殖率，可以看出細(xì)胞在水凝膠內(nèi)增殖很快，存活率高。圖5為水凝膠內(nèi)部的活死細(xì)胞情況，亮點(diǎn)代表活細(xì)胞，可以看出活細(xì)胞隨著時(shí)間推移不斷增加，證明了細(xì)胞在水凝膠內(nèi)部生長良好。

實(shí)施例7：水凝膠的體內(nèi)生物相容性實(shí)驗(yàn)

ICR小鼠后背去毛，消毒，將240μL環(huán)辛炔修飾的玻尿酸溶液和疊氮修飾的聚乙二醇溶液快速混合后，將得到的水凝膠前體溶液通過24G針頭注射到小鼠后背的皮下部位；注射30分鐘后將一只小鼠實(shí)施安樂死，觀察水凝膠在小鼠體內(nèi)形成情況及形貌；余下的小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，分別在水凝膠前體溶液注射后的1周、2周、4周、8周各將兩只小鼠實(shí)施安樂死，并馬上將水凝膠及周圍組織取出，浸入4wt％的多聚甲醛溶液中固定；固定足夠時(shí)間后，將樣品包埋于石蠟中，切成厚度約為4微米的薄片；切片用蘇木精-曙紅(HE)試劑染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察免疫反應(yīng)。

將水凝膠前體溶液皮下注射到小鼠的背部，在注射部位形成圓形的突起部分如圖6A所示。注射30分鐘后將一只小鼠處死，可以觀察到在小鼠體內(nèi)形成的透明水凝膠，取出的水凝膠見圖6C。這證明了注射到生物體內(nèi)的水凝膠前體溶液能夠發(fā)生快速的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，原位生成水凝膠。三個(gè)月后在老鼠背部皮下仍能看到明顯的鼓包，見圖6B，表明水凝膠仍然存在，取出水凝膠時(shí)，發(fā)現(xiàn)水凝膠保持完整的形貌與組織相融，稍有變小，沒有破碎解體。說明該水凝膠的體內(nèi)存在周期較長。注射4周后，取出的水凝膠及其周圍組織的H&E染色結(jié)果如圖6D所示，只有極其微弱的炎癥。整個(gè)過程未出現(xiàn)如變色、化膿或浮腫等不良反應(yīng)。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了該可注射水凝膠對生物體有良好的生物相容性。