本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸酯類增塑劑單鏈DNA核酸適配體及其篩選與表征方法及應(yīng)用其的電化學(xué)傳感器，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)(Phthalate Esters或Phthalic Acid Esters,PAEs)是鄰苯二甲酸形成的酯的統(tǒng)稱，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是由一個(gè)平面芳烴和兩個(gè)脂肪側(cè)鏈組成。PAEs主要用于聚氯乙烯材料，使聚氯乙烯由硬塑膠變?yōu)橛袕椥缘乃苣z，起到增塑的作用。PAEs被廣泛應(yīng)用于玩具、食品包裝材料、醫(yī)用血袋和膠管、乙烯地板和壁紙、清潔劑、潤(rùn)滑油、個(gè)人護(hù)理用品(如指甲油、頭發(fā)噴霧劑、香皂和洗發(fā)液)等數(shù)百種產(chǎn)品中。

PAEs是酯類化合物中較難降解的一類持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants，POPs)，也是公認(rèn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。PAEs是一類脂溶性物質(zhì)，可通過(guò)呼吸、飲食和皮膚接觸進(jìn)入人體，對(duì)人體造成危害。研究表明PAEs在人體和動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮著類似雌性激素的作用，可干擾內(nèi)分泌，使男子精液量和精子數(shù)量減少，精子運(yùn)動(dòng)能力低下，精子形態(tài)異常，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致睪丸癌，是造成男子生殖問(wèn)題的“罪魁禍?zhǔn)住?。它還會(huì)增加女性患乳腺癌的幾率，還會(huì) 危害到她們未來(lái)生育的男嬰的生殖系統(tǒng)。目前被認(rèn)為是有害物質(zhì)的PAEs為15種，其中鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)、鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP)6種已被歐盟列為總檢出量必須低于1％的對(duì)人體和環(huán)境有害的物質(zhì)。我國(guó)對(duì)生活飲用水、地表水和污水處理廠的污染物排放標(biāo)準(zhǔn)中都對(duì)多種PAEs有著明確限值。由于DBP潛在的內(nèi)分泌干擾毒性最大，其限值均最低。比如我國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB5749-2006)對(duì)DBP的限值低達(dá)0.003mg/L(～1nM,3ppb)?，F(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外對(duì)增塑劑的檢測(cè)還僅限于大型儀器，比如高效液相和質(zhì)譜，不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高效和及時(shí)的監(jiān)測(cè)。如何快速、準(zhǔn)確、直接有效地檢測(cè)食品和水體中的增塑劑，是環(huán)境和食品安全等相關(guān)科研工作者熱切期待能夠解決的技術(shù)難題。

核酸適配體是通過(guò)SELEX技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,即系統(tǒng)指數(shù)富集的適配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù))獲得的單鏈或雙鏈的DNA或RNA(Nature,1990,346,818-822；Nature,1992,355,564-566)。核酸適配體能夠特異性識(shí)別包括蛋白質(zhì)、小分子、細(xì)胞和組織在內(nèi)的多種多樣的靶分子，其穩(wěn)定性高，易于合成和修飾，成本低，在生物傳感、成像和藥物研發(fā)等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，通過(guò)體外篩選技術(shù)獲得的核酸適配體有很多，很多已經(jīng)實(shí)現(xiàn)在線快速高靈敏檢測(cè)，但是未見到特異性識(shí)別鄰苯二甲酸酯類增塑劑核酸適配體的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種鄰苯二甲酸酯類增塑劑單鏈DNA核酸適配體及其篩選與表征方法及應(yīng)用其的電化學(xué)傳感器。本發(fā)明是利用SELEX技術(shù)篩選出能夠與DBP等鄰苯二甲酸酯類增塑劑特異性和高親和力結(jié)合的單鏈DNA核酸適配體序列，并利用該核酸適配體構(gòu)建能夠?qū)BP等鄰苯二甲酸酯類增塑劑進(jìn)行高靈敏和高特異性檢測(cè)的電化學(xué)傳感器。

本發(fā)明提供的一種與鄰苯二甲酸酯類增塑劑具有高特異性和高親和力的單鏈DNA核酸適配體。該核酸適配體的單鏈DNA序列高度富集，來(lái)自同一富含C堿基家族:5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACN_1-4TCCCACGCATTCTCCACAT3'和/或者為其單堿基或雙堿基的變異體。其中高通量測(cè)序中出現(xiàn)頻率最高的兩條核酸適配體分別為：DBP-1：5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT3'，和DBP-2:5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACAGGTCCCACGCATTCTCCACAT3'。

本發(fā)明提供的一種鄰苯二甲酸酯類增塑劑單鏈DNA核酸適配體的篩選與表征及應(yīng)用其的電化學(xué)傳感器的方法，包括如下步驟：步驟一：通過(guò)化學(xué)合成制備在其中一條線性脂肪側(cè)鏈的末端具有氨基基團(tuán)的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的衍生物(DBP-NH₂)；步驟二：通過(guò)氨基與瓊脂糖微球上的環(huán)氧乙烷活化基團(tuán)進(jìn)行縮合反應(yīng)將DBP-NH₂共價(jià)連接到瓊脂糖微球上；步驟三：進(jìn)行基于固相分離的DNA核酸適配體的SELEX篩選；步驟四：篩選后對(duì)獲得的富集文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序；步驟五：對(duì)高通量測(cè)序中出現(xiàn)頻率最高的兩條序列DBP-1和DBP-2進(jìn)行親和力和選擇性的測(cè)試；步驟六：構(gòu)建基于DBP-1的電化學(xué)傳感器。

本發(fā)明還提供一種基于上述核酸適配體的電化學(xué)生物傳感器，其 信號(hào)探針為DBP-1-10T-C-Fc或者DBP-1-C-Fc。

本發(fā)明通過(guò)化學(xué)合成制備了在其中一條線性脂肪側(cè)鏈的末端具有氨基基團(tuán)的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的衍生物(DBP-NH₂)。然后通過(guò)氨基與瓊脂糖微球上的環(huán)氧乙烷活化基團(tuán)進(jìn)行縮合反應(yīng)將DBP-NH₂共價(jià)連接到瓊脂糖微球上。隨后進(jìn)行基于固相分離的核酸適配體篩選。4輪篩選后對(duì)獲得的富集文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)頻率最高的前100條DNA序列均來(lái)自同一家族。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)出現(xiàn)頻率最高的2條核酸適配體(DBP-1和DBP-2)對(duì)DBP-NH₂的親和力進(jìn)行測(cè)試，分別為70±5nM和100±5nM。DBP-1和DBP-2對(duì)DBP、DEHP、BBP的親和力比對(duì)DBP-NH₂的親和力高1.5-4.0倍。DBP-1和DBP-2均對(duì)DBP、DEHP、BBP具有很好的專一性，對(duì)葡萄糖、卡那霉素和乙醇等小分子和重金屬離子(Hg²⁺,Pb²⁺,Ni²⁺,Cd²⁺)沒有顯著的親合力?；谠摵怂徇m配體構(gòu)建了DBP電化學(xué)傳感器。該傳感器對(duì)DBP具有很好的選擇性和靈敏度。檢出限達(dá)到10pM，動(dòng)力學(xué)區(qū)間10pM-1mM。由于鄰苯二甲酸酯類增塑劑的結(jié)構(gòu)相似性，可以預(yù)計(jì)本發(fā)明的核酸適配體對(duì)其它鄰苯二甲酸酯類增塑劑也應(yīng)該具有高的親和力和選擇性。

本發(fā)明具有如下特征和技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

(1)本發(fā)明獲得的單鏈DNA核酸適配體序列，與DBP、BBP和DEHP均具有很高的親和力(解離常數(shù)K_d分別在nM范圍)，且具有很好的專一性。由于鄰苯二甲酸酯類增塑劑的結(jié)構(gòu)相似性，可以預(yù)計(jì)本發(fā)明的核酸適配體對(duì)其它鄰苯二甲酸酯類增塑劑也應(yīng)該具有高的親和力和選擇性。

(2)本發(fā)明中靶分子固相固定方式是首先將DBP的疏水側(cè)鏈進(jìn)行化學(xué)修飾獲得DBP-NH₂，然后通過(guò)氨基和環(huán)氧基團(tuán)之間的縮合反應(yīng)將DBP-NH₂共價(jià)連接到環(huán)氧乙烷活化的瓊脂糖微球上，使得鄰苯二甲酸二酯基團(tuán)暴露在微球的表面，這樣就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)鄰苯二甲酸酯類增塑劑共同官能團(tuán)的篩選，而不是僅篩選一種特定的鄰苯二甲酸酯類增塑劑。

(3)(2)中所提及的靶分子固相固定方式還可以大幅減小界面的非特異性吸附和減少篩選輪數(shù)，本發(fā)明結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，僅通過(guò)4輪篩選就獲得了高度富集的核酸適配體。

(4)本發(fā)明的鄰苯二甲酸酯類增塑劑的核酸適配體引物區(qū)序列沒有參與與靶分子的結(jié)合，這樣既可以省去工程化設(shè)計(jì)的復(fù)雜工作，又可以由于探針長(zhǎng)度較短而大幅降低傳感器的成本和簡(jiǎn)化傳感器設(shè)計(jì)，非常便于該核酸適配體的應(yīng)用。

(5)該核酸適配體序列可以與包括電化學(xué)傳感器在內(nèi)的各種各樣的傳感平臺(tái)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)鄰苯二甲酸酯類增塑劑的高靈敏和高特異性地檢測(cè)；與基于大型儀器的檢測(cè)技術(shù)相比，基于核酸適配體的傳感器制備方法簡(jiǎn)單、操作更為便捷、成本低、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

本發(fā)明利用核酸適配體的體外篩選技術(shù)(SELEX：指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)技術(shù))，從化學(xué)合成的隨機(jī)DNA文庫(kù)中篩選獲得與鄰苯二甲酸酯類增塑劑具有高特異性和高親和力的單鏈DNA核酸適配 體。為食品與環(huán)境中鄰苯二甲酸酯類增塑劑的檢測(cè)新方法的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明通過(guò)化學(xué)合成制備了在其中一條線性脂肪側(cè)鏈的末端具有氨基基團(tuán)的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的衍生物(DBP-NH₂)。然后通過(guò)氨基與瓊脂糖微球上的環(huán)氧乙烷活化基團(tuán)進(jìn)行縮合反應(yīng)將DBP-NH₂共價(jià)連接到瓊脂糖微球上。隨后進(jìn)行基于固相分離的核酸適配體篩選。4輪篩選后對(duì)獲得的富集文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)頻率最高的前100條DNA序列均來(lái)自同一家族。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)出現(xiàn)頻率最高的2條核酸適配體,DBP-1和DBP-2，對(duì)DBP-NH₂的親和力進(jìn)行測(cè)試，分別為70±5nM和100±5nM。DBP-1和DBP-2對(duì)DBP、DEHP、BBP的親和力比對(duì)DBP-NH₂的親和力高1.4-4.0倍。DBP-1和DBP-2均具有很好的專一性，相對(duì)親和力比葡萄糖、卡那霉素、氨芐西林和乙醇等代表性干擾物高240-1100倍。基于該核酸適配體構(gòu)建了DBP電化學(xué)傳感器。該傳感器對(duì)DBP具有很好的選擇性和靈敏度。檢出限達(dá)到10pM，動(dòng)力學(xué)區(qū)間10pM-1mM。由于鄰苯二甲酸酯類增塑劑的結(jié)構(gòu)相似性，可以預(yù)計(jì)本發(fā)明的核酸適配體對(duì)其它鄰苯二甲酸酯類增塑劑也應(yīng)該具有高的親和力和選擇性。本發(fā)明彌補(bǔ)了尚無(wú)鄰苯二甲酸酯類化合物核酸適配體的空缺。做為一種具有高親和力和特異性的生物識(shí)別，本發(fā)明的核酸適配體可以用于開發(fā)各種各樣的檢測(cè)技術(shù)和生物傳感器。為食品或環(huán)境中的鄰苯二甲酸酯類增塑劑的便捷檢測(cè)有著重要應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明進(jìn)行鄰苯二甲酸酯類增塑劑單鏈DNA核酸適配體篩選的技術(shù)路線圖。

圖2是本發(fā)明中DBP-NH₂的合成路線圖。

圖3是本發(fā)明中DBP-NH-Boc(化合物2)的一維核磁氫譜的表征數(shù)據(jù)。

圖4是本發(fā)明中DBP-NH₂(化合物3)的電噴霧質(zhì)譜表征數(shù)據(jù)。

圖5是本發(fā)明利用熒光倒置顯微鏡分別表征兩條富集效率最高的核酸適配體(DBP-1和DBP-2)對(duì)DBP-NH₂修飾瓊脂糖微球的親和力和選擇性的熒光圖片：(a)未修飾DBP-NH₂的瓊脂糖微球；(b)與DBP-1-FAM和DBP-2-FAM孵育后的未修飾DBP-NH₂的瓊脂糖微球；(c)與DBP-1-FAM和DBP-2-FAM孵育后的DBP-NH₂修飾的瓊脂糖微球。

圖6是本發(fā)明利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別測(cè)定DBP-1(a)和DBP-2(b)對(duì)DBP-NH₂的親和力的數(shù)據(jù)圖。

圖7是本發(fā)明利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)DBP-1(a)和DBP-2(b)對(duì)DBP-NH₂、BBP、DBP、DEHP及對(duì)選擇性測(cè)試溶液的相對(duì)親和力測(cè)試數(shù)據(jù)，相對(duì)親和力的數(shù)值為各測(cè)試樣品競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)的DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR的數(shù)量除以選擇性測(cè)試溶液存在時(shí)競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)的DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR的數(shù)量。

圖8是本發(fā)明基于DBP-1構(gòu)建的電化學(xué)傳感器的原理圖(a)、檢測(cè)不同濃度的16種PAE混和標(biāo)準(zhǔn)品的方波伏安曲線(b、c)和對(duì)重金屬離子(Hg²⁺,Pb²⁺,Ni²⁺)和抗生素(10μM卡那霉素和10μM磺胺地索辛混 合樣品)的選擇性測(cè)試(d)。其中(b)和(c)分別對(duì)應(yīng)使用DBP-1-10T-C-Fc和DBP-1-C-Fc做為信號(hào)探針的傳感器。

具體實(shí)施方式

表1：本發(fā)明中使用的核酸探針序列(表中下劃線的序列為PCR中與引物結(jié)合的區(qū)域)

表2本發(fā)明中通過(guò)高通量測(cè)序獲得的出現(xiàn)頻率最高的前100條核酸序列(5'-3')

以高通量測(cè)序中序列出現(xiàn)頻率從高到低排序。第一條序列的下劃線部分是高度富集的保守序列。其它序列中的黑體加下劃線的是與序列1相比的變異的部分。

實(shí)施例1:利用SELEX和高通量測(cè)序技術(shù)篩選鄰苯二甲酸酯類增塑劑的單鏈DNA核酸適配體的技術(shù)路線

如圖1所示，本發(fā)明的利用SELEX和高通量測(cè)序技術(shù)篩選鄰苯二甲酸酯類增塑劑的單鏈DNA核酸適配體的技術(shù)路線包括以下步驟：(1)DBP-NH₂的化學(xué)合成與表征；(2)DBP-NH₂與環(huán)氧活化的瓊脂糖微球(Epoxy-activated Sepharose^TM6B)的偶聯(lián)與表征；(3)將6×10¹⁴(1nmol)的商業(yè)合成的起始單鏈DNA文庫(kù)(pool₀，表1)與DBP-NH₂偶聯(lián)的瓊脂糖微球混合孵育；(4)將結(jié)合了核酸適配體的瓊脂糖微球與沒有與瓊脂糖微球結(jié)合的DNA序列進(jìn)行分離和沖洗；(5)對(duì)沖洗后的瓊脂糖微球上的核酸適配體進(jìn)行熱洗脫；(6)采用5端磷酸根修飾的反相引物(PO₄-RP-SELEX，表1)和正向引物(FP-SELEX，表1)，將洗脫下來(lái)的核酸適配體進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(7)進(jìn)行λ外切酶反應(yīng)將磷酸根修飾的互補(bǔ)鏈降解，低成本制備單鏈DNA文庫(kù)，該文庫(kù)進(jìn)入下一個(gè)篩選循環(huán)；(8)4輪SELEX后的文庫(kù)(pool₄)進(jìn)行高通量測(cè)序；(9)對(duì)出現(xiàn)頻率最高的兩條核酸適配體DBP-1和DBP-2進(jìn)行親和力和選擇性表征。

實(shí)施例2:DBP的氨基衍生物(DBP-NH₂)的合成與表征

DBP-NH₂的合成路線如圖2所示。本實(shí)施例中所用的試劑均為分析純，各步反應(yīng)過(guò)程均用薄層色譜進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱進(jìn)行分離純化。具體的合成方法、條件和表征如下(1-3)所述：

(1)鄰苯二甲酸單丁酯(化合物1)的制備

在含有鄰苯二甲酸酸酐(8.5g，57mmol)和無(wú)水處理的四氫呋喃(7.5毫升)及潔凈干燥的磁子的50毫升干燥的圓底燒瓶中加入正 丁醇(5毫升)，在磁力攪拌下60℃加熱回流9小時(shí)。有不溶的白色固體生成。放置室溫后抽濾，用四氫呋喃洗瓶子后再次抽濾。旋蒸后得白色漿狀物質(zhì)。加入CH₂Cl₂后，有白色沉淀。抽濾旋蒸得到油狀液體。加入100毫升去離子水，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，用飽和NaCl萃取有機(jī)相1次，最后用無(wú)水Na₂SO₄干燥有機(jī)相，放置過(guò)夜。過(guò)濾，旋干得10.986g，經(jīng)硅膠柱分離純化(二氯甲烷/甲醇(95:5)為流動(dòng)相)。旋干后抽真空得2.1g鄰苯二甲酸單丁酯(化合物1)。高效液相色譜(Agilent 1200)分離為單峰，產(chǎn)物純凈。

(2)DCC縮合產(chǎn)物(化合物2)的制備

本實(shí)驗(yàn)中鄰苯二甲酸單丁酯(化合物1)和5-(N-叔丁氧基氨基)-1-戊醇按1:1.2投料。20mL無(wú)水四氫呋喃中加入鄰苯二甲酸單丁酯(1.158g)，磁力攪拌及冰水浴下，加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，5.495g)。10分鐘后加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.217g)，20分鐘后加入5-(N-叔丁氧基氨基)-1-戊醇(1.723g，溶于5ml的無(wú)水四氫呋喃，逐滴加入)。在冰水浴攪拌1小時(shí)后，撤冰水浴室溫反應(yīng)24小時(shí)。將反應(yīng)液進(jìn)行抽濾，用無(wú)水的四氫呋喃洗滌燒瓶，抽濾，將濾液旋蒸。加入20毫升石油醚洗滌，抽濾。置于冰箱過(guò)夜抽濾，用石油醚洗滌燒瓶抽濾，旋蒸。接著過(guò)硅膠柱純化產(chǎn)品(洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝4:1(v:v))，旋蒸。純化后得到約0.5g DCC縮合產(chǎn)物(化合物2)。一維核磁氫譜表征(VNMRS-600兆赫，TMS為內(nèi)標(biāo)，CDCl ₃為溶劑)證實(shí)得到預(yù)期的化合物2(圖3)。

(3)烷基鏈末端氨基修飾的DBP衍生物(DBP-NH₂)(化合物3) 的制備

將DCC縮合產(chǎn)物(化合物2)(0.5g)，二氯甲烷(DCM，2毫升)和三氟乙酸(TFA，2毫升)加入三頸燒瓶中，在室溫下磁力攪拌40分鐘。然后將混合物過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得油狀液體。油性液體用乙酸乙酯萃取三次,并用飽和NaHCO₃洗滌一次，用無(wú)水硫酸鈉干燥。最后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到0.1g DBP-NH₂。電噴霧質(zhì)譜(Agilent LC/SMDTOF)顯示分子離子峰為308.1856，與化合物3(C₁₇H₂₅O₄N)的理論分子量吻合(圖4)，說(shuō)明成功制備了化合物3。

實(shí)施例3:DBP-NH₂在環(huán)氧活化的瓊脂糖微球上的偶聯(lián)

將0.1g環(huán)氧活化的瓊脂糖微球加去離子水溶脹，并用20mL去離子水反復(fù)洗滌，獲得350μL濕球。然后用0.2M Na₂CO₃(pH≈12)洗滌瓊脂糖球。在500μL反應(yīng)體系中加入46.7mg(0.15mmol)DBP-NH₂，置于室溫條件下振蕩反應(yīng)48小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后用pH 4.5的醋酸鈉緩沖溶液(0.1M醋酸鈉，0.5M NaCl)和pH 12碳酸鈉緩沖溶液(0.2M NaHCO₃/Na₂CO₃，0.5M NaCl)反復(fù)交替洗滌瓊脂糖微球三次，最后用水洗滌，并定容至500μL，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。元素分?Elementar Vario MICROCUBE，德國(guó))表明瓊脂糖球的各組成元素C，H，N，S所占的比例分別為33.61％，9.26％，0.92％和1.09％。偶聯(lián)DBP-NH₂之后，各組成元素C，H，N，S所占的比例分別為50.21％，7.88％，2.3％和0.9％,其中偶聯(lián)后C和N比例的大幅增加證實(shí)了DBP-NH₂成功地偶聯(lián)在環(huán)氧活化的瓊脂糖微球上。

實(shí)施例4:SELEX篩選

本發(fā)明篩選所用的隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)(Pool₀，表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化。Pool₀全長(zhǎng)80個(gè)堿基，包括兩端長(zhǎng)度為20個(gè)堿基的固定序列和中間40個(gè)堿基長(zhǎng)度的隨機(jī)序列。固定序列是SELEX的PCR步驟中分別與上游引物(FP-SELEX，表1)和下游引物(PO₄-RP-SELEX，表1)的結(jié)合區(qū)域。上游引物和下游引物均由寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)合成。其中下游引物5’端進(jìn)行磷酸化修飾。Pool₀、FP-SELEX和PO₄-RP-SELEX均用1×Tris-EDTA緩沖液(10mM Tris,1mM EDTA,pH 8.0)配制成100μM的儲(chǔ)存液，于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

第一輪篩選：將1nmole的Pool₀(100μM儲(chǔ)存液，10μL)稀釋在490μL的結(jié)合緩沖液BB中(20mM Tris，100mM氯化鈉，2mM氯化鎂，5mM氯化鉀，1mM氯化鈣，1％Tween20，0.03％triton X-100，2％DMSO，pH 7.9)。將上述溶液于95℃加熱10分鐘，冰水浴淬冷5分鐘，放至室溫。將實(shí)施例3中制備的連接了DBP-NH₂的瓊脂糖微球(100μL)用結(jié)合緩沖液BB洗滌三次。然后將在上述洗滌后的瓊脂糖微球中加入上述熱處理后的pool₀溶液，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1小時(shí)。用10K超濾管分離，將瓊脂糖球用結(jié)合緩沖液BB洗滌三次后，加入100μL結(jié)合緩沖液BB，在90℃震蕩加熱十分鐘后用超濾管分離，收集上清液。將洗脫液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)的總體積為2mL。所獲得的PCR產(chǎn)物用PAGE進(jìn)行定性表征后用乙醇沉淀法純化PCR產(chǎn)物。然后用Lamda核酸外切酶 消化法進(jìn)行單鏈DNA的制備，再用乙醇沉淀法純化獲得富集的單鏈DNA文庫(kù)Pool₁。

第2-4輪SELEX：將第一輪SELEX獲得的Pool復(fù)溶后定量，投入約300pmol進(jìn)行下一輪的篩選，具體篩選過(guò)程與條件與第一輪篩選相同。最后獲得富集的單鏈DNA文庫(kù)Pool₄。

實(shí)施例5:Pool₄的高通量測(cè)序分析

將Pool₄送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。高通量測(cè)序結(jié)果(表2)顯示出現(xiàn)頻率最高的前100條單鏈DNA序列高度富集，來(lái)自同一家族(5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACN_1-4TCCCACGCATTCTCCACAT3')，而且富含C堿基。其中出現(xiàn)頻率最高的前2條單鏈DNA序列分別為：

DBP-1：5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT3'(39個(gè)堿基)

DBP-2:5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACAGGTCCCACGCATTCTCCACAT3'(41個(gè)堿基)

這兩個(gè)核酸適配體僅相差2個(gè)堿基(下劃線標(biāo)出)。

實(shí)施例6:利用熒光倒置顯微鏡測(cè)定DBP-1和DBP-2對(duì)DBP-NH₂修飾瓊脂糖微球的親和力和選擇性

將5’端熒光基團(tuán)FAM修飾的DBP-1和DBP-2(1μM，DBP-1-FAM和DBP-2-FAM，表1，上海生工生物技術(shù)有限公司)分別與空白和10μL DBP-NH₂修飾的瓊脂糖微球在200μL結(jié)合緩沖液BB中孵育1小時(shí)，清洗后放于干凈的載玻片上，利用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

如圖5所示，瓊脂糖微球本身熒光很弱(a)；與DBP-1-FAM和DBP-2-FAM孵育后的空白瓊脂糖微球的熒光也很弱(b)；與DBP-1-FAM和DBP-2-FAM孵育后的DBP-NH₂修飾的瓊脂糖微球均顯示強(qiáng)的熒光亮度(c)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明DBP-1和DBP-2均對(duì)DBP-NH₂修飾的瓊脂糖微球有較強(qiáng)的親和力，而且是選擇性地與微球表面的DBP-NH₂結(jié)合，不與瓊脂糖微球基底結(jié)合。其中與DBP-1-FAM孵育后的DBP-NH₂修飾的瓊脂糖微球的熒光亮度率高于DBP-2-FAM孵育后的DBP-NH₂修飾的瓊脂糖微球，說(shuō)明DBP-1對(duì)DBP-NH₂的親和力比DBP-2略高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，DBP-1和DBP-2無(wú)需Pool的引物區(qū)序列參與就能夠?qū)BP-NH₂具有很好的親和力和選擇性，這樣既可以省去工程化設(shè)計(jì)的復(fù)雜工作，又可以由于探針長(zhǎng)度較短而大幅降低傳感器的成本和簡(jiǎn)化傳感器設(shè)計(jì)，非常便于該核酸適配體的應(yīng)用。

實(shí)施例7:實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(RT-PCR)測(cè)定DBP-1和DBP-2對(duì)DBP-NH₂的親和力

(1)用于親和力測(cè)試的核酸適配體探針的設(shè)計(jì)與合成

本實(shí)施例中利用RT-PCR技術(shù)定量與DMP-NH₂修飾的磁珠結(jié)合的核酸適配體的數(shù)量。為此，分別在DBP-1和DBP-2的兩端加上用于PCR擴(kuò)增的引物區(qū)，得到兩條序列DBP-1-RT-PCR和DBP-2-RT-PCR(表1，上海生工生物技術(shù)有限公司)。值得指出的是在該試驗(yàn)中所采用的引物 區(qū)序列與SELEX篩選過(guò)程中所使用的引物區(qū)不同，如果測(cè)試結(jié)果表明核酸適配體仍然具有親和性，將充分證明DBP-1和DBP-2無(wú)需Pool的引物區(qū)序列參與就能夠?qū)BP-NH₂具有很好的親和力和選擇性。

(2)DBP-NH₂修飾的磁珠的制備

吸取100μL Dynabeads^TM M-270羧酸修飾的磁珠，與100μL 25mM的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液(MES，pH 5.0)充分混合10分鐘。將離心管放置于強(qiáng)力磁鐵上4分鐘進(jìn)行磁性分離，除去上清液后用200μL MES溶液清洗兩次。在上述MES溶液中分別新鮮制備50mg/mL的EDC溶液和50mg/mL的NHS溶液。依次加入100μL的上述EDC溶液和100μL的上述NHS溶液于洗過(guò)的磁珠中，充分混勻，室溫下低速振搖30分鐘。將離心管放置于強(qiáng)力磁鐵上4分鐘，移去上清液。用200μL MES溶液清洗2次。然后向活化后的磁珠中加入6μL 100mM的DBP-NH₂，加入MES溶液,使溶液最終體積為300μL。充分混勻,在室溫下孵育30分鐘。在強(qiáng)力磁體上放置4分鐘，移去上清液。用200μL結(jié)合緩沖溶液清洗4次。最后加入100μL 1XPBS(NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄10mM，KH₂PO₄ 2mM，pH 7.4)，放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(3)親和力(解離常數(shù)K_d)的測(cè)定

在結(jié)合緩沖液BB中配置不同濃度的DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR(1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、50nM、75nM、100nM、200nM、300nM)。上述核酸適配體溶液分別加入等量的步驟(2)所制備的DBP-NH₂修飾的M-270磁珠(10μL)，室溫孵育30分鐘。在強(qiáng)力磁體上放置4分鐘后，移去上清液。用200μL結(jié)合緩沖 溶液清洗4次。加入100μL結(jié)合緩沖液BB，在90℃震蕩加熱十分鐘后進(jìn)行磁性分離，收集上清液。將上清液進(jìn)行進(jìn)行RT-PCR。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定使用不同濃度的核酸適配體時(shí)，與磁珠結(jié)合的核酸適配體的量。繪制與磁珠結(jié)合的DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR的量與投入的DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR的濃度的關(guān)系曲線(圖6)。按照核酸適配體與DBP-NH₂為1:1的結(jié)合比例，利用非線性擬合計(jì)算出K_d值分別為：70±5nM(DBP-1-RT-PCR，圖6a)和100±5nM(DBP-2-RT-PCR,圖6b)，誤差來(lái)自三次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。而起始文庫(kù)pool₀對(duì)DBP-NH₂修飾的磁珠沒有親和力。

實(shí)施例8:利用RT-PCR測(cè)試DBP-1和DBP-2對(duì)DBP-NH₂、BBP、DBP、DEHP的相對(duì)親和力測(cè)試以及對(duì)可能干擾物的選擇性

由于環(huán)境中出現(xiàn)的增塑劑都是沒有氨基修飾的，而且種類較多，必需測(cè)試所篩選出來(lái)的核酸適配體是否對(duì)這些增塑劑還具有很好的親和力和選擇性。為此我們進(jìn)行了下面的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定DBP-NH₂、BBP、DBP、DEHP的相對(duì)親和力測(cè)試以及對(duì)可能干擾物的選擇性。

將相同體積相同濃度的DBP-1RT-PCR或DBP-2-RT-PCR(5μL,10μM)分別與等量(10μL)的DBP-NH₂修飾的磁珠在500μL的結(jié)合緩沖溶液中孵育1個(gè)小時(shí)，然后用100μL結(jié)合緩沖溶液清洗3次。將清洗后的磁珠中分別與120μL濃度為10μM的DBP-NH₂、DBP、DEHP、BBP或含有多種類型小分子的選擇性測(cè)試溶液混合孵育1個(gè)小時(shí)。選擇性測(cè)試溶液中含有葡萄糖、卡那霉素、氨芐西林、乙醇等代表性的干擾物， 濃度均為10μM。在強(qiáng)力磁體上放置4分鐘后，移去上清液。對(duì)上清液中DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR的量進(jìn)行RT-PCR,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定上清液中DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR的量。

上述實(shí)驗(yàn)中DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR首先在DBP-NH₂修飾的磁珠上結(jié)合，隨后加入的DBP-NH₂或DBP或DEHP或BBP或選擇性測(cè)試溶液與DBP-NH₂修飾的磁珠進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，部分DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR與溶液中的DBP-NH₂或DBP或DEHP或BBP或選擇性測(cè)試溶液的成分結(jié)合，從而進(jìn)入溶液。這樣上清液中DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR的數(shù)量就反映了DBP-NH₂或DBP或DEHP或BBP或選擇性測(cè)試溶液的相對(duì)親和力。

如圖7所示，為表達(dá)簡(jiǎn)單直觀，以選擇性測(cè)試溶液競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)的DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR的相對(duì)數(shù)量為1，即相對(duì)親和力的數(shù)值為各測(cè)試樣品競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)的DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR的數(shù)量除以選擇性測(cè)試溶液存在時(shí)競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)的DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR的數(shù)量。繪制DBP-1(a)和DBP-2(b)對(duì)DBP-NH₂、BBP、DBP、DEHP的相對(duì)親和力。DBP-1-RT-PCR或DBP-2-RT-PCR對(duì)DBP-NH₂或DBP或DEHP或BBP的相對(duì)親和力比對(duì)選擇性測(cè)試溶液高約240～1100倍，說(shuō)明本發(fā)明所篩選的核酸適配體具有很好的選擇性。另外DBP-1-RT-PCR和DBP-2-RT-PCR對(duì)DBP、DEHP和BBP的相對(duì)親和力均比對(duì)DBP-NH₂的親和力高約1.4～4.0倍。說(shuō)明本發(fā)明所篩選的核酸適配體對(duì)增塑劑具有很好的親和力，甚至比篩選時(shí)所使用的氨基修飾的DBP的親和力還高。上述結(jié)果表明本發(fā)明所篩選的核酸適配體對(duì)常見增塑劑具有高親和 力和特異性，這為基于核酸適配體的增塑劑檢測(cè)新方法的構(gòu)建奠定了分子識(shí)別的基礎(chǔ)，對(duì)環(huán)境和食品中增塑劑的檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展具有重要意義。

實(shí)施例9:基于核酸適配體DBP-1的增塑劑電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建與增塑劑的檢測(cè)

(1)圓盤金電極表面的清潔

用超純水沖洗金圓盤電極(直徑為2mm)，依次用1μm、0.3μm、0.05μm的Al₂O₃拋光粉拋光電極表面(在拋光布上加少量超純水和固體粉末打磨5-10分鐘)，每次打磨后用超純水沖洗后，在超純水中超聲5分鐘，再進(jìn)行下一個(gè)打磨步驟。打磨光滑的電極通過(guò)三電極體系連接VMP3多通道電化學(xué)工作站在0.5M H₂SO₄中以-0.4～1.2V范圍以100mV/s作循環(huán)伏安掃描36圈(以金電極為工作電極，以飽和硫酸亞汞電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極)，直到循環(huán)伏安圖基本穩(wěn)定。如觀察不到明顯的對(duì)應(yīng)氧化還原峰，重新上述步驟打磨金電極。(2)基于信號(hào)探針鏈取代的增塑劑電化學(xué)傳感器(SD-EAB)的構(gòu)建

將100μL含有0.5μM HS-DBP-1(表1)和0.5μM 3'端修飾氧化還原基團(tuán)二茂鐵(Fc)的DBP-1-10T-C-Fc(表1)或者DBP-1-C-Fc(表1)的PBS/1M NaCl溶液(1×PB，1M NaCl，pH＝7.4)在95℃水浴加熱10min，緩冷至室溫。然后加入1μL TCEP(10mM)，室溫放置1小時(shí)。將(1)中清潔后的圓盤金電極放入上述溶液，室溫過(guò)夜組裝。用PBS/1M NaCl溶液洗滌三次，將電極放入100μL 1mM [S(CH₂)₂(OCH₂CH₂)₆OCH₃]₂(OEG₆–OMe)的PBS/1M NaCl溶液,室溫孵育1小時(shí)。用PBS/1M NaCl溶液洗滌三次，最后放置在結(jié)合緩沖溶液BB中平衡1小時(shí)，掃SWV獲得穩(wěn)定基線備用。

(3)PAE的檢測(cè)和選擇性測(cè)試

將不同濃度的16項(xiàng)PAE混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(Chem Service，每種含10ppm)或者10μM的含有不同重金屬離子(Hg²⁺,Pb²⁺,Ni²⁺,Cd²⁺)的結(jié)合緩沖溶液BB與電極孵育1小時(shí)后掃SWV。HS-DBP-1會(huì)特異性地與PAE結(jié)合，剔除互補(bǔ)的DBP-1-10T-C-Fc或者DBP-1-C-Fc，從而導(dǎo)致電流信號(hào)的降低(圖8a)。這樣就可以通過(guò)掃描方波伏安監(jiān)測(cè)電流的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)DBP或者其它PAE的定量檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖8)，可利用篩選出的DBP-1通過(guò)工程化設(shè)計(jì)來(lái)構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)，兩種不同的信號(hào)探針設(shè)計(jì)：DBP-1-10T-C-Fc(圖8b)或者DBP-1-C-Fc(圖8c)均實(shí)現(xiàn)對(duì)PAE的高靈敏性檢測(cè)，檢出限低于160ppt，檢測(cè)區(qū)間為160ppt～1.6ppm。另外10μM的Hg²⁺,Pb²⁺,Ni²⁺,以及10μM的卡那霉素和10μM的磺胺地索辛的混合物(Kana+Sulf)均顯著小于1.6ppm(約合4μM)的16項(xiàng)PAE混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)(圖8d),說(shuō)明該電化學(xué)傳感器具有好的選擇性。