本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)開發(fā)及應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基于川芎轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物組、其獲取方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

川芎為是傘形科藁本屬藥用植物，主要種植于四川彭州，都江堰等地，是我國著名傳統(tǒng)中藥材，以其干燥根莖入藥，其味辛，性溫，有活血行氣、祛風(fēng)止痛功效，用于治療頭痛、風(fēng)濕、月經(jīng)不調(diào)等。

川芎有效成分研究十分深入，研究者分離出了包括川芎嗪、阿魏酸、藁本內(nèi)酯等多種有效成分。檢索川芎研究文獻結(jié)果顯示，對川芎活性成分提取，藥理藥性上的研究較多。對川芎遺傳多樣性、種質(zhì)指紋圖譜、基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建、分子育種等研究卻鮮有報道，川芎中能夠用于上述研究的分子標(biāo)記甚少，都是一些通用引物，如RAPD、ISSR、ITS等，使得川芎分子研究難以深入，嚴(yán)重限制了川芎優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源快速、有效的選育及生產(chǎn)應(yīng)用。

微衛(wèi)星序列又稱簡單重復(fù)序列（SSR）、短串聯(lián)重復(fù)序列，由若干個串聯(lián)重復(fù)單元組成，每單元含1-10個核苷酸，廣泛分布在真核生物基因組中（9-10）。SSR具有標(biāo)記之間密度大、材料間多態(tài)性好、易擴增、重復(fù)性高等優(yōu)點，已被廣泛在水稻，玉米，小麥等作物上應(yīng)用。SSR按來源分為兩類genome-SSR和EST-SSR，隨著EST數(shù)據(jù)庫的不斷豐富，EST-SSR被大量開發(fā)。截止目前，藥用植物已有紅花、丹參、黨參、人參、西洋參、金銀花等開發(fā)了EST-SSR，逐漸代替通用引物應(yīng)用于遺傳多樣性、道地性鑒定等研究。

近年來二代測序飛速發(fā)展，成本急劇降低。使得利用轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)EST-SSR成為一種便捷高效的手段。但目前還未有利用川芎轉(zhuǎn)SSR標(biāo)記引物的報道。因此，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)批量開發(fā)川芎EST-SSR引物。該標(biāo)記能直接用于川芎種質(zhì)資源指紋圖譜構(gòu)建、遺傳作圖、基因定位和比較基因組學(xué)研究，對川芎品種的標(biāo)準(zhǔn)化、真?zhèn)纹贩N的鑒定、分子標(biāo)記輔助選擇育種都有重要作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供了一種基于川芎轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物組、其獲取方法及應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種基于川芎轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物組，所述引物組包括74對引物，其中各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148所示。

本發(fā)明還提供了一種基于川芎轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物組的獲取方法，該方法包括以下步驟：

（1）對川芎轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)拼接，拼接去冗余得到unigene；

（2）利用MISA軟件對拼接到的unigene進行SSR位點發(fā)掘；

（3）利用Primer 3.0軟件對上述SSR檢測結(jié)果進行引物設(shè)計，得到設(shè)計的EST-SSR引物；

（4）采用CTAB方法提取川芎的基因組DNA，用設(shè)計的EST-SSR引物對川芎DNA進行PCR擴增，然后進行毛細管電泳，根據(jù)電泳結(jié)果數(shù)據(jù)篩選出EST-SSR標(biāo)記引物組。

進一步的，步驟（2）中，SSR位點發(fā)掘時的基本參數(shù)設(shè)置為：單核苷酸至少重復(fù)10次，雙核苷酸至少重復(fù)6次，三核苷酸至少重復(fù)5次，四核苷酸至少重復(fù)5次，五核苷酸至少重復(fù)5次，六核苷酸至少重復(fù)5次。

進一步的，步驟（3）中，引物設(shè)計時參數(shù)設(shè)置為：引物長度18-25bp；退火溫度52.0-60.0℃，且上游引物和下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40%-60%；PCR擴增產(chǎn)物長度100-300bp。

進一步的，步驟（4）中，PCR擴增的反應(yīng)體系為：DNA2μL、5U·μL^-1Tap酶0.2μL、10mmol·L^-1引物2μL、2.5mmol·L^-1dNTP 2μL、25mM 10×Buffer2μL、ddH₂O 11.8μL。

進一步的，步驟（4）中，PCR擴增的反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸6min。

本發(fā)明基于川芎轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物組在川芎種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。

本發(fā)明基于川芎轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物組在鑒定川芎品種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明首次公開了川芎EST-SSR標(biāo)記引物組，該引物經(jīng)驗證后得到多態(tài)性較高的74對EST-SSR，與通用引物相比，川芎EST-SSR標(biāo)記引物組具有多態(tài)性高，易擴增，重復(fù)性好，結(jié)果更準(zhǔn)確等優(yōu)點，可用于后續(xù)川芎的遺傳圖譜構(gòu)建、川芎品種指紋圖譜構(gòu)建等基礎(chǔ)研究，促進川芎分子育種和功能基因發(fā)掘、中藥品種標(biāo)準(zhǔn)化等應(yīng)用研究。

附圖說明

圖1是本發(fā)明開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物組的UPGMA聚類圖譜；

圖2是本發(fā)明利用引物對25得出的川芎樣品擴增產(chǎn)物的毛細管電泳圖；

圖3是本發(fā)明利用引物對43得出的川芎樣品擴增產(chǎn)物的毛細管電泳圖；

圖4是本發(fā)明利用引物對52得出的川芎樣品擴增產(chǎn)物的毛細管電泳圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細地解釋說明。

本發(fā)明的一種基于川芎轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物組，其中，各引物的核苷酸序列如表1（序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148）所示。

一種基于川芎轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物組的獲取方法，該方法包括以下步驟：

（1）拼接川芎轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，得到通用基因庫(unigene)；

（2）利用MISA軟件發(fā)掘川芎EST-SSR位點；

（3）利用Primer3進行批量設(shè)計SSR引物；

（4）挑選235對引物進行合成，對收集的川芎資源進行擴增、驗證；

（5）用NTSYS-pc2.l0e軟件對川芎資源進行聚類分析，使用POPGENE對川芎各個引物多樣性指數(shù)進行檢測。

實施例1

本實施例制備川芎EST-SSR標(biāo)記引物組，包括以下步驟：

(1)川芎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的SSR引物獲得

（1.1）對川芎根轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)拼接，拼接去冗余得到unigene。

（1.2）利用MISA軟件對拼接到的unigene進行SSR位點發(fā)掘，基本參數(shù)設(shè)置為單核苷酸至少重復(fù)10次，雙核苷酸至少重復(fù)6次，三核苷酸至少重復(fù)5次，四核苷酸至少重復(fù)5次，五核苷酸至少重復(fù)5次，六核苷酸至少重復(fù)5次。

（1.3）采用Primer 3.0軟件對上述SSR檢測結(jié)果進行引物設(shè)計，參數(shù)設(shè)置為引物長度18-25bp；退火溫度52.0-60.0℃，且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40%-60%；PCR擴增產(chǎn)物長度100-300bp。去重復(fù)后，得到設(shè)計出的引物共計3602個，合成其中的235對。

（2）利用CTAB方法提取川芎的基因組DNA，川芎材料如表2所示。用設(shè)計的EST-SSR引物對上述材料的DNA進行PCR擴增，用于驗證引物設(shè)計的效率，同時篩選出多態(tài)性較高的核心引物。

（2.1）取新鮮幼嫩的川芎葉片，采用CTAB提取法提取川芎DNA。

（2.2）PCR擴增：總體積20μL，DNA2μL、Tap酶（5U·μL^-1)0.2μL、引物（10mmol·L^-1）2μL、dNTP(2.5mmol·L^-1)2μL、10×Buffer(25mM)2μL、ddH₂O 11.8μL。擴增反應(yīng)程序為：預(yù)變性94℃5min，34個循環(huán)（94℃變性30S，56℃退火30s，72℃延伸30s），72℃延伸10min，降溫到20℃，-4℃保存）。

（2.3）PCR產(chǎn)物中加入5μL的dilution buffer，最后一孔加25μL DNALadder，30-1500bp分離膠進行毛細管電泳。

（2.4）利用毛細管電泳自動數(shù)據(jù)分析軟件PROSize^TM分析數(shù)據(jù)，有條帶的數(shù)據(jù)為“1”，沒有條帶的為“0”。

（2.5）使用NTSYS-pc2.l0e軟件對34份川芎樣品進行聚類分析，使用POPGENE軟件計算各引物的等位基因數(shù)(Na)、基因多樣性(h)和Shannon值(I)。

（2.6）利用實施步驟2.1-2.5對235對SSR引物進行檢測，發(fā)現(xiàn)74對擴增條帶清晰、且有多態(tài)性的引物。聚類分析結(jié)果顯示34份川芎遺傳相似系數(shù)為0.58-0.91，被分成兩大類。Nei基因多樣性為0.31，Shannon指數(shù)為0.46，川芎聚類結(jié)果沒有明顯的地域關(guān)系，這與四川川芎種植時相互引種有關(guān)。

表1

表2

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明實質(zhì)內(nèi)容上所作的任何修改、等同替換和簡單改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物育種栽培研究所

<120> 基于川芎轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物組、其獲取方法及應(yīng)用

<160> 148

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccaaaaagt attgaatatg acaaa 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcccctggt actcaccatc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agtgtgatgg agatggaggc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcatatgatg gaccgaccaa 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcacttagcc ttgttaaaga cc 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacctcattt ggcttccctt 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcaacaagaa aggttaaata agca 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agatgggttc atggaagtcg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aagcacgagc ttttgtcatt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gccagtcccc tttcctctta 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acattttgaa tttcagctgt tgt 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tggcactcac aaaacaccat 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgaaagaata ccatgatgcc a 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tggccgtgca atttgtaata 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaaggttgaa gtttctcatt ttg 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaggatttaa tgcaccggaa 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tcaacgaata tgcgtgtttc a 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aaacagcagc agcacaaaaa 20

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttcaacccca gtttactgag tc 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctggtgaaat tgagctgtgc 20

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aacatggaac acacataaca tacaa 25

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tgttttcacc ccgttgtttt 20

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cttgtgaata ccataataca gagca 25

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atggaaatcg atcggtgact 20

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

aggcaagaaa cgactcaaat g 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cagagactgg ttgtggggtt 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

agcagttcag cataccctcc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aaatttacgc agcagggttc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tgggtggaag tcatgaaaga 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

atatacccag ccttttcgca 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tgctatcgac tccagaggaa a 21

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cgggcctgag ggagtatta 19

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gcgttctgaa tacagcactt g 21

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

aaattagtgg tcccccgatg 20

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tgacagagct attctttggt tcttt 25

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gggactggca ggactctgta 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

caaatctatt ctcgggcaaa 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gaaagggtga tcgagtccaa 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ggagaattgc aactgtgcat 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

agccaaagtc gtaagaggca 20

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tgtaatatac ctgcttggca aaaa 24

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ggcatgaaac caacttcaaa a 21

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gttctaactt taaggctgga ctaact 26

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

tgcagaggta caattcgtgt g 21

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ccctatcact cagcaacacc 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gccagtcccc tttcctctta 20

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ctccttgttc ccactcagtc t 21

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

agccccatta ctttcccagt 20

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

aggacacagg tggacttcaa a 21

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

aatttgcacc accccataga 20

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tcaacatatc tatggctcat ttcaa 25

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

cacgtgcatc cacacacata 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

tatcgttgaa cccgaacctc 20

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

ggatagtagt gaagggatat gctacag 27

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

cacaatcaaa catagctcca ca 22

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

cgtgttaaat tcgttcgttc c 21

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

accccaaaac atggaagaag 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

acttgcggcc acgtaaatag 20

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

cgagtacaaa tccacagctc a 21

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

gggcctggat agaacagaca 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

aagggaaaat gtgatgcgac 20

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

acatcaaacg attgaaaacc taa 23

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

atcttttcca tccacatggc 20

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

ttgatttgca attattctag ggc 23

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

gcaaagatgg caataccctg 20

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gcaccacgaa gaatagaagc a 21

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

attgtgggta gcaatcagcc 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

aagccttcca agattcagga 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

aacgatgatg atgatggggt 20

<210> 70

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

cagttaaacc tcctcctccc tt 22

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

gatgtccagt ccccttcaaa 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

gcgtgtcaca agtgtggaag 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

gccaccacca acacctaaat 20

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

ggtaaggagg cggtttgatt 20

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

gcaatcaaac aatgccaaaa 20

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

gtgctggaaa acccaagaag 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

acttcgaatg tcggaatcca 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

cgaaatcgtc gaatgaatga 20

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

gcaatggatt aggaccgcta 20

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

ttttcgtcat ttcaccatcg 20

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

gtcgagaagc cgagagagaa 20

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

acccccgaca tttatcgagt 20

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

ccgttctcca aacaccaact 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

gggggaaagaa aatcggaagt 20

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

tgaagccaag aacagtgcaa 20

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

aacaacccag agctgcaaac 20

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

gaagccactc actaatcgcc 20

<210> 88

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

ttaccaggaa gatcaccagg a 21

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

acaaaccaaa cgtcccacat 20

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

ctttcctcta ggcgctttca 20

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

cgtttgacat tttccgaggt 20

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

tcaacgaatt aggattcgcc 20

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

tattatttcc attcccgcca 20

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

cgatcaacgg tgatgatttg 20

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

tcctctttct ttgcctcagc 20

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

tactttccga ggtgaaggga 20

<210> 97

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

cggatcttct tgctattcgg 20

<210> 98

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

gcccaccaag taaagattgc 20

<210> 99

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

cgcacacaca gacacacaag 20

<210> 100

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

ttgttacttc cacccccaga 20

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

ttgcattgct tctgcatgat 20

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

ggtcaaagaa gccgtagtgg 20

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

tccagattgt gggttgttga 20

<210> 104

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 104

ctggcacttg tacgaaacca 20

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

gtctgatatt gggcctgctc 20

<210> 106

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 106

atcggcctcc ttatcatcct 20

<210> 107

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 107

ataagttcgt gcaaatcggg 20

<210> 108

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 108

gcagcagcaa gaaatgtacg 20

<210> 109

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

tttgacacca ccaccatcag 20

<210> 110

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 110

ggtcatgctc aagaagttcc a 21

<210> 111

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 111

gttctggtgc aggacaaggt 20

<210> 112

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 112

aggttgtgag gcagatcaaa 20

<210> 113

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 113

atgagttctt catccgtggg 20

<210> 114

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 114

caatcaaatc ttcctccctc t 21

<210> 115

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 115

gcgacactcc tatgccatct 20

<210> 116

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 116

gcaagcctta catgcgttct 20

<210> 117

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 117

tgctaaatcg gcgagtttct 20

<210> 118

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 118

tcatttccat tacacacggc 20

<210> 119

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 119

gtttccgcca gtgaagtagc 20

<210> 120

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 120

caaaacatac aatttccctg gat 23

<210> 121

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 121

atcgagatgg gtggtctcag 20

<210> 122

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 122

ggaaacttga tgtggaaatg ag 22

<210> 123

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 123

cagatctccg tccagggtaa 20

<210> 124

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 124

actgcaatca atgtccacca 20

<210> 125

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 125

cagaatcacc agaacccgta a 21

<210> 126

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 126

ttgctgtgtt tgaaatgttg g 21

<210> 127

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 127

ttgatggaaa acatcctacg g 21

<210> 128

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 128

taagaggtgg cggacagttt 20

<210> 129

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 129

cttctttttg gctgctaccg 20

<210> 130

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 130

aggaacactc ggcctcataa 20

<210> 131

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 131

acatcgacac caaacagcaa 20

<210> 132

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 132

aaggtcgcga aaatgatgac 20

<210> 133

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 133

cttgggtcgg gtcttgttta 20

<210> 134

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 134

ccactttcaa ttttccccaa 20

<210> 135

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 135

aaaagcaaac atcaatatga ccaa 24

<210> 136

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 136

cagctttagg gactcatcgg 20

<210> 137

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 137

gcatagtgaa gaagagccgc 20

<210> 138

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 138

caacccgaac taaaatctcc a 21

<210> 139

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 139

caaacaattc cacaagaacc aa 22

<210> 140

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 140

ttgctgcccc tactactgct 20

<210> 141

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 141

tgtcaatatg tgtttggggg 20

<210> 142

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 142

tcacctgcca cttagttttc c 21

<210> 143

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 143

agtaccacca cctccaccag 20

<210> 144

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 144

agcacatggt cctaactggg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 145

ctggttgacc tggatgacct 20

<210> 146

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 146

tgatcaattc gaggagggtc 20

<210> 147

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 147

agagtgagcg acatcggagt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 148

ccctcagctc ttccctttct 20