本發(fā)明涉及雜交鵝掌楸遺傳轉化方法，具體涉及一種雜交鵝掌楸高效的瞬間遺傳轉化方法。

背景技術：

鵝掌楸屬于古老的木蘭科植物，從系統(tǒng)發(fā)生上看，屬于原始的被子植物。對木蘭科植物基因及其功能的研究，將對闡明被子植物的系統(tǒng)發(fā)生有著重要的影響。而目前利用常見的模式植物擬南芥、煙草的轉基因體系對鵝掌楸的基因功能和信號傳導開展研究可能存在異源系統(tǒng)帶來的假陽性等問題，因此建立鵝掌楸的轉基因體系對于鵝掌楸及木蘭科植物基因功能的研究都有著重要意義。轉基因體系主要包括穩(wěn)定轉染的轉基因體系和瞬間表達基因體系，受木本植物生長周期長特點的影響，瞬間表達基因體系為植物基因功能高通量研究提供了一個快速方便的操作平臺。目前，瞬間轉化體系主要有農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化、基因槍法、PEG介導或者電穿孔法介導的原生質體轉化，其中PEG介導的原生質體瞬間轉化是最廣泛使用的瞬間表達體系。PEG具有細胞粘合及擾亂細胞膜磷脂雙分子層的作用，它可使DNA 與膜形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連；它還可引起膜表面電荷紊亂，干擾細胞識別，有利于細胞膜間的融合和外源DNA進入原生質體。目前在擬南芥、楊樹等物種中用PEG介導的葉肉細胞原生質體瞬間表達系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛的用于研究基因表達的信號傳遞、蛋白和蛋白之間的相互作用、亞細胞定位以及蛋白-DNA之間的相互作用等。但PEG介導的原生質體轉化的轉化頻率受很多因素的影響，包括外源基因的濃度和構象，PEG的分子量和濃度，質粒/原生質體的比例，轉染時間等。目前僅在擬南芥、水稻、棉花、楊樹等植物建立起高效的PEG介導的瞬間表達體系，受物種差異的影響，木蘭科植物由于葉片含有大量的蠟質，目前尚未有短時間內快速分離其葉肉原生質體的方法和有效的瞬間表達體系。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種以葉肉原生質體為受體的雜交鵝掌楸高效的瞬間基因表達方法，建立起PEG介導的雜交鵝掌楸葉肉原生質體瞬間轉化體系，為鵝掌楸及木蘭科植物基因功能的研究提供一個快速方便的操作平臺。

技術方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

一種以葉肉原生質體為受體的雜交鵝掌楸高效的瞬間基因表達方法，包括以下步驟：

1）使用QIAGEN Plasmid Midi Kits抽提純化質粒，將其調整到2 μg/μL的濃度后，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2）雜交鵝掌楸葉肉細胞原生質體的分離純化，獲得濃度為10⁵/mL的原生質體；

3）取質粒于2 mL離心管中，然后加入原生質體，用手輕輕的將質粒DNA及原生質體溶液混勻；緩慢加入40% PEG-4000溶液，輕柔混勻，放置15 min；加入W5溶液，輕柔混勻；1100 rpm離心2 min后棄上清，加入WI溶液輕輕懸浮原生質體，并轉移到細胞培養(yǎng)板上；

4）將細胞培養(yǎng)板放在23℃黑暗靜置培養(yǎng)18 h后，置于熒光顯微鏡下觀察。

步驟1）中，具體過程如下：

1）挑取平板中分散良好的單菌落，接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的2 mL的LB培養(yǎng)基中，37℃，300 rpm，振蕩培養(yǎng)8 h；

2）取搖好的菌液，按1:500的比例加到含有100 mg/L氨芐青霉素的50 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，300 rpm，振蕩培養(yǎng)12～16 h；

3）在4℃用6000×g離心15分鐘收集菌體沉淀，完全棄除上清液；

4）用4 mL Buffer P1重懸菌體；

5）加入4 mL Buffer P2，上下顛倒4-6次完全混勻，室溫靜置裂解5 min；

6）加入4 mL 預冷的Buffer P3，立即顛倒4-6次混勻，冰浴靜置沉淀15min；

7）在4℃用≥20000×g離心30 min，將含有質粒的上清液小心地轉移到一個新的干凈的離心管中；并在4℃用≥20000×g再次離心15 min；

8）將4 mL Buffer QBT加入到QIAGEN-tip 100離心柱上，靠重力作用待其完全流過離心柱；

9）將7）中含有質粒的上清液立即轉移到平衡好的QIAGEN-tip 100離心柱上，依靠重力的作用將質粒結合到離心柱的樹脂上；

10）加入2×10 mL Buffer QC 清洗離心柱；

11）加入5 mL Buffer QF將離心柱的樹脂上結合的質粒洗脫到一個干凈的離心管中；

12）向質粒洗脫液中加入3.5 mL室溫放置的異丙醇沉淀質粒DNA，完全混勻后，在4 ℃用≥15000×g離心30 min沉淀質粒DNA，小心棄除上清液；

13）用2 mL 室溫放置的70%乙醇洗滌質粒DNA沉淀，用≥15000×g離心10 min，小心棄除上清液不要擾動離心管底部的沉淀；

14）室溫干燥5～10 min后；加入30 uL滅菌的ddH₂O，溶解質粒；

15）用瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測質粒的濃度和純度后，將其調整到2 μg/μL后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟2）中，取培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中健康伸展的體胚苗葉片，用刀片切成0.5～1mm的細絲，然后迅速放入準備好的酶解液中，置于28℃黑暗條件下，45 rpm輕微振蕩3 hr進行酶解；酶解完成后，加入適量W5溶液，輕輕搖晃，使用300目篩子過濾除去未酶解充分的葉片；濾液經(jīng)1100 rpm離心2 min，棄上清液，用2 mL冰預冷的W5溶液洗原生質體2次后，加入2 mL冰預冷的W5溶液重懸原生質體，冰上靜置30 min，1100 rpm離心2 min，棄上清液，加入MMg溶液懸浮原生質體，并調整原生質體濃度至10⁵/mL。

酶解液的準備：稱取Cellulase R-10 0.15 g，Macerozyme R10 0.1 g和Pectolase Y-23 0.01 g 于6.25 mL 0.8 M甘露醇、2.5 mL 80 mM KCl、1 mL 200 mM MES（pH5.7）的溶液中，攪勻，置4℃冰箱過夜充分溶解；再加入0.1 mL 1 M CaCl₂、0.01 g BSA，定容至10 mL；用0.45 μm的滅菌過濾器過濾上述溶液，備用。

步驟3）中，20μg質粒轉化1×10⁴個細胞。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明以雜交鵝掌楸葉片作為原生質體的來源，通過PEG介導，以GFP基因作為報告基因，建立起了雜交鵝掌楸葉肉細胞原生質體高效的瞬間表達體系，為鵝掌楸及木蘭科植物基因功能的研究提供一個快速方便的操作平臺。

附圖說明：

圖1是雜交鵝掌楸葉肉細胞原生質體的顯微照片圖；

圖2是PEG介導雜交鵝掌楸葉肉細胞原生質體轉化的的顯微照片圖；左圖是明場視野，中圖是GFP視野，右圖是疊加后。

具體實施方式

下面結合具體實例對本發(fā)明作進一步的說明。

以下實施例用到的試劑的配方為：

PEG溶液（40%，V/V）（10mL）：4g PEG4000，3mL H₂O，2.5mL 0.8M甘露醇，1mL 1M CaCl₂。

W5溶液：154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，2mM MES（pH5.7），5mM葡萄糖。

MMg溶液：0.4M甘露醇，15mM MgCl₂，4mM MES（pH5.7）。

WI溶液：4mM MES（pH5.7），0.5M甘露醇，20mM KCl。

實施例1 質粒制備

采用QIAGEN Plasmid Midi Kits抽提純化質粒（PJIT166-GFP），可以方便快速地獲得純度較高的質粒，具體步驟如下：

1）挑取平板中分散良好的單菌落，接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的2 mL的LB培養(yǎng)基中，37℃，300 rpm，振蕩培養(yǎng)8 h；

2）取搖好的菌液，按1:500的比例加到含有100 mg/L氨芐青霉素的50 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，300 rpm，振蕩培養(yǎng)12～16 h；

3）在4℃用6000×g離心15分鐘收集菌體沉淀，完全棄除上清液；

4）用4 mL Buffer P1重懸菌體；

5）加入4 mL Buffer P2，上下顛倒4-6次完全混勻，室溫靜置裂解5 min；

6）加入4 mL 預冷的Buffer P3，立即顛倒4-6次混勻，冰浴靜置沉淀15min；

7）在4℃用≥20000×g離心30 min，將含有質粒的上清液小心地轉移到一個新的干凈的離心管中；并在4℃用≥20000×g再次離心15 min；

8）將4 mL Buffer QBT加入到QIAGEN-tip 100離心柱上，靠重力作用待其完全流過離心柱；

9）將7）中含有質粒的上清液立即轉移到平衡好的QIAGEN-tip 100離心柱上，依靠重力的作用將質粒結合到離心柱的樹脂上；

10）加入2×10 mL Buffer QC 清洗離心柱；

11）加入5 mL Buffer QF將離心柱的樹脂上結合的質粒洗脫到一個干凈的離心管中；

12）向質粒洗脫液中加入3.5 mL室溫放置的異丙醇沉淀質粒DNA，完全混勻后，在4 ℃用≥15000×g離心30 min沉淀質粒DNA，小心棄除上清液；

13）用2 mL 室溫放置的70%乙醇洗滌質粒DNA沉淀，用≥15000×g離心10 min，小心棄除上清液不要擾動離心管底部的沉淀；

14）室溫干燥5～10 min后；加入30 uL滅菌的ddH₂O，溶解質粒；

15）用瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測質粒的濃度和純度后，將其調整到2 μg/μL后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2 雜交鵝掌楸葉肉細胞原生質體的分離純化

原生質體的質量直接影響轉化效率，而植物材料的生長狀態(tài)、酶的種類和純度、酶解時間和溫度等諸多因素都會影響分離到的原生質體的效率和質量。葉肉細胞原生質體更大程度的保留了植物的許多生理響應和細胞的活性，因此已經(jīng)被廣泛的選作植物細胞原生質體的材料來源。目前擬南芥、煙草、楊樹、水稻、玉米、棉花等許多植物的葉肉細胞原生質體已經(jīng)可以在短時間內被高效的分離，而鵝掌楸屬植物的葉片，類似于銀杏科和廣玉蘭，上表皮都含有同源系列的葉片蠟質，因此，它的表皮很難采用像擬南芥、煙草、谷物和一品紅等撕的方法去除。通常使用的酶液組合纖維素酶R-10 和離析酶R10不能在短時間內有效分離雜交鵝掌楸葉肉細胞原生質體。

本實例以雜交鵝掌楸葉片作為材料，基于專用的酶解液，建立了有效的制備雜交鵝掌楸葉肉原生質體的方法。具體步驟如下：

1）取培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中健壯的體胚苗做為實驗材料，用剪刀將較為伸展并且生長狀態(tài)良好的第2-5片葉片剪下來（每用一片剪一片），放在干凈的白紙上，用單面刀片剪成0.5～1mm的條帶，切完后迅速用鑷子夾起一端，放入準備好的酶解液中（注：放入時，先將一面浸入酶解液，取出再將另一面浸入，目的使葉片條段完全的蘸上酶解液，酶解更充分）。然后置于28°C黑暗條件下，45rpm輕微振蕩3 hr進行酶解。

2）酶解完成后，輕輕搖晃數(shù)秒促進消化，加入適量W5溶液，輕輕搖晃，使用300目篩子過濾除去未酶解充分的葉片。

3）濾液經(jīng)1100rpm離心2min，用槍頭吸出上清，可見原生質體沉淀于底部。

4）向所得的沉淀中加入2 mL冰預冷的W5溶液重懸原生質體，1100rpm離心2min，用槍頭吸出上清，輕輕搖晃使原生質體懸浮。

5）再重復一次。

6）再次加入2mL冰預冷的W5溶液重懸原生質體，冰上靜置30min。1000rpm離心2min，用槍頭吸出上清，輕輕搖晃使原生質體懸浮。

7）加入所需體積的MMg溶液（每個反應約需100μL）懸浮原生質體。取一滴重懸液進行鏡檢，觀察原生質體的質量和濃度，并調整原生質體濃度至10⁵/mL。雜交鵝掌楸葉肉細胞原生質體的顯微照片，如圖1所示。

專用的酶解液的準備：稱取Cellulase R-10 0.15 g，Macerozyme R10 0.1 g和Pectolase Y-23 0.01 g 于6.25 mL 0.8 M甘露醇、2.5 mL 80 mM KCl、1 mL 200 mM MES（pH5.7）的溶液中，攪勻，置4℃冰箱過夜充分溶解；再加入0.1 mL 1 M CaCl₂、0.01 g BSA，定容至10 mL；用0.45 μm的滅菌過濾器過濾上述溶液，備用。

實施例3 轉化

至今，已經(jīng)在擬南芥、煙草、楊樹、胡楊、葡萄、玉米等很多植物中建立起了高效的原生質體瞬間表達體系。但是，不同材料來源的原生質體的PEG介導的瞬間轉化體系的參數(shù)存在著一定的差異。如最近建立的PEG介導的胡楊懸浮系細胞原生質體瞬間轉化體系中，最優(yōu)參數(shù)為：在240μL的轉化體系中，1×10⁵的原生質體和20μg質粒在20% PEG-4000的介導下，靜置轉染20 min，可以獲得超過50%的轉化率；而葡萄懸浮系細胞原生質體的最優(yōu)參數(shù)為：在220μL的轉化體系中，4×10⁵的原生質體加到20μg質粒中，在25% PEG-4000的介導下，靜置轉染30 min，可以獲得超過60%的轉化率。因此不同材料來源的PEG介導的原生質體瞬間轉化參數(shù)差異很大，從目前已經(jīng)建立的PEG介導的原生質體的瞬間轉化體系來看，影響其轉化率的因素主要有DNA濃度和數(shù)量、質粒/原生質體的比例、PEG分子量和濃度、轉染時間等。

本實例以PEG介導的雜交鵝掌楸葉肉細胞原生質體瞬間轉化的方法，具體步驟如下：

1）對于單個反應，加入質粒DNA共10μL于2mL離心管中。

2）每個反應吸取100μL上述制備好的原生質體于加入質粒DNA的離心管中，每個反應在吸取前務必重懸一次，否則原生質體會沉在底部。

3）用手輕輕的將質粒DNA及原生質體溶液混勻。

4）加入等體積即110μL的PEG溶液，PEG會沉在溶液底層，每加完一個反應立即用手輕輕的混勻溶液。

5）靜置轉染15min。

6）每個反應中加入4倍體積即440μL W5溶液，輕輕上下顛倒混勻，終止轉染反應。

7）室溫下1100 rpm離心2 min，用寬頭槍頭吸出上清，加入1 mL WI溶液輕輕懸浮原生質體，并轉移到6孔細胞培養(yǎng)板上。

8）23℃弱光照條件下培養(yǎng)約18hr。

培養(yǎng)后觀察：將細胞培養(yǎng)板放在23℃黑暗靜置培養(yǎng)18 h后，置于熒光顯微鏡下觀察。結果如圖2所示，在明場下，可以觀察到完整的原生質體，在GFP下，可以看到綠色熒光分布在整個原生質體內，以視野下發(fā)綠色熒光的原生質體占所觀察到的原生質體的比例計算，原生質體的轉化率達到了60%。

試驗證實，以20μg質粒轉化1×10⁴個細胞，可以獲得較高的轉化率，達60%。