本發(fā)明屬于具有應(yīng)用潛力的一種生物防治作用的致病桿菌SN84菌株，該菌株及代謝產(chǎn)物對番茄灰霉具有較好的抑菌活性。

背景技術(shù)：

番茄灰霉病是番茄生產(chǎn)中常見且危害較重的病害，由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea )侵染引起，發(fā)生非常廣泛?；移咸焰叩募闹鞣秶鷱V泛，可危害番茄、辣椒、茄子、黃瓜等多種作物；該病害除危害田間的作物外，還可危害運輸和儲藏期間的水果和蔬菜，造成進一步的經(jīng)濟損失。由于對灰葡萄孢的抗性資源很少，生產(chǎn)中主要依靠化學防治的方法，常用的化學殺菌劑包括苯并咪唑類、N-苯基氨基甲酸酯類、二甲酰亞胺類和苯胺基嘧啶類。由于大面積、長時間的使用單一種類的殺菌劑和不合理的施藥技術(shù)，導致灰葡萄孢對某些常規(guī)的殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性和農(nóng)藥殘留，并且愈加嚴重，導致了嚴重的經(jīng)濟損失，隨著對食品安全的關(guān)注，生產(chǎn)中亟需開發(fā)高效且低毒的殺菌劑防治病害。

近年來，利用生物防治的方法對番茄灰霉病進行控制得到了較多的研究，通過篩選獲得地衣芽孢桿菌、木霉菌和芽孢桿菌對灰葡萄孢的生長具有一定的抑制作用；植物精油、抗真菌蛋白、石榴皮提取物、丁香提取物等多種物質(zhì)對灰葡萄孢有一定的抑制作用。但是存在的普遍問題是抑制效果較差，大多數(shù)的研究處于實驗室階段，投入生產(chǎn)中的產(chǎn)品較少。利用生物防治病害的主要缺點是防治效果較差。生防相關(guān)研究主要局限在實驗室研究，在生產(chǎn)中缺乏應(yīng)用。

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）和大豆疫霉(Phytophthora sojae)屬鞭毛菌亞門（Mastigomycotina）卵菌綱（Oomycetes）病原微生物，在分類、生理生化等方面同真菌具有較大差別，常用的殺菌劑對病害的防治效果較差。

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌侵染引起的一種病害。該病于 1918 年在美國首次發(fā)現(xiàn)，迄今已在世界各地的辣椒種植區(qū)普遍發(fā)生，已成為當今世界各地辣椒種植區(qū)的主要病害之一。辣椒疫霉的寄主范圍廣，除辣椒外，還可侵染茄科的番茄、茄子和葫蘆科的黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等。另有文獻報道，該菌還可侵染可可樹、澳洲堅果屬山龍眼（Macasamia）及一些豆科植物。

辣椒疫霉可經(jīng)雨水、土壤、氣流等多種途徑傳播，危害多種作物。辣椒發(fā)病時可造成莖桿壞死、葉部枯萎、果實腐爛、整株萎蔫死亡，導致田間大面積死秧。我國最早在上世紀50年代在江蘇發(fā)現(xiàn)辣椒疫病，目前該病已危及我國的青海、新疆、上海、浙江、北京、云南、遼寧、甘肅、陜西、貴州、四川、廣東等許多省區(qū)。并且呈逐年加重趨勢，給辣椒的生產(chǎn)造成了嚴重的損失。為此，國家將選育抗疫病辣椒品種列入“八五”攻關(guān)項目，組織多方力量，加大研究力度。由于辣椒疫病是一種土傳病害，利用化學藥劑對其進行防治，效果甚微，且容易造成土壤和環(huán)境污染。因此，利用生物防治病害凸顯出其優(yōu)勢。

大豆疫霉根腐病是大豆的毀滅性病害。美國最早發(fā)現(xiàn)此病，受害也最為嚴重。大豆疫霉根腐病在大豆的整個生育期內(nèi)均可發(fā)生。病原菌可侵染植株的根、莖、葉和部分豆莢，在感病品種上造成的損失達 25～50%，環(huán)境條件適宜個別高感品種產(chǎn)量損失達100%。被害植株種子的蛋白質(zhì)含量明顯降低。我國每年進口的大豆數(shù)量在數(shù)千萬噸，大豆疫霉隨進口大豆傳入的風險越來越大。1991 年以前我國尚未報道有大豆疫霉根腐病分布。1991 年沈崇堯等首次報道在我國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)大豆疫霉。我國 1986 年將大豆疫霉根腐病列為對外植物檢疫對象，1992 年被列為“進境植物檢疫危險性病、蟲、雜草名錄”中第一類病害，1995 年大豆疫霉根腐病又被列為國內(nèi)植物檢疫對象，確定的分布范圍只在黑龍江省。1996 年李寶英等報道了大豆疫霉在黑龍江省三江平原的危害情況，引起了國家農(nóng)業(yè)部、動植物檢疫局、黑龍江省政府等有關(guān)部門的高度重視。大豆疫霉根腐病在我國也有逐漸加重趨勢，1994 年發(fā)生面積為 10 萬畝，1995年為30 萬畝，1996 年達到 100 萬畝，平均每年以 3 倍的速度擴展。大豆疫霉根腐病是否會在中國主要大豆產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，如何有效控制其危害和傳播，將是中國大豆生產(chǎn)面臨的重要課題。

植物病害生物防治是利用有益微生物和微生物代謝產(chǎn)物對農(nóng)作物病害進行有效防治的技術(shù)與方法。昆蟲病原線蟲殺死寄主以后，腸道中共生的致病桿菌能夠分泌多種具有殺菌活性的次生代謝產(chǎn)物，保護死亡的昆蟲免遭細菌和真菌的侵染。因此，昆蟲病原線蟲共生菌是是極具潛力的活性代謝產(chǎn)物開發(fā)靶標。

本發(fā)明通過在我國東北三省不同地區(qū)誘捕土壤中的昆蟲病原線蟲，分離得到昆蟲病原線蟲腸道中的共生菌，對共生菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，測試發(fā)酵產(chǎn)物對不同病原菌的抑制作用。獲得的來自致病桿菌SN84的發(fā)酵液對番茄灰霉、辣椒疫霉及大豆疫霉具有良好的控制效果，在平板抑菌試驗中能有有效抑制菌絲的生長，在番茄灰霉病的盆栽試驗中有效減輕植株的發(fā)病，結(jié)果顯示該菌株具有較好的應(yīng)用潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過分離昆蟲病原線蟲共生菌和抑菌實驗，獲得代謝產(chǎn)物具有抑菌活性的致病桿菌菌株SN84，在平板抑菌試驗和盆栽藥效試驗中均具有較好的防治效果，具有很好的應(yīng)用價值。為防治番茄灰霉病、辣椒疫霉菌病和大豆疫霉菌病提供一種高效、特異性強的生物防治方法。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

一株具有抑菌活性的細菌，其特征在于該細菌菌株為菌株SN84（Xenorhabdus budapestensis），該菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctcc M2015214。

一種具有抑菌活性的細菌的代謝物，其特征在于該代謝物是由菌株SN84經(jīng)液體發(fā)酵制備的所得。

上述具有抑菌活性的細菌的代謝物，其特征在于代謝物制備過程如下：先于NBTA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天；然后將SN84的單個菌落接種到試管LB培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm搖床中培養(yǎng)24 h，獲得試管種；再將試管種以9%的接菌量接種到液體A培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm搖床中培養(yǎng)72 h；將發(fā)酵液在12000 rpm，4℃的條件下離心10 min，最后用0.22μm的濾菌膜過濾即得。

上述具有抑菌活性的細菌的代謝物，其特征在于代謝物制備中采用的LB液體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨 10g/L、酵母提取物 5 g/L、NaCl 10 g/L，余下為蒸餾水，pH為7；A液體培養(yǎng)基配方為：葡萄糖 6.13 g/L、蛋白胨 21.29 g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L、（NH₄）₂SO₄ 2.46 g/L、KH₂PO₄ 0.86 g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1.45 g/L、Na₂SO₄ 1.72 g/L余下為蒸餾水，pH為7.2-7.4。

一種具有抑菌活性的細菌的代謝物的應(yīng)用，其特征在于，將發(fā)酵液分別按0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例加入PDA培養(yǎng)基中后接入番茄灰霉菌，抑制番茄灰霉菌的菌絲生長。

一種具有抑菌活性的細菌的代謝物的應(yīng)用，其特征在于，將發(fā)酵液分別按0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的比例加入V8培養(yǎng)基中后接入辣椒疫霉或大豆疫霉，抑制辣椒疫霉或大豆疫霉的菌絲生長。

一種具有抑菌活性的細菌的代謝物的應(yīng)用，其特征在于，將發(fā)酵液分別按0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例噴灑于番茄幼苗葉片上，防治番茄灰霉病。

本發(fā)明的積極效果：抑菌活性的致病桿菌SN84代謝產(chǎn)物可抑制番茄灰霉、辣椒疫霉和大豆疫霉的菌絲生長，通過向番茄幼苗噴灑的方式，提高幼苗的抗病性，從而保證作物產(chǎn)量。在平板中顯著抑制番茄灰霉、辣椒疫霉和大豆疫霉的菌絲生長；在盆栽試驗中抑制番茄灰霉病的發(fā)生，使作物健康生長。

S菌株Xenorhabdus sp. SN84，已于2015年4月9日保藏在中國武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctcc M2015214。

附圖說明

圖1是向馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中分別加入不同比例的發(fā)酵液制成含藥平板，在28℃的條件下培養(yǎng)7-10天后的抑菌效果。

圖2是向V8培養(yǎng)基中分別加入不同比例的發(fā)酵液制成含藥平板，在28℃的條件下培養(yǎng)7-10天后的抑菌效果。

圖3是向V8培養(yǎng)基中分別加入不同比例的發(fā)酵液制成含藥平板，在28℃的條件下培養(yǎng)7-10天后的抑菌效果。

圖4是發(fā)酵液稀釋2%，4%，6%，8%，10%后噴灑番茄植株葉面，24 h后接種病原菌，培養(yǎng)7-15天后的防治效果。

具體實施方式

首先對SN84菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，然后對發(fā)酵培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物進行抑菌活性試驗，確定其對番茄灰霉菌的作用。

實施例1：菌株SN84的培養(yǎng)

將保存的SN84菌株劃線于平板NBTA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為NBTA培養(yǎng)基，即牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、瓊脂15 g/L、NaCl 5 g/L、TTC 0.04 g/L、BTB 0.025 g/L、蒸餾水1 L,pH為7.2-7.4。28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。

實施例2：

將SN84的單個菌落接種到試管LB培養(yǎng)基中（每管裝5 mL），LB培養(yǎng)基配方：即胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、NaCl 10 g/L，蒸餾水1L，pH為7。28℃，180 rpm搖床中培養(yǎng)24 h，獲得試管種。

再將試管種接種到250 mL三角瓶（每瓶裝40 mL）液體A培養(yǎng)基中， A培養(yǎng)基配方：即葡萄糖 6.13 g/L、蛋白胨 21.29 g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L、（NH₄）₂SO₄ 2.46 g/L、KH₂PO₄0.86 g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1.45 g/L、Na₂SO₄ 1.72 g/L、蒸餾水1 L，pH為7.2-7.4。28℃，180 rpm搖床中培養(yǎng)72 h。

將發(fā)酵液在12000 rpm，4℃的條件下離心10 min，最后用0.22μm的濾菌膜過濾后配成不同的倍數(shù)進行抑菌藥效試驗。

實施例3：平板抑菌活性試驗（見圖1）

將發(fā)酵液分別以0%、2%、4%、6%、8%、10%的（mL/mL）比例加入40-45℃的PDA培養(yǎng)基中后定量加入到培養(yǎng)皿中，制成含藥平板（PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g；葡萄糖20 g；瓊脂17 g;蒸餾水1000 mL）。將培養(yǎng)7天的番茄灰霉菌塊倒扣于含藥平板中，培養(yǎng)條件為28℃。培養(yǎng)7-10天后測量菌落直徑，計算抑制率和EC₅₀。

（對照組菌落直徑-菌餅直徑）-（生長組菌落直徑-菌餅直徑）

抑制率（%）=--------------------------------------------------------×100%

（對照組菌落直徑-菌餅直徑）

菌落直徑為十字交叉法測量；EC₅₀使用EXCEL作圖獲得的公式計算得到。

從實驗結(jié)果可看出，隨著濃度的升高抑菌效果明顯增強，且經(jīng)過多次重復實驗，穩(wěn)定性良好。

實施例4：平板抑菌活性試驗（見圖2）

將發(fā)酵液分別以0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的（mL/mL）比例加入40-45℃的V8培養(yǎng)基中后定量加入到培養(yǎng)皿中，制成含藥平板（V8培養(yǎng)基配方：進口V8果汁163 mL；碳酸鈣1.63 g；瓊脂1.5 g/100 mL;蒸餾水1630 mL）。將培養(yǎng)7天的辣椒疫霉菌菌塊倒扣于含藥平板中，培養(yǎng)條件為28℃。培養(yǎng)7-10天后測量菌落直徑，計算抑制率和EC₅₀。

（對照組菌落直徑-菌餅直徑）-（生長組菌落直徑-菌餅直徑）

抑制率（%）=--------------------------------------------------------×100%

（對照組菌落直徑-菌餅直徑）

從實驗結(jié)果可看出，隨著濃度的升高抑菌效果明顯增強，且經(jīng)過多次重復實穩(wěn)定性良好。

實施例5：平板抑菌活性試驗（見圖3）

將發(fā)酵液分別以0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的（mL/mL）比例加入40-45℃的V8培養(yǎng)基中后定量加入到培養(yǎng)皿中，制成含藥平板（V8培養(yǎng)基配方：進口V8果汁163 mL；碳酸鈣1.63 g；瓊脂1.5 g/100 mL;蒸餾水1630 mL）。將培養(yǎng)7天的辣椒疫霉菌菌塊倒扣于含藥平板中，培養(yǎng)條件為28℃。培養(yǎng)7-10天后測量菌落直徑，計算抑制率和EC₅₀。

（對照組菌落直徑-菌餅直徑）-（生長組菌落直徑-菌餅直徑）

抑制率（%）=--------------------------------------------------------×100%

（對照組菌落直徑-菌餅直徑）

從實驗結(jié)果可看出，隨著濃度的升高抑菌效果明顯增強，且經(jīng)過多次重復實穩(wěn)定性良好。

實施例6：盆栽抑菌活性實驗（見圖4）

將發(fā)酵液分別以0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例噴灑于番茄幼苗葉片，24 h后接種培養(yǎng)7天的番茄灰霉菌，接種后的植物在溫室中保濕培養(yǎng)，10-12天后調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病程度。

從實驗結(jié)果可看出，隨著稀釋濃度的降低，發(fā)病程度明顯降低，且經(jīng)多次重復實驗，效果穩(wěn)定。